This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. Mutant Kütüphanesi İnşaatı <ol><li> Seçim bölgeler, mevcut kristal yapı ya da homoloji model 18 göre bilgisayar algoritmaları yardımıyla geçişin maruz bırakılması. <ol><li> Burada, rastgele mutagenez ve rekombinasyon (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), yüksek sadakat PCR ile gen (844 bp) geri kalan yükseltme sırasında (Şekil 1) için Pleurotus eryngii gelen AAO iki bölgesini hedef. Not: Birkaç segmentler bağımsız veya kombine şekilde 16 geçişin ele alınabilir. </li></ol></li><li> mutajenik PCR ile hedeflenen bölgelere yükseltin. tanımlı bölgelerin PCR reaksiyonları atma kesimleri arasında alanları (~ 50 bp her) üst üste oluşturun. <ol><li> DNA şablonu ihtiva eden 50 ul (0.92 ng / | il), 90 nM oligo sens (kademeli bir MI ve kademeli bir M-II AAO-BP RMLN) içindeki bir nihai hacimde segmentler mutajenik PCR Hazırlama 90 nmntisense primeri (kademeli bir M-II için kademeli bir MI ve RMLC için AAO-92C), 0.3 mM dNTP (0.075 mM),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO), 1.5 mM MgCl2, 0.05 mM MnCl2 ve 0.05 U / ul Taq DNA polimerazı. Primerler dizileri Şekil 1&#39;de ayrıntılı olarak verilmiştir. </li><li> Aşağıdaki PCR programı kullanarak: 2 dakika boyunca (1 döngü) 95 ° C; 45 saniye, 45 saniye, 50 ° C, 45 sn için 74 ° C (28 döngü) 95 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 74 ° C. </li></ol></li><li> ultra-yüksek sadakat polimeraz olmayan mutajenik bölgeleri yükseltmek ve mutajenik segmentleri ve / veya doğrusallaştırılmış vektör çıkıntılar üst üste gelen alanları bulunmaktadır. <ol><li> ihtiva eden 50 ul&#39;lik bir son hacim içinde, reaksiyon karışımları hazırlayın: DNA numunesi (0.2 ng / | il), 250 nM oligo sens HFF, 250 nM oligo antisens HFR, 0.8 mM dNTP (0.2 mM her biri),% 3 (h / h) dimetilsülfoksit (DMSO) ve DNA polimerazı iproof 0.02 U / ul. Astarlar dizileri ayrıntılı olarak &lt;strong&gt; Şekil 1. </li><li> Aşağıdaki PCR programı kullanın: 30 sn (1 döngü) için 98 ° C; 10 saniye, 25 saniye boyunca 55 ° C, 45 saniye için 72 ° C (28 döngü) 98 ° C; 10 dakika boyunca (1 döngü) 72 ° C. Not: 1.2 açıklanan koşullara ve 43 bp (plazmid-M1 bölge) 1.3 örtüştüğü ile; 46 bp (M1 bölge HF bölge); 47 bp (HF bölge M2 bölge) ve 61 bp (M2 Bölge- plazmid) maya in vivo ekleme de lehine (Şekil 1) tasarlanmıştır. </li><li> imalatçının protokolüne göre, ticari bir jel özütleme kiti (mutajenik ve mutajenik) bütün PCR fragmanları arındırın. </li></ol></li><li> Yaklaşık 50 bp&#39;lik komşu bölgeleri hedef genin 5&#39;- ve 3&#39;-ucuna homolog olan oluşturulur, öyle ki vektör linearize. <ol><li> 2 ug DNA, 7.5 U Bam HI, 7.5 U Xho I, Tampon Ba 20 ug BSA ve 2 ul içeren bir doğrusallaştırma reaksiyon karışımı hazırlayın20 ul nihai hacim içinde m HI 10x. </li><li> 2 saat ve 40 dakika boyunca 37 ° C&#39;de reaksiyon karışımı inkübe edin. Daha sonra, 20 dakika boyunca 80 ° C &#39;de inaktivasyonu devam edin. </li></ol></li><li> Kalan dairesel plazmid (Şekil 2) ile kirlenmesini önlemek için agaroz jel ekstraksiyon tarafından lineerleştirilebilir vektörü arındırın. <ol><li> de bir muhabir bitişik reaksiyon karışımı ayrıca bir alikosu (5 ul) (v, w% 0.75), bir yarı-preparatif düşük erime noktalı agaroz jel mega kuyuya sindirim Reaksiyon karışımı yükleyin. </li><li> Run DNA elektroforezi (elektrotlar arasında 5 V / cm, 4 ᵒC) ve mega-kuyuya gelen agaroz jel ayırmak ve 1x TAE 4 ᵒC sıcaklıkta saklayın. </li><li> molekül ağırlığı merdiven ve raportör ile sokağın Leke. UV ışık altında bantları gözünüzde canlandırın. Nick pozisyon Lineerleştirilmiş vektör yerleştirir. Not: saflaştırılmıştır lineer vektör kalitesi great.Thanks olduğucal faktör maya başarılı rekombinasyon ve montaj, yarı hazırlayıcı DNA elektroforezi için jel boyama kaçının. Boyalar ve jel ekstraksiyonu için, UV&#39;ye maruz kalmadan kullanılması, in vivo rekombinasyon verimliliği ödün, DNA vektörünün stabilitesini etkileyebilir. Toksik EtBr boyalar alternatif olarak, jel Kırmızı ve SYBR boyalar genel olarak jel boyama için kullanılır. </li><li> UV ışık yokluğunda, bu izole edilebilir ve böylece lekeli raportör şeritte sıyrık yol göstericiliği kullanılarak Mega oyuklu fragmanında lineer vektör tanımlar. </li><li> agarozdan lineer vektör çıkarın ve üreticinin protokolüne uygun olarak, ticari bir jel özütleme kiti ile saflaştırılması. Not: antibiyotik ve oksotrofi işaretleri kullanan yüksek kopya epizomal mekik vektörleri: Bu maya GAL1 promoterinin kontrolü altında, urasil bağımsız ve ampisilin dirençli pJRoC30 vektör kullanılabilir Bu örnekte. </li></ol></li><li> eşmolar MI hazırlanmasıPCR parçalarının soğutun ve 2 de lineer vektör ile karıştırarak: doğrusallaştırılmış plazmidin en az 100 ng, 1 oranında (eşmolar kütüphanesi açık / vektör test farklı oranlarda iyi bir dönüşüm verimi elde etmek için). <ol><li> konsantrasyon ve saflığı belirlemek için PCR parçaları ve 260 nm ve 280 nm &#39;de lineer vektör absorbansı ölçülür. </li></ol></li><li> Bir ticari maya dönüştürme kiti kullanılarak DNA karışımı maya yetkin hücrelerini dönüştürmek, üreticinin talimatlarına uygun olarak (malzeme Tablo). <ol><li> Bağımlı S. - Burada bir yoksun proteaz ve URA3 kullanın cerevisiae suşu, BJ5465. (Aşağıya bakınız), tarama sırasında bir iç standart olarak ebeveyn daireselleşmiş vektörle hücrelerini dönüştürmek. Buna ek olarak, PCR parçalarının yokluğunda lineer vektör dönüştürerek arka plan kontrol edin. Not: ilk düşük salgılanmasını tespit durumunda, faydalanmaBJ5465 gibi cerevisiae proteaz eksikliği olan suşlarıdır kültür yüzey aktif protein birikimi geliştirmek için. Hedef enzimin hiperglikosilasyon glikosilasyon eksikliği cinslerinin kullanımını maruz (örneğin, sadece daha küçük manoz oligomerleri bağlama kapasitesine sahip Δ kre2), uygun bir seçenek olabilir. </li></ol></li><li> Plaka dönüştürdü SC bırakma plakalar üzerinde hücre ve üç gün boyunca 30 ° C&#39;de inkübe. Plakası (urasil ile desteklenmiş SC bırakma tabakalarına) URA3 - S. taranması için bir negatif kontrol olarak plazmid eksik S. cerevisiae hücreleri (aşağıya bakınız). </li></ol> Testi Tarama 2. Yüksek Verimli (Şekil 3) <ol><li> bir pipetleme robotu yardımıyla göz başına 50 | il minimum ortam maddesi ile (2.000 klon kütüphanesinin analiz 23 levha) steril 96 oyuklu plakalar bir uygun sayıda doldurun. </li><li> plakalar dışında SC-açılan bireysel koloniler seçin ve 96-kuyucuğu aktarabilirsiniz. <ol><li> Her plaka olarak, ebeveyn bir iç standart olarak tip ve iyi URA3 ile H1 ile sütun numarasını 6 aşılamak - S. Bir negatif kontrol olarak hiçbir plasmid ile (urasil ile takviye SC ortamı içinde) cerevisiae hücreleri. Not: Kuyu H1 urasil ile desteklenmiş bırakma medya ile özel olarak doldurulur. hücre içermeyen boş bir de ihtiva eden ortam ayrıca bir sterilite kontrolü olarak hazırlanabilir. </li></ol></li><li> onların kapaklı tabak kapatın ve Parafilm onları sarın. Nemli bir çalkalayıcıda, 30 ° C&#39;de 48 saat, 225 rpm ve 80% bağıl nem için inkübe edin. </li><li> Parafilm kaldır pipetleme robotu yardımıyla her bir oyuğa sentezleme ortamı 160 ul, plakalar yeniden kapatın ve 24 saat daha inkübe. Not: Başka bir yerde 19 bildirildiği gibi Minimal orta ve ifade ortamı hazırlanır. Salgılama seviyeleri t, ve buna bağlı olarak çalışma altında genin bağlı olarak değişebilirO zaman tüm oyuklara hücre büyümesini senkronize etmek için her bir durumda, optimize edilmelidir kuluçkalama. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 2,800 x g plakaları (ana plakalar). </li><li> Aktarım robot çok istasyonlu işleme bir sıvı kullanarak çoğaltma plakasına ana plakadaki kuyulardan süpernatan 20 ul. Not: enzim salgılanmasını desteklemek amacıyla yaygın maya heterolog ekspresyonu (kullanılan sinyal peptidleri hedef proteinin doğal sinyal peptidi yerine tavsiye edilir, örneğin, α faktörü prepro-lideri, S. K 1. Öldürücü toksini lideri cerevisiae veya her iki peptit 13) daha uyumlu versiyonlarıdır. Seçenek olarak ise, doğal sinyal peptid sadece maya içinde salgılanması için açığa çıkabilir. </li><li> Pipetleme robot yardımı ile 100 mM sodyum fosfat tampon maddesi, pH 6.0 içinde 2 mM p -methoxybenzylalcohol 20 ul ekle. 96-biz kısaca plakaları karıştırınve kap mikseri ll, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübe. </li><li> Pipetleme robot ile, her çoğaltma plakasına FOX reaktifi 160 ul ve de FOX karışımının karıştırıcı (nihai konsantrasyon kısaca karıştırılmıştır: 100 uM ksilenol turuncu, 250 uM Fe (NH4) 2 (SO4) 2 ve 25 mM H 2 SO 4). <ol><li> Bu tür organik yardımcı solventlerin (DMSO, etanol, metanol) veya sorbitol 17 olarak duyarlılığını artırmak için bir reaktif için çeşitli katkı maddeleri ekleyin. Burada, 100 mm (Şekil 4) bir son konsantrasyona kadar sorbitol eklenerek cevap yükseltmek. </li></ol></li><li> Bir plaka okuyucusu üzerinde 560 nm&#39;de plakaları (uç noktası modu, t = 0) okuyun. </li><li> Renk gelişene kadar oda sıcaklığında inkübe ve tekrar (t 1) emilimini ölçmek. <ol><li> kuluçkadan sonra Abs değeri arasındaki farktan göreceli aktivitesini hesaplamak ve ilk ölçüm o pare normalizeHer bir plaka için ntal tipi (¨t 1 - t = 0). </li></ol></li><li> yanlış pozitif ekarte etmek iki ardışık yeniden gösterimleri için en iyi mutant hit Konu. Not: Genellikle, yeniden gösterimleri plazmid 19 yaş maya hücrelerinin dönüşümü, ardından, Escherichia coli içinde maya, amplifikasyon ve arıtma için plazmid izolasyon bulunmaktadır. Seçilen her bir klon pentaplicate yeniden elenir. </li></ol>

