Name: peering at brain polysomes with atomic force microscopy
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

تمت الموافقة على الممارسات المستخدمة للحصول على الأنسجة الماوس عن طريق الهيئة لحماية الحيوانات (OPBA) من جامعة ترينتو (إيطاليا)، والبروتوكول رقم 04-2015، المرسوم وفقا art.31 التشريعي رقم 26/2014. تمت المحافظة على جميع الفئران في مرفق نموذج حي لمركز البيولوجيا التكاملية (CIBIO)، جامعة ترينتو بإيطاليا. تحذير: لتجنب أي تدهور الحمض النووي الريبي من العينات، وإعداد جميع المخازن باستخدام المياه المعالجة DEPC لتقليل التلوث ريبونوكلياز. 1. إعداد Polysomes من أدمغة كامل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع أنسجة المخ (15 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء من نوع السلالة البرية الماوس C57BL / 6 مع CO 2 اختناق لمدة 5 دقائق (36). بعناية تشريح الدماغ من الجمجمة من 36، ووضع الأنسجة في أنبوب 1.5 مل وعلى الفور وضعها في النيتروجين السائل. تخزين في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المحللة (30 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحق أنسجة المخ بأكملها باستخدامقذيفة هاون ومدقة تحت النيتروجين السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل مسحوق حوالي 25 ملغ إلى أنبوب microcentrifuge البارد وعلى الفور (لتجنب ذوبان النسيج المسحوق) إضافة 0.8 مل من الاحتياطي تحلل (انظر الجدول 1) وتعطيل الخلايا التي pipetting صعودا وهبوطا 25 مرات بسرعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير الحطام الخلوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديد والحفاظ على أنبوب على الجليد لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير نوى والميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين طاف في -80 درجة مئوية لمدة أقصاها 6 أشهر أو استخدامه على الفور. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرج السكروز والطرد المركزي (2 ساعة و 30 دقيقة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أنابيب نابذة فائقة السرعة على نطاق واسع مع ريبونوكلياز خالية من المياه (diethylpyrocarbonate المياه المعالجة (DEPC المياه) أو تجارية) لد 3٪ H 2 O 2 / DEPC H 2 O الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب على الجليد وإضافة 5.5 مل من البرد محلول السكروز 50٪ في الجزء السفلي من كل أنبوب (انظر الجدول رقم 1 لحلول السكروز). بعناية إضافة 15٪ السكروز قطرة قطرة الحل، والبقاء على مقربة من الطور البيني من أجل الحفاظ على البيني حاد، حتى يتم ملء الأنبوب تماما. عندما يتم ملء الأنبوب تماما، إغلاقه مع سدادة مطاطية لتجنب تشكيل فقاعة الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة باردة وضع بلطف أسفل الأنابيب أفقيا والحفاظ عليه في هذا المنصب لمدة 2 ساعة. بعد هذا الوقت، وتصويب ببطء الأنابيب مرة أخرى إلى الوضع الرأسي ووضعها على الجليد. التدرجات هي الآن جاهزة للاستخدام. بدلا من ذلك، وإعداد التدرج السكروز 15-50٪ باستخدام التدرج التقليدي السابق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في غرفة باردة إزالة بعناية 1.0 مل من أعلى التدرج وتراكب قطرة قطرة السكروز مع المحللة عصاري خلوي (أي طاف الحصول عليها في الظريفص 1،2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض بعناية الأنابيب في دلاء من الدوار الدلو المتأرجح. أجهزة الطرد المركزي التدرجات لمدة 100 دقيقة في 180000 x ج في 4 درجات مئوية باستخدام نابذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، وترك الأنابيب في الدلاء لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية للسماح للالتدرجات استقرار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجزئة التدرج السكروز (2 ساعة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية أنبوب نابذة واحد من الدوار نابذة وتركيبها على الجهاز جامع من التدرج الكثافة نظام التقطير. جمع 1 مل كسور مراقبة الامتصاصية في 260 نانومتر مع الأشعة فوق البنفسجية / VIS مجسات (انظر الشكل 1 لوحة العليا). الحفاظ الكسور التي تم جمعها على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد aliquots من 30-40 ميكرولتر من الكسور من الفائدة، والاحتفاظ بها على الجليد قبل تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. لا تستخدم قسامات أو كسور السكروز الذي خضع لأكثر من دورتين تجميد لاذابة (انظر الشكل 1 أقل لوحة). </li></ol> &lt;/ لى&gt; </ol> 2. إعداد نموذج لمجهر القوة الذرية (3 ساعات) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الشريط، تقشر ورقة الميكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل أوراق الميكا 3-4 مرات مع DEPC المياه ووضعه في طبق بتري صغيرة. ثم يجف السطح باستخدام الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الميكا مع 200 ميكرولتر من 1 ملم NISO 4 واحتضان لمدة 3 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة حل النيكل ثم يجف السطح باستخدام الهواء. تنفيذ جميع الخطوات المستقبلية في 4 درجات مئوية عن طريق وضع طبق بتري مع الميكا على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة التي تم الحصول عليها في 1.4.2 على الجليد وإضافة بلطف كل قطرة قطرة عينة على الميكا. باستخدام ميكرولتر طرف 100-200، وانتشار العينة على كامل سطح الميكا. احتضان العينة على الجليد لمدة 3 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية انخفاض رقة الميكا قطرة مع 200 ميكرولتر الباردة العازلة-AFM (انظر الجدول 1)، واحتضان لمدة 1 ساعة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير في السائل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية العازلة-AFM وتغسل الأوراق الميكا 3-4 مرةالصورة مع 200 ميكرولتر الباردة العازلة-AFM لإزالة السكروز الزائد. ثم تغسل الأوراق الميكا 3 مرات مع الحل غسل الباردة (انظر الجدول 1)، وترك على سطح الميكا من قبل بعض ميكرولتر من محلول المغطاة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الذهاب إلى نقطة 3 (الحصول على الصور). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير في الهواء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية العازلة-AFM وغسل الميكا 3-4 مرات مع 200 ميكرولتر الباردة العازلة-AFM لإزالة السكروز الزائد. ثم، وغسل الميكا 3 مرات مع الحل غسل الباردة (انظر الجدول 1)، واستنزاف المياه الزائدة باستخدام الورق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك العينة لتجف تحت غطاء الكيميائية مع الجزء العلوي من طبق بيتري مفتوحة جزئيا. بعد 2 ساعة، أغلق طبق بتري وتخزينها في RT. قياس العينة بعد 2-3 ساعة كما أنها مستقرة لسنوات. </li></ol></li></ol> 3. الحصول على الصور (15 دقيقة لكل صورة بعد الاستقرار الحراري) ملاحظة: Polysomes ثبتوا على الميكا يمكن تصوير في الهواء أو في السائل، وذلك باستخدام وضع AC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق الميكا لصاحب العينة باستخدام الشريط على الوجهين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج صاحب العينة في المرحلة التالية AFM توجيهات المصنع. عندما التصوير في السائل، إذا كان ذلك ممكنا، في محاولة للحفاظ على العينة في درجة حرارة أقل من 25 درجة مئوية إلى زيادة polysome الاستقرار في الوقت المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد ناتئ مناسبة للتصوير AC وتركيبها على حامل طرف التالية توجيهات المصنع. هنا، استخدام الكابولي مع قوة ثابتة بين 2-20 نيوتن / متر للتصوير الجوي ونحو 0.1 نيوتن / متر للتصوير السائل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط بقعة الليزر على ناتئ والصفر إشارات كاشف رباعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تردد القيادة المناسب ودفع ناتئ مع اتساع 10-20 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاقتراب من عينة حتى يمارس طرف السطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد منطقة المسح الضوئي من ميكرون 2X2، والحصول على ما لا يقل عن 512x512 بكسل الصور (عرض بكسل &lt;4 نانومتر)، حدد الحية وضع خلفية الطرح ونطاق Z من 20-25 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد رانه صورة تبحث عن وجود أجسام مستديرة تتميز ارتفاع ما بين 10 و 15 نانومتر عند الحصول في الهواء و 25 و 30 نانومتر عندما تكون في السائل وعرض في نطاق 25-30 نانومتر. ضبط المعلمات المضبوطة مسبقا وردود الفعل حتى يتم تصور الأشياء الحادة. يجب أن تظهر خلفية مسطحة نسبيا في عينات جيدة، مع بعض الكائنات ارتفاع 2-4 نانومتر (انظر الشكل 2A وباء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت الصورة تبدو جيدة (كما هو مبين في النقطة 3.8)، والحصول على عدة (عشرة على الأقل) بمسح 2X2 ميكرون في المناطق عينة مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (اختياري). إذا لزم الأمر، والحصول على صور عالية الدقة من polysomes مختارة (انظر الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق التصحيحات البرمجيات (الطرح الطائرة وخوارزميات تصحيح خط سطرا) لتصحيح الصور AFM إزالة الميل التعسفي والانجراف الآثار. </li></ol> 4. تحليل البيانات (30 دقيقة لكل صورة) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير الصور في ImageJ (اختياري: تطبيق عامل المقياس) preferentially باستخدام تنسيق الضياع، على سبيل المثال، تنسيق TIFF (انظر الشكل 3A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام يماغيج RiboPick.ijm مجموعة أدوات الماكرو (ليتم نسخها في دليل فرعي ماكرو / مجموعة أدوات يماغيج) لحساب الريبوسومات في polysomes (انظر الشكل 3B) وحساب الخصائص الإحصائية للعينة (انظر الشكل 3C). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء تحميل صورة باستخدام &lt;مقروءة صورة&gt; أداة تهيئة البرنامج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار مراكز الريبوسوم مع القياسية &lt;اختيار نقطة&gt; يماغيج أداة (التحول + فوق اليسار يسمح متعددة اختيار من الريبوسومات). بمناسبة الريبوسومات المحدد مع &lt;الريبوسومات الأقسام&gt; أداة. ستظهر الإحداثيات الريبوسوم في إطار نص مخصص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المزيد من الريبوسومات إلى نفس polysome تكرار الإجراء المشار إليها في النقطة 4.2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الريبوسومات ملحوظ خطأ باستخدام &lt;التراجع عن اختيار الماضي&gt; أداة (يبدأ إزالة من الريبوسوم وأضاف الماضي لأول واحد212؛ في polysome الحالي فقط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال polysome، استخدم &lt;polysome جديدة&gt; أداة. كما تم إضافة عدد polysome كغطاء لصورة، يتم تحديث نافذة النص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام &lt;حفظ النتائج وعلى مقربة&gt; لكتابة الريبوسوم تنسيق ملف (تستخدم وحدات الافتراضي للصورة) وصورة PNG تلخص الريبوسومات وpolysomes واختار. يتم إغلاق الصورة الأصلية دون حفظها. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells.">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li><li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+bacterial+growth:+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions.">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li><li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line.">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220 (2012).</li><li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning.">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome.">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li><li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA.">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li><li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes.">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).</li><li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast.">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li><li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm.">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li><li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli.">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li><li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis:+characterization+of+the+ergosome.">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li><li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes.">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li><li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences.">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li><li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+&#197;+resolution.">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 &#197; resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li><li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+&#197;+resolution.">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 &#197; resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li><li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+&#197;+resolution.">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 &#197; resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li><li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome.">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li><li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes.">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li><li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes.">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294 (2014).</li><li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly(A)-tail:+a+cryo+electron+tomography+study.">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li><li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation.">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li><li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes.">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li><li>Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells.">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li><li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy.">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li><li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading.">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li><li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy.">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li><li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging.">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li><li>Bernab&#242;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling.">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboAbacus:+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes.">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain.">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853 (2015).</li><li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

