This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

הפרקטיקות על מנת לקבל את רקמות העכבר אושרו על ידי גוף להגנת בעלי חיים (OPBA) של אוניברסיטת טרנטו (איטליה), פרוטוקול לא. 04-2015, לפי art.31 צו המחוקק לא. 26/2014. כל העכברים היו מתוחזקים במתקן אורגניזם מודל של המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית (CIBIO), אוניברסיטת טרנטו, איטליה. זהירות: כדי למנוע את השפלה RNA של דגימות, להכין את כל מאגרי שימוש במים שטופלו DEPC למזעור זיהום RNase. 1. הכנת Polysomes ממוחו כל הפריטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף רקמות מוח (15 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים C57BL זן עכבר wild-type / 6 עם מחנק 2 CO 5 דקות 36. בזהירות לנתח את המוח החוצה מהגולגולת 36, למקם את הרקמה לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל ו למקם אותו בחנקן נוזלי. חנות ב -80 ° C עד השימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת lysate (30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכתוש את רקמת המוח כולו באמצעותובמכתש תחת חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר כ -25 מ&quot;ג אבקה לצינור microcentrifuge קר ומייד (כדי למנוע את הפשרת הרקמה המרסקת) להוסיף 0.8 מיליליטר של הצפת תמוגה (ראה טבלה 1) ולשבש את התא על ידי pipetting למעלה ולמטה 25 פעמים מהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 1 דקות ב 4 ° C עד גלולה פסולת הסלולר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את supernatant לצינור microcentrifuge חדש ולשמור את הצינור על קרח במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור ב XG 12,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C עד גלולת גרעינים ואת המיטוכונדריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס למשך תקופה מקסימלית של 6 חודשים או להשתמש בו באופן מיידי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שיפוע סוכרוז צנטריפוגה (2 שעה ו -30 דקות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ultracentrifuge לשטוף צינורות בהרחבה עם מי RNase ללא (מי מטופלי diethylpyrocarbonate (מי DEPC) או מסחריים)ד 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 5.5 מ&quot;ל של תמיסת סוכרוז קר 50% בחלק התחתון של צינור אחד (ראה לוח 1 עבור פתרונות סוכרוז). בזהירות להוסיף את ירידת תמיסת סוכרוז 15% אחר טיפה, נשאר קרוב שלבי ביניים כדי לשמור על שלבי חדה, עד הצינור הוא מלא לחלוטין. כאשר הצינור הוא מלא לחלוטין, לסגור אותו עם פקק גומי, כדי למנוע היווצרות בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר קר בעדינות להניח את הצינורות אופקיים ולשמור אותו בתנוחה זו למשך 2 שעות. לאחר פרק זמן זה, לאט ליישר את הצינורות בחזרה למצב אנכי ולשים אותם על הקרח. ההדרגתיים מוכנים כעת לשמש. לחלופין, להכין את שיפוע סוכרוז 15-50% באמצעות שיפוע קונבנציונאלי לשעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחדר קר להסיר בזהירות 1.0 מ&quot;ל מהחלק העליון של השיפוע ואת כיסוי הירידה סוכרוז אחר טיפה עם lysate cytosolic (כלומר, supernatant שהושגו STEp 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד בזהירות את הצינורות לתוך הדליים של הרוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה ההדרגתי עבור 100 דקות ב 180,000 XG ב 4 ° C באמצעות ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר צנטריפוגה, לעזוב את הצינורות בדליים שלהם במשך 20 דקות ב 4 ° C לתת לייצב ההדרגתי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלוקת שיפוע סוכרוז (2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות צינור ultracentrifuge אחד מן הרוטור ultracentrifuge ולעגן אותה במכשיר אספן של צפיפות מערכת חלוקה Gradient. אסוף 1 מיליליטר שברים ניטור את הספיגה ב 260 ננומטר עם גלאי UV / VIS (ראה איור 1 פנל עליון). שמור על השברים שנאספו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן aliquots של 30-40 μl של שברים של עניין, ולשמור אותם על הקרח לפני אחסונם ב -80 ° C עד השימוש. אין להשתמש aliquots או שברי סוכרוז כי עבר יותר משני מחזורי הקפאה-פשרה (ראה איור 1 פנל תחתון). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. הכנת המדגם עבור מיקרוסקופית כוח אטומי (3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קלטת, לקלף את הגיליונות יציצו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הגיליונות יציצו 3-4 פעמים עם מי DEPC ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי קטנה. לאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את מיקה עם 200 μl של 1 מ&quot;מ Niso 4 דגירה במשך 3 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון ניקל ולאחר מכן לייבש את פני השטח באמצעות אוויר. לבצע את המהלכים הבאים ב 4 ° C על ידי נחת צלחת פטרי עם תציץ על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot שהושגו 1.4.2 על קרח בעדינות להוסיף את כל טיפה מדגם אחר טיפה