<ol>
	<li>J&#228;ckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts+by+evolution.">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li><li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis.">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li><li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+enzyme+universe:+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution.">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li><li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+past,+present+and+future.">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li><li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution.">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li><li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+selection+of+the+host+organism.">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).</li><li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering:+lessons+from+synthetic+biology.">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution:+an+efficient+tool+to+improve+enzymes.">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension.">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li><li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li><li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination.">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li><li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+assembler,+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways.">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium.">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li><li>Garcia-Ruiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+ligninolytic+oxidoreductases:+from+functional+expression+to+stabilization+and+beyond.">Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond.</a> Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).</li><li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aryl-alcohol+oxidase:+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation.">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+(MORPHING)+for+directed+enzyme+evolution.">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919 (2014).</li><li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells.">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li><li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+for+designing+smart+libraries.">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li><li>Vi&#241;a-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides.">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex.">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology:+Past,+present,+and+future.">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pocket+manual+of+directed+evolution:+Tips+and+tricks.">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .</li><li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies.">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu yazıda, ipuçlarını çoğu S. yönlendirilmiş evrim tarafından enzimleri mühendisi laboratuarımızda istihdam özetledik cerevisiae (örnek olarak AAO kullanarak) onlar sadece burada açıklanan ortak bir yaklaşım izlenerek diğer ökaryotik enzim sistemleri ile kullanım için adapte edilebilir, böylece. Kütüphane oluşturulması açısından, biçim vermek ve 16 değiştirilmemiş proteinin geri kalan bölgeleri, bırakarak küçük protein uzan?...