كما ثبت بنية الحمض النووي أن تكون ذات أهمية قصوى لوصف عملية النسخ وباعتبارها المنظمة من لونين تفاهمنا السيطرة النسخي التعبير الجيني، فمن الضروري تحليل تنظيم وهيكل polysomes لتحسين الفهم الصادق الترجمة وتنظيمها. مع بروتوكول وصفها، ف...

تخليق البروتين هو الأكثر عملية استهلاك الطاقة في الخلايا 1،2. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن الكميات المتوفرة من البروتين يتم التحكم بشكل رئيسي في متعدية بدلا من 3،4،5 مستوى النسخي. وpolysome هو العنصر الجزيئات الأساسي الذي يحول المعلومات مرنا في قراءات البروتينية وظيفية. وبالتالي الاعتراف Polysomes بقدر المجمعات الجزيئات حيث تلتقي عدة ضوابط متعدية 6-13. على الرغم من مئات من الدراسات حول بنية الريبوسوم 14- 16، ورؤى الجزيئية مفصلة في ديناميات الترجمة وطوبولوجيا polysomes واجه الفائدة محدودة. ونتيجة لذلك، وتنظيم الأصلي مجمع polysomal بروتين نووي ريبوزي وتأثيره المحتمل على الترجمة لا تزال القضايا غامضة نوعا ما. Polysomes قد يخفي ما زالت المنظمات أمر وظيفية غير معروفة، ويحتمل أن يعكس ما جسيم نووي وكنترول جينيةوقد مثلت ليرة سورية للمجال النسخ. في الواقع، والتحقيق في هذه الفرضية المثيرة يتطلب دراسات إضافية والنهج التقنية الجديدة. في هذا الخط، وتقنيات الهيكلية ومجهر القوة الذرية قد تعاون مثمر لكشف آليات جديدة للسيطرة على التعبير الجيني، على غرار ما تم تحقيقه لجسيم نووي 17،18. منذ اكتشاف الريبوسوم 14-16، اتسمت هيكلها على نطاق واسع في بدائيات النوى 19،20، الخميرة 21 ومؤخرا في 22 البشري، وتوفير وصف الجزيئي للآليات على قاعدة من تخليق البروتين. واعترف Polysomes في البداية على غشاء الشبكة الإندوبلازمية، وتشكيل منظمات الهندسية 2D النموذجية 14. كما ذكرت من قبل، لم يكن polysome الجمعية الكائن من الفائدة ثابتة كما بنية الريبوسوم. في الماضي، وقد تم دراسة polysomes أساسا عن طريق آرتقنيات ansmission EM المستندة. إلا في الآونة الأخيرة، مكنت تقنيات البرد EM إعادة الإعمار 3D من polysomes تنقيته من في المختبر أنظمة الترجمة 23-26، لست] الخلوية الإنسان 27 أو في خلايا 28. هذه التقنيات عرضت معلومات أكثر دقة حول تنظيم الريبوسوم الريبوسوم في polysomes 23، 26-28، ووصف الجزيئي الأولي من الأسطح الملامسة للريبوسوم المجاورة في polysomes جنين القمح 24. وهكذا، البرد EM التصوير المقطعي يسمح الكشف عن التفاعلات الريبوسوم الريبوسوم مع التفاصيل الجزيئية، ولكن مثقلة من قبل مرحلة ما بعد المعالجة واسعة النطاق وإعادة الإعمار ويحلل التي تتطلب موارد الحسابية الثقيلة من أجل معالجة البيانات. وعلاوة على ذلك، للحصول على التفاصيل الجزيئية من التفاعلات الريبوسوم الريبوسوم، مطلوب خريطة حل للغاية من الريبوسوم، وهذا النوع من الريبوسوم المرجعي هو متاح فقط لعدد قليل من الأنواع. الأهم من ذلك، البرد EM التصوير المقطعي ليست قادرة على الكشف عن الحمض النووي الريبي مجانا. Therefخام، يطلب من التقنيات الجديدة إلى فهم كامل للتنظيم آلية الترجمة. بجانب البرد EM، واستخدمت AFM أيضا أداة مفيدة للتصوير المباشر من polysomes في حقيقيات النوى أقل 29-33 والبشر (27). مقارنة EM، AFM لا يتطلب أي تثبيت عينة أو وضع العلامات. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء قياسات في الظروف الفسيولوجية القريب ومع إمكانية فريدة للتعرف بشكل واضح على حد سواء الريبوسومات وجدائل الحمض النووي الريبي المجردة 27. تصوير polysomes واحد لا يمكن أن يؤديها بسرعة نسبيا، والحصول على الآلاف من الصور في النانو قرار مع القليل من الجهد مرحلة ما بعد المعالجة بالمقارنة مع مرحلة ما بعد المعالجة واسعة النطاق والثقيلة وإعادة الإعمار التحليلات المطلوبة بواسطة المجهر البرد EM. ونتيجة لذلك، AFM معالجة البيانات وتحليلها ليست في حاجة محطات العمل باهظة الثمن وقوة الحوسبة عالية. على هذا النحو، فإن هذا الأسلوب يجمع معلومات عن الأشكال polysomal، والخصائص المورفولوجية (مثلارتفاع وطول وعرض)، كثافة الريبوسوم، وجود الحمض النووي الريبي الحرة وعدد من الريبوسومات في polysome 27 مع إنتاجية أعلى من البرد EM. في هذه الطريقة، AFM يمثل طريقة فعالة ومكملة لتقنيات EM لتصوير polysomes 27. هنا نقدم خط أنابيب الكامل من تنقية لتحليل البيانات حيث يتم تطبيق AFM إلى صورة وتحليل polysomes مخ الفأر. ويركز البروتوكول المقترح حول القضايا تنقية وعلى ترسب دقيقة من polysomes على ركائز الميكا التي تستخدم للتصوير فؤاد. بالإضافة إلى تحليل الجزيئات التقليدية التي يمكن القيام بها بسهولة مع برنامج مشترك يستخدمها المجتمع AFM، المساعد يماغيج 34، ودعا RiboPick، وقدم لحساب عدد من الريبوسومات في polysome 27، 35.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

