This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Construção do mutante Biblioteca <ol><li> Escolher as regiões a ser submetido à transição com a ajuda de algoritmos computacionais com base na estrutura de cristal ou homologia modelos disponíveis 18. <ol><li> Aqui, como alvo duas regiões de AAO de Pleurotus eryngii de mutagénese aleatória e recombinação (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), enquanto amplifica o restante do gene (844 pb) por PCR de alta fidelidade (Figura 1). Nota: Vários segmentos podem ser estudados por MORPHING de forma independente ou combinada 16. </li></ol></li><li> Ampliar as áreas visadas por PCR mutagênico. Criar áreas entre os segmentos (~ 50 pb cada) sobreposto por sobreposição de reacções de PCR das regiões definidas. <ol><li> Prepare PCR mutagénica de segmentos-alvo num volume final de 50 uL contendo uma cadeia molde de ADN (0,92 ng / uL), 90 nM de senso de oligo (RMLN para o segmento de MI e AAO-PA para o segmento M-II), 90 nM de uminiciador ntisense (AAO-92C para o segmento de MI e rMLC para segmento H-II), dNTPs 0,3 mM (0,075 mM de cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO), MgCl 1,5 mM, MnCl2 0,05 mM de 2 e 0,05 U / ul de polimerase de ADN de Taq. Sequências de iniciadores são detalhadas na Figura 1. </li><li> Usar o seguinte programa de PCR: 95 ° C durante 2 min (1 ciclo); 95 ° C durante 45 seg, 50 ° C durante 45 seg, 74 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 74 ° C durante 10 min (1 ciclo). </li></ol></li><li> Amplificar as regiões não-mutagénicos com ultra-alta polimerase fidelidade e incluem as áreas correspondentes que se sobrepõem os segmentos mutagénicos e / ou saliências vector linearizado. <ol><li> Prepare misturas reaccionais num volume final de 50 ul contendo: molde de ADN (de 0,2 ng / uL), 250 nM de oligo sentido HFF, 250 nM de oligo anti-sentido de HFR, dNTPs 0,8 mM (0,2 mM cada), 3% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO) e 0,02 U / ul de polimerase de ADN iproof. sequências de iniciadores são detalhados em &lt;strong&gt; Figura 1. </li><li> Usar o seguinte programa de PCR: 98 ° C durante 30 seg (1 ciclo); 98 ° C durante 10 seg, 55 ° C durante 25 seg, 72 ° C durante 45 segundos (28 ciclos); e 72 ° C durante 10 min (1 ciclo). Nota: Com condições descritas no 1.2 e 1.3 sobreposições de 43 bp (região plasmídeo-M1); 46 bp (região de região-HF M1); 47 pb (região-M2 região HF) e 61 pb (M2 região plasmídeo) são concebidos (Figura 1) para favorecer no splicing in vivo em leveduras. </li><li> Purifica-se todos os fragmentos de PCR (mutagénicos e não mutagénicos) com um kit de extracção de gel comercial de acordo com o protocolo do fabricante. </li></ol></li><li> Linearizar o vector de modo a que as regiões de cerca de 50 pb que flanqueia são criados que são homólogas às 5&#39;- e 3&#39;- extremidades do gene alvo. <ol><li> Prepara-se uma mistura de reacção contendo linearização 2 ug de ADN, 7,5 U de BamHI, 7,5 L Xho I, 20 ug de BSA e 2 ul de tampão Bam HI 10x num volume final de 20 ul. </li><li> Incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h e 40 min. Posteriormente, proceder a inactivação a 80 ° C durante 20 min. </li></ol></li><li> Purifica-se o vector linearizado por extracção em gel de agarose a fim de evitar a contaminação com o plasmídeo circular residual (Figura 2). <ol><li> Carregar a mistura reaccional para a digestão mega-poço de um baixo ponto de fusão do gel de agarose semi-preparativa (0,75%, w: v), bem como uma alíquota (5 pi) da mistura de reacção na adjacentes bem como um repórter. </li><li> eletroforese Run DNA (5 V / cm entre os eletrodos, 4 ᵒC) e separar o gel de agarose correspondente ao mega-bem e armazená-lo em 4 ᵒC em 1x TAE. </li><li> Manchar a faixa com a escada de peso molecular e o repórter. Visualizar as bandas sob a luz UV. Nick a posição onde os linearizadas lugares vetor. Observação: Como a qualidade do vector linearizado purificado é um critifator de cal para a recombinação de sucesso e montagem em levedura, evitar manchas gel para eletroforese de DNA semi-preparativa. O uso de corantes e exposição aos raios UV para a extração de gel pode afectar a estabilidade do vector de ADN, comprometer a eficiência de recombinação in vivo. Como alternativa aos corantes EtBr tóxicos, Gel corantes SYBR vermelha e são comumente usados ​​para a coloração do gel. </li><li> Na ausência de luz UV, identificar o vector linearizado no fragmento mega poço utilizando a orientação dos entalhes na pista repórter coradas de modo que ele pode ser isolado. </li><li> Extrair o vector linearizado a partir de agarose e purificá-lo com um gel extraction kit comercial de acordo com o protocolo do fabricante. Nota: O uso de altas cópia vectores vaivém epissomal com marcadores de antibióticos e de auxotrofia: Neste exemplo, aplicou-se o uracilo independente e resistência à ampicilina pJRoC30 vector, sob o controlo do promotor de levedura GAL1. </li></ol></li><li> Preparar um mi equimolarxture dos fragmentos de PCR e misturá-lo com o vector linearizado numa proporção de 2: 1, com não menos do que 100 ng do plasmídeo linearizado (teste diferentes rácios de biblioteca equimolar / vector aberto para conseguir bons rendimentos de transformação). <ol><li> Medir a absorvância dos fragmentos de PCR e o vector linearizado a 260 nm e 280 nm para determinar a concentração e pureza. </li></ol></li><li> Transformar células competentes de levedura com a mistura de ADN utilizando um kit de transformação de levedura comercial (ver Tabela para o abastecimento) de acordo com as instruções do fabricante. <ol><li> Aqui, use uma protease deficiente e URA3 - S. dependentes cerevisiae, BJ5465. Transformar as células com o vector parental circularizado como um padrão interno durante o rastreio (ver abaixo). Além disso, o fundo vá transformando o vector linearizado na ausência de fragmentos de PCR. Nota: Em caso de detecção de níveis iniciais de secreção baixos, use S.cerevisiae protease estirpes deficientes como BJ5465 para promover o acúmulo de proteína ativa em sobrenadantes de cultura. Se a enzima alvo é submetido a hiperglicosilação, a utilização de estirpes de glicosilação-deficiente (por exemplo, Δ Kre2 que só é capaz de prender pequenas oligómeros de manose) poderia ser uma opção adequada. </li></ol></li><li> Placa as células transformadas em SC placas de abandono e incubar-los a 30 ° C durante três dias. Plate (em SC drop-out placas suplementadas com uracil) URA3 - S. cerevisiae células com falta do plasmídeo como um controlo negativo para o rastreio (ver abaixo). </li></ol> 2. Alto Throughput Screening Assay (Figura 3) <ol><li> Encher um número apropriado de placas de 96 poços estéreis (23 placas para analisar uma biblioteca de 2.000 clones) com 50 ul de meio mínimo por cavidade com a ajuda de um robot de pipetagem. </li><li> Escolha das colónias individuais a partir do SC-gota a placas e transferi-los para as placas de 96 poços. <ol><li> Em cada prato, inocular número da coluna 6 com o tipo parental como padrão interno e bem H1 com URA3 - S. cerevisiae (células em meio SC suplementado com uracilo) sem plasmídeo como um controlo negativo. Nota: Bem H1 é preenchido especificamente com os meios de abandono suplementadas com uracil. Um meio contendo bem em branco sem células também pode ser preparado como um controle adicional esterilidade. </li></ol></li><li> Cubra as placas com suas tampas e envolvê-los em Parafilm. Incubar as placas durante 48 h a 30 ° C, 225 rpm e 80% de humidade relativa num agitador húmido. </li><li> Remover o Parafilm, adicionar 160 uL de meio de expressão para cada cavidade com a ajuda do robot de pipetagem, voltar a selar as placas e incubar durante mais 24 h. Nota: Minimal médio e médio expressão são preparados como relatado em outros 19. níveis de secreção podem variar em função do gene em estudo e, consequentemente, tele incubação vezes tem de ser optimizada em cada caso, para sincronizar o crescimento celular em todas as cavidades. </li><li> Centrifugar as placas (placas mestres) a 2800 x g durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Transferir 20 uL do sobrenadante dos poços na placa mestra para a placa réplica, utilizando um líquido de manuseamento de múltiplas robótico. Nota: Para favorecer a secreção de enzima é aconselhável substituir o péptido de sinal nativa da proteína alvo por péptidos de sinal vulgarmente utilizados para expressão heteróloga em levedura (por exemplo, o factor de prepro-α líder, o líder do K 1 da toxina assassina de S. cerevisiae, ou mesmo versões quiméricas de ambos os péptidos 13). Alternativamente, o péptido sinal nativo pode ser evoluído exclusivamente para a secreção em levedura. </li><li> Adicionar 20 ul de p -methoxybenzylalcohol 2 mM em 100 mM de tampão fosfato de sódio pH 6,0, com a ajuda do robot de pipetagem. Agitar as placas brevemente com uma de 96 nósLL misturador de placas e incubar durante 30 min à TA. </li><li> Com o robot de pipetagem, adicionar 160 ul do reagente FOX para cada placa de réplica e agita-se brevemente com o misturador (concentração final de mistura FOX no poço: 100 uM de xilenol laranja, 250 ^ M de Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 e mm H 25 2 SO 4). <ol><li> Adicionar vários aditivos para o reagente para aumentar a sensibilidade, tais como co-solventes orgânicos (DMSO, etanol, metanol) ou sorbitol 17. Aqui, amplificar a resposta por adição de sorbitol a uma concentração final de 100 mM (figura 4). </li></ol></li><li> Ler as placas (modo de ponto final, t 0) a 560 nm num leitor de placas. </li><li> Incubar as placas à temperatura ambiente até a cor se desenvolve e medir novamente a absorção (T 1). <ol><li> Calcula-se a actividade relativa da diferença entre o valor Abs após a incubação e a da medição inicial normalizada com base na pareTipo ntal para cada placa (Dt 1 - t 0). </li></ol></li><li> Sujeitar os melhores hits mutantes para dois re-exames consecutivos para excluir falsos positivos. Nota: Tipicamente, re-rastreios incluem isolamento de plasmídeos a partir de levedura, amplificação e purificação em Escherichia coli, seguido de transformação de células de levedura fresca com o plasmídeo 19. Cada clone seleccionado é re-exibido em pentaplicate. </li></ol>