Yönetmen moleküler evrim enzimleri 1, 2 tasarlamak için bir, sağlam, hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Doğal olmayan olarak, yeni reaksiyonlarda, yeni yüzeylerde hareket rastgele mutasyon, rekombinasyon ve tarama, enzimlerin geliştirilmiş versiyonları oluşturulabilir yinelenen mermi ile ortamlarda, hatta yeni metabolik hedeflere 3-5 ulaşmak için hücreyi yardımcı olmak. Yönlendirilmiş evrim kullanılan bilgisayarlar arasında, bira mayası Saccharomyces cerevisiae prokaryotik meslektaşları 6,7 aksi bulunmayan karmaşık ökaryotik proteinlerin fonksiyonel ifade çözümler bir repertuar sunuyor. Hücre biyolojisi çalışmalarında etraflıca kullanılan bu küçük ökaryot modeli yönlendirilmiş evrim 8 tarafından enzimleri mühendisi önemli özellikleri bütün bunlar post-translasyonel modifikasyonlar, manipülasyon ve dönüşüm verimliliği kolaylığı açısından birçok avantajı vardır. Ayrıca, yüksek frekanslıS. homolog DNA rekombinasyon onun etkin proof-okuma aygıtı bağlanmış cerevisiae karmaşık yapay yolların 9-12 tek enzimlerin farklı sistemlerin evrimi teşvik, in vivo kütüphane oluşturma ve gen montaj olanakları geniş bir yelpazeye açar. Laboratuvarımız maya farklı linyinaz moleküler evrim (doğal ahşap çürüme sırasında lignin parçalanması ile ilgili oksiredüktazlan) 13-14 için araçlar ve stratejiler tasarlanması son on harcadı. Bu iletişimde, biz hazırlamak ve S. ekran mutant kütüphaneleri için ayrıntılı bir protokol mevcut Model flavooxidase, -aril alkol oksidazı cerevisiae (AAO 15) -, kolayca diğer enzimlere tercüme edilebilir. Maya hücre aparatı 16, bir yardım: (Homolog in vivo Gruplama tarafından mutajenik Organize Rekombinasyon Süreci Morphing) protokolü odaklanmış yönlendirilmiş evrim yöntemini içerirKültür suyu 17 salgılanan AAO aktivitesi tespit etmek için Fenton tepkimesi göre da çok hassas bir tarama deneyi.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;1. Culture media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>CAS N&amp;ordm; 69-52-3 M.W. 371.39</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Cloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>CAS N&amp;ordm; 56-75-7 M.W. 323.13</td></tr><tr><td>D-(+)-Galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>CAS N&amp;ordm; 59-23-4 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-99-7 M.W. 180.16</td></tr><tr><td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83400</td><td>CAS N&amp;ordm; 17629-30-0 M.W. 594.51</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Difco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td>CAS N&amp;ordm; 7778-77-0 M.W. 136.09</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>U1128</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td><td>Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1501</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;2. PCR Reactions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>Agilent genomics</td><td>200415-51</td><td>25 mM each</td></tr><tr><td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td><td>Bio-rad</td><td>172-5301</td><td></td></tr><tr><td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8054</td><td>CAS N&amp;ordm; 13446-34-9 M.W. 197.91</td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4545</td><td>For error prone PCR</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;3. Plasmid linearization&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BamHI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>New England Biolabs</td><td>B9001S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Not I restriction enzyme</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>For staining DNA</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;4. FOX assays&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3754</td><td>CAS N&amp;ordm; 7783-85-9 M.W. 392.14</td></tr><tr><td>Anysil Alcohol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W209902</td><td>CAS N&amp;ordm; 105-13-5 M.W. 138.16</td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td>CAS N&amp;ordm; 50-70-4 M.W. 182.17</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide 30%</td><td>Merck Millipore</td><td>1072090250</td><td>FOX standard curve</td></tr><tr><td>Xylenol Orange disodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>52097</td><td>CAS N&amp;ordm; 1611-35-4 M.W. 716.62</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;5. Agarose gel stuff&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Norgen</td><td>28035</td><td>CAS N&amp;ordm; 9012-36-6</td></tr><tr><td>Gel Red</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>DNA analysis dye</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNA M.W. standard</td></tr><tr><td>Loading Dye 6x</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Low-melting temperature agarose</td><td>Bio-rad</td><td>161-3112</td><td>CAS N&amp;ordm; 39346-81-1</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;6. Kits and cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae strain BJ5465</td><td>LGC Promochem</td><td>ATTC 208289</td><td>Protease deficient strain with genotype: MAT&amp;alpha; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td></tr><tr><td>E. coli XL2-Blue competent cells</td><td>Agilent genomics</td><td>200150</td><td>For plasmid purification and amplification</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,609,250</td><td>DNA gel extraction</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid Kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740,588,250</td><td>Column miniprep Kit</td></tr><tr><td>Yeast Transformation Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>YEAST1-1KT</td><td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td></tr><tr><td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td><td>Zymo research</td><td>D2001</td><td>Plasmid extraction from yeast</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;7. Plates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>Clear, non-sterile, polystyrene (for activity measurements)</td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655161</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr><tr><td>96-well plate lid</td><td>Greiner Bio-One</td><td>656171</td><td>Clear, sterile, polystyrene (for microfermentations)</td></tr></tbody></table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