על מיקה. בעזרת קצה 100-200 μl, להפיץ את המדגם על פני השטח של מיקה. דגירה המדגם על קרח למשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הירידה יציץ גיליון אחר טיפה עם 200 μl קר הצפה-AFM (ראה טבלה 1) ו דגירה במשך שעה 1 על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה בנוזל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסירו בזהירות את ההצפה-AFM ו לכבס את הסדינים יציצו 3-4 זמןים עם 200 μl קר הצפה-AFM להסיר סוכרוז עודף. לאחר מכן לשטוף את הסדינים נציץ 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה מס &#39;1), בהשאירו את פני השטח נציץ סוקר בכמה מיקרוליטר של פתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לך להצביע 3 (תמונת רכישה). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה באוויר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את מאגר-AFM ולשטוף את מיקה 3-4 פעמים עם 200 μl קר הצפת-AFM להסיר את סוכרוז עודף. לאחר מכן, לשטוף את מיקה 3 פעמים עם פתרון כביסה קר (ראה טבלה 1) ומסננים את המים העודפים באמצעות נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו המדגם להתייבש מתחת למכסה המנוע כימי עם החלק העליון של צלחת פטרי פתוחה חלקית. לאחר 2 שעות, לסגור את צלחת פטרי ולאחסן ב RT. מדוד את המדגם לאחר 2-3 שעות כפי שהם יציבים במשך שנים. </li></ol></li></ol> 3. Image Acquisition (15 דקות לכל תמונה לאחר ייצוב תרמי) הערה: Polysomes משותקת על תציץ ניתן הדמיה באוויר או בנוזל, באמצעות מצב AC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את מיקה לבעל המדגם באמצעות קלטת דו צדדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את בעל מדגם בשלב AFM הבא להוראות היצרן. כאשר הדמיה בנוזל, במידת האפשר, מנסה לשמור על מדגם בטמפרטורה נמוכה מ -25 מעלות צלזיוס כדי להגביר את היציבות polysome בזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שלוחה מתאימה הדמית AC ולעגן אותה על בעל הקצה הבא להוראות היצרן. הנה, cantilevers לשימוש עם כוח קבוע בין 2-20 N / m הדמיה אוויר סביב 0.1 N / m הדמיה נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מקום הליזר על השלוחה ואת אפס אותות הגלאים ברבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תדירות נהיגה מתאימה ולנסוע השלוחה עם משרעת של 10-20 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתקרב המדגם עד הקצה עוסקת פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור הסריקה של מיקרומטר 2x2, לרכוש לפחות תמונות פיקסל 512x512 (רוחב פיקסל &lt;4 ננומטר), בחר מצב חיסור רקע חיה בסולם Z של 20-25 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק tהוא דמות מחפש בנוכחות חפצה עגולים מאופיינים גובה בין 10 ו -15 ננומטר בעת הרכישה באוויר ו -25 ו -30 ננומטר כאשר בנוזל ואת הרוחב ננו בטווח 25-30. כוונו את הפרמטרים setpoint ומשוב עד חפצים חדים הם דמיינו. הרקע אמור להופיע שטוח יחסית בדגימות טובות, עם כמה חפצים בגובה 2-4 ננומטר (ראה איור 2 א &#39;וב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התמונה נראית טובה (כמצוין בשלב 3.8), לרכוש כמה סריקות מיקרון 2x2 (לפחות עשר) בשעת אזורי מדגם שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי). במידת הצורך, לרכוש תמונות ברזולוציה גבוהה של polysomes שנבחר (ראה איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל תיקוני תוכנה (חיסור מטוס ואלגוריתמי תיקון שורה אחר שורה) כדי לתקן את תמונות AFM הסרת הטיה שרירותית ונסחפו אפקטים. </li></ol> 4. ניתוח נתונים (30 דקות לכל תמונה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא תמונות ב ImageJ (אופציונלי: להחיל גורם קנה מידה) preferentially באמצעות פורמט דחיסה ללא אובדן נתונים, למשל, בפורמט TIFF (ראה איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש RiboPick.ijm הכלים מאקרו ImageJ (להעתקה בתיקיית הכלים מאקרו / ImageJ) לספור הריבוזומים polysomes (ראה איור 3B) ולחשב הסטטיסטיים של המדגם (ראה איור 3 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל טעינת תמונה באמצעות &lt;תמונה קרא&gt; כלי מאתחל את התוכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק המרכזים הריבוזום עם ImageJ &lt;פוינט בחירה&gt; כלי סטנדרטי (shift + שמאל לחץ מאפשר הריבוזומים רב מבחר). סמן את הריבוזומים הנבחרים עם הכלי &lt;מארק ריבוזומים&gt;. קואורדינטות ריבוזום תופענה חלון טקסט מותאם אישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף עוד ריבוזומים לאותו polysome לחזור על ההליך שצוין בנקודת 4.2.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סור בטעות ריבוזומים מסומנים באמצעות &lt;בטל האיסוף האחרון&gt; הכלי (מתחיל הסרה מן הריבוזום הוסיף האחרון לראשון212; ב polysome הנוכחי בלבד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר polysome הושלמה, השתמש &lt;חדש polysome&gt; כלי. ככל שמספר polysome מתווסף כשכבה אל התמונה בחלון הטקסט מתעדכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &lt;שמירת תוצאות וקרובות&gt; לכתוב את הריבוזום לקובץ קואורדינטות (יחידות ברירת המחדל של התמונה משמשות) ואת תמונת PNG המסכם הריבוזומים שקוטף polysomes. התמונה המקורית סגורה ללא להינצל. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Buttgereit, F., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+ATP-consuming+processes+in+mammalian+cells.">A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells.</a> Biochem J. 312, 163-167 (1995).</li><li>Russell, J. B., Cook, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+bacterial+growth:+balance+of+anabolic+and+catabolic+reactions.">Energetics of bacterial growth: balance of anabolic and catabolic reactions.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 48-62 (1995).</li><li>Vogel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+signatures+and+mRNA+concentration+can+explain+two-thirds+of+protein+abundance+variation+in+a+human+cell+line.">Sequence signatures and mRNA concentration can explain two-thirds of protein abundance variation in a human cell line.</a> Mol Syst Biol. 6, 400 (2010).</li><li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li><li>Tebaldi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+uncoupling+between+transcriptome+and+translatome+variations+after+a+stimulus+in+mammalian+cells.">Widespread uncoupling between transcriptome and translatome variations after a stimulus in mammalian cells.</a> BMC Genomics. 13, 220 (2012).</li><li>Kondrashov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosome-mediated+specificity+in+Hox+mRNA+translation+and+vertebrate+tissue+patterning.">Ribosome-mediated specificity in Hox mRNA translation and vertebrate tissue patterning.</a> Cell. 145 (3), 383-397 (2011).</li><li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cap+and+cap-binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression.">Cap and cap-binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 2, 277-298 (2011).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Pircher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+mRNA-derived+noncoding+RNA+targets+and+regulates+the+ribosome.">An mRNA-derived noncoding RNA targets and regulates the ribosome.</a> Mol Cell. 54 (1), 147-155 (2014).</li><li>Simms, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+active+role+for+the+ribosome+in+determining+the+fate+of+oxidized+mRNA.">An active role for the ribosome in determining the fate of oxidized mRNA.</a> Cell Rep. 9 (4), 1256-1264 (2014).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (36), E3815-E3824 (2014).</li><li>van Heesch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+localization+of+long+noncoding+RNAs+to+the+cytosol+and+mono-+and+polyribosomal+complexes.">Extensive localization of long noncoding RNAs to the cytosol and mono- and polyribosomal complexes.</a> Genome Biol. 15 (1), R6 (2014).</li><li>Preissler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not4-dependent+translational+repression+is+important+for+cellular+protein+homeostasis+in+yeast.">Not4-dependent translational repression is important for cellular protein homeostasis in yeast.</a> EMBO J. 34 (14), 1905-1924 (2015).</li><li>Palade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small+particulate+component+of+the+cytoplasm.">A small particulate component of the cytoplasm.</a> J Biophys Biochem Cytol. 1 (1), 59-68 (1955).</li><li>McQuillen, K., Roberts, R. B., Britten, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+nascent+protein+by+ribosomes+in+Escherichia+coli.">Synthesis of nascent protein by ribosomes in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 45 (9), 1437-1447 (1959).</li><li>Wettstein, F. O., Staehelin, T., Noll, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomal+aggregate+engaged+in+protein+synthesis:+characterization+of+the+ergosome.">Ribosomal aggregate engaged in protein synthesis: characterization of the ergosome.</a> Nature. 2 (197), 430-435 (1963).</li><li>Dimitriadis, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetrameric+organization+of+vertebrate+centromeric+nucleosomes.">Tetrameric organization of vertebrate centromeric nucleosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20317-20322 (2010).</li><li>Allen, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscope+measurements+of+nucleosome+cores+assembled+along+defined+DNA+sequences.">Atomic force microscope measurements of nucleosome cores assembled along defined DNA sequences.