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	<li>J&#228;ckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts+by+evolution.">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li><li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis.">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li><li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+enzyme+universe:+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution.">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li><li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+past,+present+and+future.">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li><li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution.">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li><li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+selection+of+the+host+organism.">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).</li><li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering:+lessons+from+synthetic+biology.">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution:+an+efficient+tool+to+improve+enzymes.">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension.">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li><li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li><li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination.">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li><li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+assembler,+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways.">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium.">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li><li>Garcia-Ruiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+ligninolytic+oxidoreductases:+from+functional+expression+to+stabilization+and+beyond.">Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond.</a> Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).</li><li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aryl-alcohol+oxidase:+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation.">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+(MORPHING)+for+directed+enzyme+evolution.">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919 (2014).</li><li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells.">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li><li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+for+designing+smart+libraries.">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li><li>Vi&#241;a-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides.">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex.">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology:+Past,+present,+and+future.">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pocket+manual+of+directed+evolution:+Tips+and+tricks.">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .</li><li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies.">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Neste artigo, nós resumimos a maioria das dicas e truques empregados no nosso laboratório para projetar enzimas por evolução dirigida em S. cerevisiae (AAO utilizando como exemplo) de modo que eles podem ser adaptados para utilização com muitos outros sistemas enzima eucariótica, simplesmente seguindo a abordagem comum descrito aqui. Em termos de criação de biblioteca, Metamorfose é um método one-pot rápido para introduzir e recombinar mutações aleatórias em trechos d...