In vivo yüksek frekans homolog DNA rekombinasyon bağlanmış inşaat, klonlama ve mutant kütüphanelerin ifadesini içeren bir süreç biyoteknolojik uygulamalar için enzimler tasarlarken Saccharomyces cerevisiae yönlendirilmiş evrim çok çekici avantajlar sunuyor. Burada, toplam etkinliğini arttırmak için bir mantar aril-alkol oksidaz (AAO) örneğine dayalı olarak maya ve ekran mutant kütüphaneleri oluşturmak için bir protokol mevcut. İki protein kesimleri rastgele mutagenezi ile ve in vivo DNA yeniden birleştirmesinden odaklı yönelik evrim tabi tutuldu. Her bir segment kuşatan 50 bp çıkıntıları tam kendiliğinden kopyalanan plazmidin sebebiyet veren bir doğrusallaştırılmış vektörde AAO-füzyon geninin, doğru yeniden birleştirme sağladı. Fonksiyonel AAO türevleri ile zenginleştirilmiş mutant kütüphaneler S. tarandı Fenton tepkimesi göre hassas bir yüksek verimli bir deney ile cerevisiae süpernatanlar. genel prosesS. kütüphane inşaat cerevisiae ilave PCR reaksiyonları, in vitro DNA rekombinasyon ve ligasyon adımlarından kaçınmak, burada açıklanan kolaylıkla diğer ökaryotik genlerin gelişmeye uygulanabilir.