آلية متعدية، أي polysome أو polyribosome، هي واحدة من أكبر وأعقد الأجهزة هيولي في الخلايا. Polysomes، التي شكلتها الريبوسومات، من mRNAs، عدة بروتينات والرنا غير الترميز، تمثل منصات حيث تأخذ الضوابط متعدية مكان متكاملة. ومع ذلك، في حين أن الريبوسوم وقد درس على نطاق واسع، وتنظيم polysomes لا تزال تفتقر إلى فهم شامل. وبالتالي مطلوب بذل الكثير من الجهد من أجل توضيح منظمة polysome وأي آلية جديدة للتحكم متعدية التي قد تكون جزءا لا يتجزأ. مجهر القوة الذرية (AFM) هو نوع من المجهر التحقيقي الذي يسمح اقتناء الصور 3D في قرار النانو. مقارنة مع المجهر الإلكتروني التقنيات (EM)، واحدة من المزايا الرئيسية لAFM هو أنه يمكن الحصول على الآلاف من الصور سواء في الهواء وفي حل، مما يتيح للعينة إلى الحفاظ عليها في ظل الظروف الفسيولوجية بالقرب من دون أي حاجة لتلطيخ وتحديد المواليةcedures. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة لتنقية دقيقة من polysomes من دماغ الفأر وترسبها على ركائز الميكا. يتيح هذا البروتوكول التصوير polysome في الهواء والسائل مع فؤاد وإعادة البناء ككائنات ثلاثية الأبعاد. مكملة لالمجهري البرد الإلكترون (البرد م)، والطريقة المقترحة يمكن استخدامها بسهولة لتحليل منهجي polysomes ودراسة منظمتهم.

السكروز التنميط التدرج polysomal من كله مخ الفأر فمن الممكن لتنقية polysomes من المحللة الخليوي عن التنميط polysomal، الذي يفصل بين الجزيئات وفقا للوزن والحجم. مع التنميط polysomal، لست] حشوية تم الحصو...

Watch this Scientific Journal Video about Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

يطل في الدماغ Polysomes مع مجهر القوة الذرية

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Video: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

التصور من الحمض النووي المؤتلف والمجمعات البروتين باستخدام الميكروسكوب القوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Bioengineering

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

القوة الذرية الميكروسكوب من الضوء الأحمر الخلايا المستقبلة عن طريق رسم الخرائط PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

Engineering

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochemistry

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

قياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية باستخدام المجهر القوة الذرية

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

نانومتر الفرعي التصوير القرار مع السعة التشكيل الذرية المجهري القوة في السائل

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

أتمتة قياسات المجهر القوة الحيوية الذرية على مئات من خلايا ألبيكانس C.

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Static Atomic Force Microscopy to Visualize and Characterize Assembled Nucleosomes

Source: Stormberg, T., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58820">Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging.</a> J. Vis. Exp.(2019)
In this video, we demonstrate static atomic force microscopy to visualize assembled nucleosomes. This high-resolution imaging technique allows the study of the nucleosome structure.

الفحص المجهري للقوة الذرية الساكنة لتصور وتوصيف النيوكليوسومات المجمعة

Source: Stormberg, T., et al. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp.(2019)
In this video, ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Microscopy Techniques

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

الفحص المجهري للقوة الذرية

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...