Evolução molecular dirigida é um método robusto, rápido e fiável para conceber enzimas 1, 2. Através de ciclos iterativos de aleatória mutação, recombinação e selecção, versões melhoradas das enzimas pode ser gerado que actuam sobre novos substratos, em novas reacções, em não-naturais ambientes, ou até mesmo para ajudar a célula de atingir novos objectivos metabólicas 3-5. Entre os anfitriões utilizados na evolução dirigida, levedura Saccharomyces cerevisiae da cervejaria oferece um repertório de soluções para a expressão funcional de proteínas eucarióticas complexas que não estejam disponíveis em vias procariotas 6,7. Utilizado exaustivamente em estudos de biologia celular, este pequeno modelo eucariótico tem muitas vantagens em termos de modificações pós-traducionais, a facilidade de manipulação e transformação eficiência, todos os quais são características importantes de engenheiro enzimas por evolução dirigida 8. Por outro lado, a alta frequênciarecombinação homóloga de ADN em S. cerevisiae acoplado ao seu aparelho à prova de leitura eficiente abre um vasto leque de possibilidades para a criação de biblioteca e montagem de gene in vivo, promovendo a evolução de diferentes sistemas de enzimas individuais para vias artificiais complexos 9-12. Nosso laboratório passou a última década projetando ferramentas e estratégias para a evolução molecular de diferentes ligninases em levedura (Oxirredutases envolvidas na degradação da lignina durante o decaimento de madeira natural) 13-14. Nesta comunicação, nós apresentamos um protocolo detalhado para preparar e bibliotecas mutantes tela em S. cerevisiae para um modelo flavooxidase, -aril-oxidase de álcool (AAO 15) -, que podem ser facilmente convertidos para muitas outras enzimas. O protocolo envolve um método evolução focada-dirigida (MORPHING: Processo mutagênicos Organizado recombinação homóloga in vivo pelo Agrupamento) assistida pelo aparelho celular de levedura 16, umda ensaio de rastreio muito sensível com base na reacção de Fenton, a fim de detectar a actividade AAO secretado para o caldo de cultura 17.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&amp;ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&amp;ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&amp;ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&amp;ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&amp;ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. PCR Reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&amp;ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>For error prone PCR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Plasmid linearization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>For staining DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. FOX assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&amp;ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&amp;ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard curve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&amp;ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Agarose gel stuff&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&amp;ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analysis dye</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting temperature agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&amp;ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Kits and cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&amp;alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extraction</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmid extraction from yeast</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. Plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr><tr><td>96-well plate lid</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr></tbody></table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