P. AAO eryngii lignin saldıran başlamak için H 2 O 2 ile mantar peroksidazlar sağlayan bir hücre dışı flavooxidase olduğunu. AAO iki segment etkinliğini ve S ifadesini arttırmak için geçişin tarafından odaklanmakta-yönlendirilmiş evrim tabi tutuldu cerevisiae 19. S. tarafından barındırdığı yabancı enzimlerin bağımsız olarak cerevisiae, maya mutant kütüphaneler inşa fragman...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening at JoVE.com

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K Görüntüleme.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Video: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Genetik

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool commonly used in yeast studies. The expression of a number of neurodegenerative disease-associated proteins in yeast causes cytotoxicity and aggregate formation, recapitulating findings seen in patients with these disorders. Here, we describe a method for screening a yeast model of the Amyotrophic Lateral Sclerosis-associated protein FUS for modifiers of its toxicity. Instead of using transformation, this new screening platform relies on the mating of yeast to introduce an arrayed library of plasmids into the yeast model. The mating method has two clear advantages: first, it is highly efficient; second, the pre-transformed arrayed library of plasmids can be stored for long-term as a glycerol stock, and quickly applied to other screens without the labor-intensive step of transformation into the yeast model each time. We demonstrate how this method can successfully be used to screen for genes that modify the toxicity of FUS.

This article presents a mating-based method to facilitate overexpression screening in budding yeast using an arrayed plasmid library.

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely related biochemical pathways. Previous methods such as the Synthetic Genetic Array (SGA) analysis, and random mutagenesis techniques using ultraviolet (UV) or chemicals like ethyl methanesulfonate (EMS) or N-ethyl-N- nitrosourea (ENU), have been widely used but are often costly and laborious. Also, these mutagen-based screening methods are frequently associated with severe side effects on the organism, inducing multiple mutations that add to the complexity of isolating the suppressors. Here, we present a simple and effective protocol to identify suppressor mutations in mutants which confer a growth defect in Schizosaccharomyces pombe. The fitness of cells with a growth deficiency in standard rich liquid media or synthetic liquid media can be monitored for recovery using an automated 96-well plate reader over an extended period. Once a cell acquires a suppressor mutation in the culture, its descendants outcompete those of the parental cells. The recovered cells that have a competitive growth advantage over the parental cells can then be isolated and backcrossed with the parental cells. The suppressor mutations are then identified using whole-genome sequencing. Using this approach, we have successfully isolated multiple suppressors that alleviate the severe growth defects caused by loss of Elf1, an AAA+ family ATPase that is important in nuclear mRNA transport and maintenance of genomic stability. There are currently over 400 genes in S. pombe with mutants conferring a growth defect. As many of these genes are uncharacterized, we propose that our method will hasten the identification of novel functional interactions with this user-friendly, high-throughput approach.

A Deep-sequencing-assisted, Spontaneous Suppressor Screen in the Fission Yeast Schizosaccharomyces pombe

We present a simple suppressor screen protocol in fission yeast. This method is efficient, mutagen-free, and&#160; selective&#160; for&#160; mutations that&#160; often&#160; occur at&#160; &#160;a&#160; single&#160; genomic&#160; locus.&#160; The protocol is suitable for isolating suppressors that alleviate growth defects in liquid culture that are caused by a mutation or a drug.