</a> Biochemistry. 32 (33), 8390-8396 (1993).</li><li>Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P., Steitz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+atomic+structure+of+the+large+ribosomal+subunit+at+2.4+&#197;+resolution.">The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 &#197; resolution.</a> Science. 289 (5481), 905-920 (2000).</li><li>Schluenzen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+functionally+activated+small+ribosomal+subunit+at+3.3+&#197;+resolution.">Structure of functionally activated small ribosomal subunit at 3.3 &#197; resolution.</a> Cell. 102 (5), 615-623 (2000).</li><li>Ben-Shem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+eukaryotic+ribosome+at+3.0+&#197;+resolution.">The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 &#197; resolution.</a> Science. 334 (6062), 1524-1529 (2011).</li><li>Anger, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+the+human+and+Drosophila+80S+ribosome.">Structures of the human and Drosophila 80S ribosome.</a> Nature. 497 (7447), 80-85 (2013).</li><li>Brandt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+native+3D+organization+of+bacterial+polysomes.">The native 3D organization of bacterial polysomes.</a> Cell. 136, 261-271 (2009).</li><li>Myasnikov, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+structure+of+the+left-handed+supra-molecular+helix+of+eukaryotic+polyribosomes.">The molecular structure of the left-handed supra-molecular helix of eukaryotic polyribosomes.</a> Nat. Commun. 5, 5294 (2014).</li><li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+circular+polyribosomes+on+eukaryotic+mRNA+without+cap-structure+and+poly(A)-tail:+a+cryo+electron+tomography+study.">Formation of circular polyribosomes on eukaryotic mRNA without cap-structure and poly(A)-tail: a cryo electron tomography study.</a> Nucleic Acids Res. 42 (14), 9461-9469 (2014).</li><li>Afonina, Z. A., Myasnikov, A. G., Shirokov, V. A., Klaholz, B. P., Spirin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformation+transitions+of+eukaryotic+polyribosomes+during+multi-round+translation.">Conformation transitions of eukaryotic polyribosomes during multi-round translation.</a> Nucleic Acids Res. 43 (1), 618-628 (2015).</li><li>Viero, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+ribosome+assemblies+modulated+by+translation+are+the+building+blocks+of+polysomes.">Three distinct ribosome assemblies modulated by translation are the building blocks of polysomes.</a> J Cell Biol. 208 (5), 581-596 (2015).</li><li>Brandt, F., Carlson, L. -. A., Hartl, F. U., Baumeister, W., Gr&#252;newald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+organization+of+polyribosomes+in+intact+human+cells.">The three-dimensional organization of polyribosomes in intact human cells.</a> Mol. Cell. 39, 560-569 (2010).</li><li>Wu, X., Liu, W. Y., Xu, L., Li, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+of+ribosomes+and+initiation+complexes+from+rat+liver+as+revealed+by+atomic+force+microscopy.">Topography of ribosomes and initiation complexes from rat liver as revealed by atomic force microscopy.</a> Biol Chem. 378 (5), 363-372 (1997).</li><li>Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+and+atomic+force+microscopic+observation+of+polysomes+on+carbon-coated+grids+prepared+by+surface+spreading.">Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 46 (6), 503-506 (1997).</li><li>Mikamo, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+polysomes+of+Saccharomyces+cerevisiae+in+liquid+solution+observed+by+atomic+force+microscopy.">Native polysomes of Saccharomyces cerevisiae in liquid solution observed by atomic force microscopy.</a> J. Struct. Biol. 151, 106-110 (2005).</li><li>Mikamo-Satoh, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+gene-dependent+translational+progress+in+cellfree+protein+synthesis+by+real-space+imaging.">Profiling of gene-dependent translational progress in cellfree protein synthesis by real-space imaging.</a> Anal. Biochem. 394, 275-280 (2009).</li><li>Bernab&#242;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling.">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboAbacus:+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes.">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain.">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853 (2015).</li><li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

כמו מבנה ה- DNA הוכח להיות בעל חשיבות עליונה כדי לתאר את התהליך של שעתוק כארגון של הכרומטין קידם את ההבנה שלנו של שליטה תעתיק של ביטוי גנים, חשוב לנתח את הארגון והמבנה של polysomes לשפר הבנה אמת תרגום והרגולציה שלה. עם הפרוטוקול המתואר, צ...

הסינתזה של חלבון היא תהליך האנרגיה הרב ביותר בתאים 1,2. לפיכך, אין זה מפתיע כי שכיחותם חלבון נשלטת בעיקר על translational ולא 3,4,5 רמת התעתיק. Polysome הוא המרכיב macromolecular היסוד הממיר את המידע mRNA לתוך readouts חלבוניים פונקציונלי. Polysomes ובכך מוכרים ככל מתחמי macromolecular שבו מספר פקדים translational להתכנס 6-13. למרות מאה מחקרים על מבנה הריבוזום 14- 16, תובנה המולקולריות המפורטות לתוך הדינמיקה של תרגום ואת הטופולוגיה של polysomes נתקלו עניין מוגבל. כתוצאה מכך, הארגון של מתחם polysomal ribonucleoprotein יליד ההשפעה הפוטנציאלית שלה על תרגום עדיין די בעיות מעורפלות. Polysomes עשוי להסתיר עדיין ארגונים ידועים הורה ופונקציונלי, פוטנציאל שיקוף נוקלאוזום מה לניהול עבודות אפיגנטייםls ייצג לתחום שעתוק. ואכן, החקירה של שערת מסקרן זה דורשת מחקרים נוספים וגישות טכניות חדשות. בקו הזה, טכניקות מבניות במיקרוסקופ כוח אטומי יכולים לשתף פעולה פורה לפענח מנגנונים חדשים לבקרת ביטוי גנים, בדומה למה הושג עבור הנוקלאוזום 17,18. מאז גילויו של הריבוזום 14-16, מבנו התאפיין בהרחבת פרוקריוטים 19,20, שמרים 21 ולאחרונה ב -22 אנושיים, מתן התיאור המולקולרי של המנגנונים בבסיס סינתזת חלבון. Polysomes בתחילה הוכרו על הממברנה של reticulum endoplasmic, ויצר ארגונים גיאומטריים 2D טיפוסיים 14. כפי שהוזכר קודם לכן, הרכבת polysome לא מושא ריבית קבועה כמו המבנה הריבוזום. בעבר, polysomes נחקר בעיקרו על ידי transmission EM מבוסס טכניקות. רק לאחרונה, טכניקות קריו-EM איפשר שחזור 3D של polysomes מטוהרים ממערכות תרגום במבחנה 23-26, lysates הסלולר אדם 27 או בתאים 28. טכניקות אלו המוצעים מידע מעודן יותר על הארגון הריבוזום-הריבוזום ב polysomes 23, 26-28 ותיאור מולקולרי ראשוני של משטחי מגע של ריבוזומים סמוכים polysomes נבט חיטה 24. לפיכך, טומוגרפיה קריו-EM מאפשרת הגילוי של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום עם מולקולרי, אבל הוא נטל על ידי ושחזור שלאחר עיבוד נרחב מנתח הדורשים משאבי חישוביים כבדים לצורך הטיפול במידע. יתר על כן, כדי לקבל את הפרטים המולקולריים של אינטראקציות הריבוזום-הריבוזום, מפה נפתרה ביותר של הריבוזום נדרשה, וגם זה סוג של הריבוזום עזר זמין רק לכמה מינים. חשוב לציין, טומוגרפיה קריו-EM היא לא מסוגלת לזהות RNA בחינם. Therefבצר, טכניקות חדשות נדרשים להבין את הארגון באופן מלא של מכונות תרגום. לצד קריו-EM, AFM הועסק גם ככלי שימושי עבור הדמיה ישירה של polysomes אאוקריוטים התחתון 29-33 ובני אדם 27. לעומת EM, AFM לא דורש קיבוע מדגם או תיוג. בנוסף, מדידות יכולות להתבצע בתנאים פיסיולוגיים ליד ועם האפשרות הייחודית של זיהוי הוא ריבוזומים בבהירות גדילי RNA עירום 27. הדמיה של polysomes היחיד יכולה להתבצע במהירות יחסית, קבלת אלף תמונות בבת ברזולוצית ננו עם מאמץ שלאחר עיבוד מעט לעומת העיבוד שלאחר נרחב וכבד ושחזור ניתוחי נדרש על ידי מיקרוסקופ קריו-EM. כתוצאה מכך, AFM טיפול נתונים וניתוח לא צריך תחנות עבודה יקרות וכוח מחשוב גבוה. ככזה, טכניקה זו אוספת מידע על צורות polysomal, מאפיינים מורפולוגיים (כגוןגובה, אורך ורוחב), צפיפויות הריבוזום, בנוכחות RNA חינם ומספר ריבוזומים לכל polysome 27 עם תפוקה גבוהה יותר מאשר-EM קריו. באופן כזה, AFM מייצג גישה חזק משלים טכניקות EM להציג polysomes 27. כאן אנו מציגים צינור מלא מפני טיהור כדי ניתוח נתונים שבו AFM מוחל תמונה ולנתח polysomes במוח עכבר. הפרוטוקול המוצע מתמקד בנושאי טיהור ועל בתצהיר המדויק של polysomes על מצעים יציצו המשמשים הדמית AFM. בנוסף ניתוח חלקיקים קונבנציונלי שניתן לבצע בקלות עם תוכנה נפוצה בשימוש על ידי קהילת AFM, תוסף 34 ImageJ, שנקרא RiboPick, מוצג עבור לספור את מספר ריבוזומים לכל polysome 27, 35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89836</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock RNAse Inhibitor</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>EO-0381</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40718</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Sucrose gradient preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima LE-80K</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW 41 Ti</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Fractionation System&#160;</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td>67-9000-176</td>
			<td>Sucrose gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>Cypher</td>
			<td>Polysome visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

מנגנון translational, כלומר, polysome או polyribosome, הוא אחת הכונה ציטופלסמית הגדולות והמורכבות ביותר בתאים. Polysomes, שהוקם על ידי הריבוזומים, mRNAs, כמה חלבוני RNAs ללא קידוד, מייצג פלטפורמות משולבות שבו שולט translational להתקיים. עם זאת, בעוד הריבוזום נחקר באופן נרחב, ארגון polysomes עדיין חסר הבנה מקיפה. כך מאמץ רב נדרש כדי להבהיר ארגון polysome וכל מנגנון חדשני מלא translational שעשוי להיות מוטבע. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הוא סוג של מיקרוסקופיה בדיקת סריקה המאפשר רכישת תמונות 3D ברזולוציה של ננו. לעומת במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) טכניקות, אחד היתרונות העיקריים של AFM הוא שזה יכול לרכוש אלף תמונות הם אוויר בתמיסה, מה שמאפשר את המדגם כדי להישמר בתנאים פיסיולוגיים ליד ללא כל צורך מכתים ותיקון פרופרוצדורות. כאן, פרוטוקול מפורט לטיהור המדויקת של polysomes ממוח עכבר בתצהיר שלהם על מצעים יציצו מתואר. פרוטוקול זה מאפשר הדמית polysome באוויר ואת הנוזלים עם AFM והשחזור שלהם כמו אובייקטים תלת-ממדיים. משלימים במיקרוסקופ אלקטרונים cryo- (cryo-EM), השיטה המוצעת ניתן להשתמש בנוחות לניתוח polysomes ולומדים הארגון שלהם באופן שיטתי.

פרופיל polysomal שיפוע סוכרוז של מוח עכבר השלם אפשר לטהר polysomes מתוך lysate הסלולר על ידי יצירת פרופיל polysomal, המפריד מקרומולקולות בהתאם למשקל וגודלם. עם פרופיל polysomal, lysates ציטופלסמית המתקבל תאי?...

Watch this Scientific Journal Video about Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

peering-at-brain-polysomes-with-atomic-force-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Video: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

המדינה תלות השפעות על TMS: מבט על התנהגות Phosphene מניע

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

הדמייה תפקודית באמצעות שיבוש Ultrasonic הדם למוח הגדר מנגן משופרת MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

מיקרון בקנה מידת רזולוציה אופטית טומוגרפיה של מוח עכבר השלם עם מיקרוסקופית גיליון Confocal אור

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

מניפולציה גנטית של Cerebellar גרגיר נוירונים<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em&gt; ללמוד עצבי מורפולוגיה וגירה

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

מערכת חוש הריח כמודל לחקר דפוסי axonal צמיחה ומורפולוגיה<em&gt; In vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

ניסוי demyelination וחידוש יצירת המיאלין של חוט השדרה Murine על ידי הזרקת מרחק מיקוד של Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

אפיון תכונות מכאניות Multiscale של רקמת המוח באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי, שפעת זחה, ו Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

אוטומטיות והרצתי ניתוח אצל עכברים עם פציעה כרונית הכיווץ

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

מציץ המוח Polysomes עם מיקרוסקופית כוח אטומי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video