Evolução dirigida em Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens atraentes no projecto enzimas para aplicações biotecnológicas, um processo que envolve a construção, clonagem e expressão de bibliotecas de mutantes, acoplada a alta frequência de recombinação homóloga de ADN in vivo. Aqui, apresentamos um protocolo para criar e bibliotecas mutantes tela em leveduras com base no exemplo de um fúngica oxidase aril-álcool (AAO) para melhorar a sua actividade total. Dois segmentos de proteína foram sujeitos a evolução focalizado dirigido por mutagénese aleatória de ADN e na recombinação in vivo. Saliências de ~ 50 pb que flanqueia cada segmento permitiu a remontagem correcta do gene AAO-fusão num vector linearizado dando origem a um total de plasmídeo de replicação autónoma. Bibliotecas mutantes enriquecidos com variantes funcionais da AAO foram rastreados em S. cerevisiae sobrenadantes com um ensaio de elevado débito sensível com base na reacção de Fenton. O processo geral dea construção da biblioteca em S. cerevisiae aqui descrito pode ser facilmente aplicado a evoluir muitos outros genes eucarióticos, evitando reacções adicionais de PCR in vitro de recombinação de DNA e ligação etapas.

AAO de P. eryngii é um flavooxidase extracelular que abastece as peroxidases fúngicas com H 2 O 2 para começar a atacar a lignina. Dois segmentos de AAO foram submetidos a evolução focada-dirigido por MORPHING, a fim de melhorar a sua actividade e a sua expressão em S. cerevisiae 19. Independentemente das enzimas estrangeiras abrigadas por S. cerevisiae, o problema mais crítico, quando a construção de bibliotecas de mut...

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Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Dirigido Método Evolução<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Biblioteca Criação e Triagem

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K visualizações.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

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Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Genética

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Uma tela de supressor de Deep-sequenciamento-assistida, espontânea na fissão levedura Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagênese e Funcional Protocolos de Seleção para a Evolução Dirigida de proteínas em E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biologia

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Alto rendimento Yeast Tela superexpressão Plasmid

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Otimizando as funções das proteínas por meio de técnicas de exibição de superfície de levedura

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Bioengenharia

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Dirigido Método Evolução

Resumo

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Gene-alvo Mutagenesis aleatório para selecionar heterocromatina-desestabilizando Proteassoma mutantes no fermento de fissão

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Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

Engenharia de proteínas por exibição de superfície de levedura

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Identificação rápida de químicos Genéticos Interações em