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

A genetic screen for mutant alleles that suppress phenotypic defects caused by a mutation is a powerful approach to identify genes that belong to closely ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biyoloji

High-throughput Yeast Plasmid Overexpression Screen

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, including those with direct relevance to human disease. Because of its short generation time and well-characterized genome, a major experimental advantage of the yeast model system is the ability to perform genetic screens to identify genes and pathways that are involved in a given process. Over the last thirty years such genetic screens have been used to elucidate the cell cycle, secretory pathway, and many more highly conserved aspects of eukaryotic cell biology 1-5. In the last few years, several genomewide libraries of yeast strains and plasmids have been generated 6-10. These collections now allow for the systematic interrogation of gene function using gain- and loss-of-function approaches 11-16. Here we provide a detailed protocol for the use of a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot to perform a plasmid overexpression screen, using an arrayed library of 5,500 yeast plasmids. We have been using these screens to identify genetic modifiers of toxicity associated with the accumulation of aggregation-prone human neurodegenerative disease proteins. The methods presented here are readily adaptable to the study of other cellular phenotypes of interest.

Here we describe a plasmid overexpression screen in Saccharomyces cerevisiae, using an arrayed plasmid library and a high-throughput yeast transformation protocol with a liquid handling robot.

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

The budding yeast, Saccharomyces cerevisiae, is a powerful model system for defining fundamental mechanisms of many important cellular processes, ...

Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily. The tempo of these advances is accelerating, promising greater depth and breadth. In light of these extraordinary advances, the need for fast, parallel methods to define gene function becomes ever more important. Collections of genome-wide deletion mutants in yeasts and E. coli have served as workhorses for functional characterization of gene function, but this approach is not scalable, current gene-deletion approaches require each of the thousands of genes that comprise a genome to be deleted and verified. Only after this work is complete can we pursue high-throughput phenotyping. Over the past decade, our laboratory has refined a portfolio of competitive, miniaturized, high-throughput genome-wide assays that can be performed in parallel. This parallelization is possible because of the inclusion of DNA 'tags', or 'barcodes,' into each mutant, with the barcode serving as a proxy for the mutation and one can measure the barcode abundance to assess mutant fitness. In this study, we seek to fill the gap between DNA sequence and barcoded mutant collections. To accomplish this we introduce a combined transposon disruption-barcoding approach that opens up parallel barcode assays to newly sequenced, but poorly characterized microbes. To illustrate this approach we present a new Candida albicans barcoded disruption collection and describe how both microarray-based and next generation sequencing-based platforms can be used to collect 10,000 - 1,000,000 gene-gene and drug-gene interactions in a single experiment.

We have developed comprehensive, unbiased genome-wide screens to understand gene-drug and gene-environment interactions. Methods for screening these mutant collections are presented.

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

By virtue of advances in next generation sequencing technologies, we have access to new genome sequences almost daily.  The tempo of these advances is ...

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Görüntüleme Teknikleri ile Protein Fonksiyonlarının Optimize Edilmesi

Protein Engineering by Yeast Surface Display

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and versatile tools in the protein engineering field is yeast surface display, where a pool of randomized proteins is expressed on the surface of yeast. The linkage of phenotype (e.g., binding of the yeast-displayed protein to the antigen of interest) and genotype (the plasmid encoding for the protein variant) enables selection of this library for desired properties and subsequent sequencing of enriched variants. By combining magnetic bead selection with flow cytometric sorting, protein variants with enhanced binding to a target antigen can be selected and enriched. Notably, in addition to affinity maturation, binding to a target can also be achieved without any initial binding affinity. Here, we provide a step-by-step protocol that covers all essential parts of a yeast surface display selection campaign and gives examples of typical yeast surface display results. We demonstrate that yeast surface display is a broadly applicable and robust method that can be established in any molecular biology laboratory with access to flow cytometry.

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

This protocol describes the essential steps for conducting yeast surface display selection campaigns to enrich protein variants binding to an antigen of interest.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

Biyomühendislik

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Evrim Yöntemi yönettiği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Fisyon mayası Heterochromatin kararsız hale Proteasome mutantlar seçmek için rasgele Mutagenesis Gene hedefli

Maya Overexpression çiftleşme tabanlı Kütüphane tarama

Fisyon mayası Schizosaccharomyces pombe derin sıralama yoluyla, kendiliğinden bastırıcı ekran

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik