Name: peering at brain polysomes with atomic force microscopy
Uploaded: 2016-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy at JoVE.com

This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

마우스 조직을 얻기 위해 사용되는 사례가 트 렌토 대학의 동물의 보호 (OPBA) (이탈리아)의 몸에 의해 승인 된 프로토콜 없음. 04-2015, 같은 art.31 당 입법 법령 없음. 2,014분의 26. 모든 마우스는 통합적인 생물학 센터 (CIBIO), 트 렌토 대학, 이탈리아의 모델 생물의 시설 유지했다. 주의 : 샘플 중 RNA의 분해를 방지하는 RNase 오염을 최소화 DEPC 처리 된 물을 사용하는 모든 버퍼를 제조 하였다. 항목의 두뇌에서 Polysom​​es 1. 준비 <ol><li> 뇌 조직 수집 (15 분) <ol><li> 5 분 36 CO 2 질식과 야생형 마우스 스트레인 C57BL / 6 안락사. 조심스럽게, 두개골 (36)로부터 뇌를 해부 1.5 ML 튜브로 조직을 배치하고 즉시 액체 질소에 넣습니다. 사용할 때까지 -80 ° C에서 보관하십시오. </li></ol></li><li> 해물의 준비 (30 분) <ol><li> 하여 전체 뇌 조직 분쇄액체 질소에서 박격포와 유 봉. </li><li> 감기 microcentrifuge 관에 약 25 mg의 분말을 전송하고 즉시 신속하게 피펫 팅 상하 25 배 용해 완충액 (표 1) 0.8 mL를 추가하고, 세포를 교란 (분쇄 된 조직의 해동을 피하기 위해). </li><li> 세포 파편 펠렛 4 ° C에서 1 분 동안 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 15 분 동안 얼음에 튜브를 유지. </li><li> 핵 및 미토콘드리아 펠렛 4 ° C에서 5 분 동안 12,000 XG에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 새로운 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 6 개월 최대 -80 ° C에서 뜨는을 저장하거나 즉시 사용할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 수 크로스 구배 원심 분리 제제와 (2 시간 30 분) <ol><li> 의 RNase없는 물 (디 에틸 피로 카보 처리 수 (DEPC-물) 또는 상업적)와 광범위하게 세척 초 원심 분리기 튜브D 3 % H 2 O 2 / DEPC H 2 O 솔루션입니다. </li><li> 얼음에 튜브를 넣고 각 튜브 (자당 용액에 대한 표 1 참조)의 바닥에 50 %의 차가운 수크로오스 용액 5.5 mL로 추가한다. 조심스럽게 튜브가 완전히 채워질 때까지, 날카로운 계면을 유지하기 위해서 계면 부근에 머물고, 드롭하여 15 % 자당 용액 방울을 추가합니다. 튜브가 완전히 충전 될 때, 기포 형성을 방지하기 위해 고무 마개를 닫는다. </li><li> 추운 방에서 조심스럽게 수평으로 튜브를 놓고 2 시간 동안이 위치에 보관합니다. 이 시간이 지나면 천천히 수직 위치에 튜브를 곧게하고 얼음에 넣어. 그라디언트 이제 사용할 준비가 있습니다. 또한, 전 기존의 그라데이션을 사용하여 15~50% 자당 기울기를 준비합니다. </li><li> 차가운 방에 구배의 상부로부터 1.0 ml를 조심스럽게 제거하고 세포질 분해물로 강하하여 자당 드롭 (즉, 상청액 인트 얻어진 오버레이P 1.2). </li><li> 조심스럽게 스윙 버킷 로터의 버킷으로 튜브를 낮 춥니 다. 초 원심 분리기를 사용하여 4 ° C에서 18 XG에 100 분의 그라디언트를 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후, 그라디언트가 안정 될 수 있도록 4 ° C에서 20 분 동안 자신의 양동이에 튜브를 둡니다. </li></ol></li><li> 자당 그라데이션 분류 (2 시간) <ol><li> 조심스럽게 초원 심 분리기 회 전자에서 하나의 초 원심 분리기 튜브를 제거하고 밀도 그라데이션 분별 시스템의 컬렉터 장치에 장착. 자외선 / VIS 검출기 (그림 1 상단 패널)와 260 nm에서 흡광도를 모니터링하는 1 ml의 분수를 수집합니다. 얼음에 수집 된 분수를 유지합니다. </li><li> 관심있는 분은 30 ~ 40 μL의 분취 량을 준비 사용까지 -80 ° C에서 그들을 저장하기 전에 얼음에 보관하십시오. 두 개 이상의 냉동 - 해동 사이클을 시행 분취 또는 자당 분수를 사용하지 마십시오 (그림 1 하부 패널 참조). </li></ol> &lt;/ 리&gt; </ol> 원자 힘 현미경 2. 샘플 준비 (3 시간) <ol><li> 운모 시트를 벗겨, 테이프를 사용. </li><li> DEPC-물 운모 시트를 3 ~ 4 회 반복하고 작은 페트리 접시에 놓습니다. 이어서 공기를 이용하여 표면을 건조. </li><li> 1 mM의 NISO 4의 200 μL와 운모를 덮고 실온에서 3 분 동안 품어. </li><li> 니켈 용액을 제거하고 공기를 이용하여 표면을 건조. 얼음에 운모와 페트리 접시를 배치하여 4 ℃에서 미래의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 얼음에 1.4.2에서 얻은 나누어지는을 녹여 부드럽게 운모에 드롭하여 샘플 드롭을 모두 추가 할 수 있습니다. 100-200 μL 팁을 사용하여, 운모의 전체 표면 상에 샘플을 확산. 3 분 동안 얼음에 샘플을 품어. </li><li> 200 μL 차가운 버퍼-AFM과 드롭에 의한 운모 시트 드롭을 커버 (표 1 참조)과 얼음에 1 시간 동안 품어. </li><li> 액체 영상 <ol><li> 조심스럽게 버퍼-AFM 제거하고 운모 시트를 3 ~ 4 시간을 씻어200 μL 차가운 버퍼-AFM와의 초과 크로스를 제거합니다. 이어서 운모 시트를 저온 세척 용액으로 3 회 세척 용액 몇 ㎕를 적용 운모 표면을두고있다 (표 1 참조). </li><li> 3 (이미지 획득)을 가리 키도록 이동합니다. </li></ol></li><li> 공기 영상 <ol><li> 조심스럽게 버퍼-AFM을 제거하고 여분의 크로스를 제거하기 위해 200 μl의 차가운 버퍼-AFM으로 운모를 3 ~ 4 회 반복한다. 그 후, 마이카를 차가운 세척액으로 3 회 반복한다 (표 1 참조)과 종이를 사용하여 과잉의 물을 배수. </li><li> 부분적으로 개방 된 페트리 접시의 상단과 화학 후드에서 건조 샘플을 남겨주세요. 2 시간 후, 실온에서 페트리 접시와 저장소를 닫습니다. 그들이 년 동안 안정적으로 2 ~ 3 시간 후 샘플을 측정합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 인식 (열 안정화 후 이미지 당 15 분) 주 : 운모에 고정화 Polysom​​es은 AC 모드를 사용하여, 공기 또는 액체에 이미징 될 수있다. <ol><li> 양면 테이프를 사용하여 샘​​플 홀더 운모 첨부. </li><li> 제조사의 지시 다음 AFM 단계에서 샘플 홀더를 삽입합니다. 가능하면 영상은 액체, 시간 polysom​​e 안정성을 증가시키기 위해보다 낮은 온도 25 ° C에서 샘플을 유지하려고하는 경우. </li><li> AC 영상에 적합한 캔틸레버를 선택하고는 제조업체의 지침에 따라 팁 홀더에 장착합니다. 여기에, 공기 이미징을위한 2-20 N / m 및 액체 이미징을위한 약 0.1 N / m 사이에 일정한 힘으로 사용 캔틸레버. </li><li> 캔틸레버에 레이저 스폿을 조정하고 사분면 검출기 신호를 제로. </li><li> 좋은 기회 구동 주파수를 선택하고 10 ~ 20 나노 미터의 크기로 캔틸레버를 구동한다. </li><li> 팁이 표면에 결합 될 때까지 샘플에 접근. </li><li> 적어도 512 × 512 픽셀 이미지 (픽셀 폭 &lt;4 nm의)를 획득, 2 × 2 ㎛의 스캔 영역을 선택 라이브 배경 빼기 모드와 20 ~ 25 nm의 Z 스케일을 선택합니다. </li><li> t 검사그 화상 범위 25 ~ 30 nm의 공기 및 액체 (25) 및 30 nm의 폭으로 확보 할 때 10 내지 15 사이의 높이에 의해 특징 원형 물체의 존재를 찾는. 날카로운 물체가 가시화 될 때까지 설정 값과 피드백 매개 변수를 조정합니다. 배경은 일부 2-4 나노 미터 높이 개체 (그림 2A와 B 참조), 좋은 샘플에서 상대적으로 평평하게 나타납니다. </li><li> (포인트 3.8에 나타낸 바와 같이) 이미지가 잘 보이는 경우, 다른 샘플 영역에서 여러 (최소 10) × 2 미크론 스캔을 취득. </li><li> (선택 과목). 필요한 경우, 선택된 polysomes의 높은 해상도 이미지를 획득 (도 2C 참조). </li><li> 원자 현미경 이미지 임의의 기울기를 제거하고 효과를 표류를 해결하기 위해 소프트웨어 수정 (평면 감산 및 라인 별 보정 알고리즘)을 적용합니다. </li></ol> 4. 데이터 분석 (이미지 당 30 분) <ol><li> preferent : ImageJ에 (스케일 팩터를 적용 사양)에서 이미지 내보내기ially 예 무손실 압축 포맷을 이용하여 TIFF 포맷 (도 3a 참조). </li><li> 샘플의 통계적 특성을 polysomes에서 리보솜 (그림 3B 참조) 계산과 계산하기 위해합니다 (ImageJ에 매크로 / 도구 세트 서브 디렉토리에 복사 할)이 ImageJ에 매크로 도구 세트의 RiboPick.ijm를 사용하여 (그림 3C 참조). <ol><li> 프로그램 초기화 &lt;판독 화상&gt; 도구를 사용하여 이미지를로드 시작. </li><li> 표준 ImageJ에 &lt;포인트 선택&gt; 도구 (시프트 + 왼쪽 클릭은 ​​리보솜의 다중 선택을 할 수 있습니다)와 리보솜 센터를 선택합니다. 의 &lt;마크 리보솜&gt; 도구를 선택한 리보솜을 표시합니다. 리보솜 좌표는 사용자 정의 텍스트 창에 표시됩니다. </li><li> 포인트 4.2.2에 명시된 절차를 반복 동일한 polysom​​e에 더 많은 변이를 추가합니다. </li><li> 첫 번째로 마지막에 추가 리보솜에서 제거 &lt;실행 취소 마지막 선택&gt; 도구 (시작을 사용하여 잘못 표시 리보솜을 제거(212); 현재 polysom​​e 만). </li><li> polysom​​e이 완료되면, &lt;새 polysom​​e&gt; 도구를 사용한다. polysom​​e 번호가 이미지에 오버레이로 추가로, 텍스트 창에 업데이트됩니다. </li><li> 사용하여 리보솜 파일 (이미지의 기본 단위가 사용된다)와 픽업 리보솜과 polysom​​es을 요약하는 PNG 이미지를 좌표를 작성하는 &lt;결과와 가까이 저장&gt;. 원본 이미지는 저장되지 않고 닫힙니다. </li></ol></li></ol>

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Biochem. 394, 275-280 (2009).</li><li>Bernab&#242;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+translational+control+in+non-model+stressed+organisms+by+polysomal+profiling.">Studying translational control in non-model stressed organisms by polysomal profiling.</a> J. Insect Physiol. 76, 30-35 (2015).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">IH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Lauria, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RiboAbacus:+a+model+trained+on+polyribosome+images+predicts+ribosome+density+and+translational+efficiency+from+mammalian+transcriptomes.">RiboAbacus: a model trained on polyribosome images predicts ribosome density and translational efficiency from mammalian transcriptomes.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Al Omran, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+the+Ependymal+Cilia+in+the+Lateral+Ventricles+of+the+Mouse+Brain.">Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain.</a> J Vis Exp. (100), e52853 (2015).</li><li>Warner, J. R., Rich, A., Hall, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

DNA의 구조가 전사 및 염색질의 조직에서 유전자 발현의 전사 조절에 대한 우리의 이해를 발전와 프로세스를 설명하는 데 가장 중요한 것으로 입증 된 바와 같이, 이는 진실 이해력을 향상 polysom​​es의 조직 및 구조를 분석하는 것이 필수적이다 번역 및 규제. 전술 한 프로토콜에 부드럽게 평평한 표면에 고정화 polysom​​es의 최적 밀도는 AFM 영상 적합한 얻는다. 편리하게 ?...

단백질의 합성은 1,2- 세포에서 가장 에너지 소비 프로세스이다. 그러므로, 단백질 존재비 주로 병진 아닌 전사 수준 3,4,5-에서 제어된다는 의외이다. polysom​​e 기능성 단백질 판독에 mRNA의 정보를 변환하는 기본적인 거대 분자 구성 요소입니다. Polysomes는 지금까지 여러 번역 컨트롤 6-13을 수렴 거대 분자 복합체로 인식하고 있습니다. 리보솜 구조 14- (16)에 대한 연구 수백에도 불구하고, 번역의 역학에 대한 자세한 분자 통찰력과 polysomes의 토폴로지는 제한된이자가 발생했습니다. 결과적으로, 기본 polysom​​al의 리보 핵산 단백질 복합체의 조직과 번역에 대한 잠재적 효과는 여전히 다소 애매한 문제입니다. Polysom​​es 잠재적 무엇 뉴 클레오 및 후생 유전 학적 contro 미러링, 여전히 알 수없는 주문 및 기능 조직을 숨길 수 있습니다LS는 전사 필드에 표시했다. 사실,이 흥미로운 가설의 조사 추가 연구와 새로운 기술 접근​​ 방식이 필요합니다. 이 라인에서, 구조 기술과 원자 힘 현미경 fruitfully 마찬가지로 뉴 클레오 17, 18 달성 한 것에, 유전자 발현을 제어하기위한 새로운 메커니즘을 해명하기 위해 협력 할 수 있습니다. 리보솜 14-16의 발견 이래, 그 구조는 광범위 단백질 합성의베이스 메커니즘의 분자에 대한 설명을 제공 원핵 19,20, 최근에는 인간 (22) 효모 21 특징으로하고있다. Polysomes는 초기 일반적인 2D 형상기구 (14)를 형성하는, 소포체의 막에서 인식되었다. 앞서 언급 한 바와 같이, polysom​​e 조립체 리보솜 구조로서 지속적인 관심의 대상이 아니었다. 과거 polysom​​es TR은 본질적으로 연구되어왔다ansmission 기술을 EM은 기반. 최근에, 냉동-EM 기술은 체외 번역 시스템 23-26에서 정제 polysomes의 3D 복원, 사람 세포 용 해물 (27) 또는 셀 (28)의 수있었습니다. 이러한 기술은 polysomes 23, 26 ~ 28과 밀 배아 polysomes (24)에 인접 리보솜의 접촉면의 예비 분자 설명에 리보솜 - 리보솜 조직에 대한 더 정제 된 정보를 제공했다. 따라서, 냉동-EM 단층 촬영 분자 세부 리보솜 - 리보솜 상호 작용의 공개를 할 수 있지만 광범위한 후 처리 부담하고 재건 데이터를 처리하기위한 무거운 전산 자원을 필요로하는 분석한다. 또한, 리보솜 리보솜 작용의 분자 세부 수득 리보솜의 고해상 맵이 필요하며, 기준 리보솜이 종류는 몇 종 가능하다. 중요한 크라이 EM 단층 무연 RNA를 검출 할 수 없다. Theref철광석은 새로운 기술은 완전히 변환 장치의 구성을 이해하기 위해 필요하다. 냉동-EM 옆에, AFM은 낮은 진핵 생물 29-33과 인간 (27)에 polysomes 직접 이미징을위한 유용한 도구로 사용되어왔다. EM에 비해 AFM은 샘플 고정 또는 라벨이 필요하지 않습니다. 또한, 측정 값에 가까운 생리적 조건에서 명확 리보솜 벗은 RNA 가닥 (27)을 모두 식별하는 고유의 가능성을 행할 수있다. 단일 polysom​​es의 영상은 광범위하고 무거운 후 처리에 재건은 냉동-EM 현미경에 의해 요구 분석에 비해 조금 후 처리 노력으로 나노 해상도에서 이미지의 수천을 획득, 상대적으로 빠르게 수행 할 수 있습니다. 따라서, AFM 데이터 처리 및 분석은 고가의 워크 스테이션과 높은 컴퓨팅 파워를 필요로하지 않습니다. 이와 같이,이 기술은 polysom​​al 도형에 대한 정보, 형태 학적 특성 (예 : 수집높이, 길이 및 폭), 리보솜 밀도없는 RNA의 존재 및 극저온 EM보다 높은 처리량 polysome 당 27 리보솜의 수. 이러한 방식으로, AFM은 polysomes (27)을 묘사하는 EM 기술에 대한 강력하고 상호 보완적인 접근 방식을 나타냅니다. 여기에서 우리는 정화의 AFM이 이미지에 적용하고 마우스 뇌 polysom​​es을 분석 데이터 분석에 대한 완전한 파이프 라인을 제시한다. 제안 된 프로토콜은 정화 문제와 AFM 이미징에 사용되는 운모 기판에 polysom​​es의 정확한 증착에 초점을 맞추고있다. 쉽게 AFM 커뮤니티에서 사용되는 일반적인 소프트웨어와 함께 수행 될 수있는 종래의 입자 분석 외에도 RiboPick라는 ImageJ에 플러그 (34)는, polysome 27, 35 당 리보솜 수를 계수되게된다.

<table><tbody><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma</td><td>01810</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DNAseI</td><td>Thermo Scientific</td><td>89836</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>RiboLock RNAse Inhibitor</td><td>Life technologies</td><td>EO-0381</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma</td><td>40718</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Microcentrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Prepararation of lysate</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma</td><td>S5016</td><td>Sucrose gradient preparation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima LE-80K</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>SW 41 Ti</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Polyallomer tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td>Sucrose gradient centrifugation</td></tr><tr><td>Density Gradient Fractionation System&amp;nbsp;</td><td>Teledyne Isco</td><td>67-9000-176</td><td>Sucrose gradient fractionation</td></tr><tr><td>AFM</td><td>Asylum Research</td><td>Cypher</td><td>Polysome visualization</td></tr></tbody></table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

병진 기계, 즉, polysome 또는 polyribosome은 세포에서 가장 크고 가장 복잡한 세포질 기계 중 하나입니다. 리보솜, mRNA를 여러 단백질과 비 코딩 RNA를 형성 Polysom​​es는 번역 컨트롤이 일어날 플랫폼을 통합 나타냅니다. 리보솜 널리 연구되고있다 동안 그러나, polysom​​es의 조직은 여전히​​ 포괄적 인 이해가 결여되어있다. 따라서 많은 노력이 polysom​​e 조직과 내장 될 수있다 병진 제어의 새로운 메커니즘을 규명하기 위해 필요합니다. 원자력 현미경 (AFM)을 나노 스케일 해상도에서 3D 영상의 획득이 가능 사형 프로브 현미경의 유형이다. 전자 현미경 (EM) 방법에 비해, AFM의 주요 이점 중 하나는, 공기와 용액 중의 두 이미지 수천 취득 시료를 활성화 할 수 있다는 것이다은 염색 친 고정 할 필요없이 주변의 생리적 조건 하에서 유지 될cedures. 여기서, 마우스 뇌 운모 기판에 자신의 증착에서 polysom​​es의 정확한 정제 상세한 프로토콜 설명한다. 이 프로토콜은 AFM 및 3 차원 물체 그들의 재건과 공기와 액체의 polysom​​e 촬영을 할 수 있습니다. 극저온 전자 현미경 (EM 극저온) 상보는 제안 된 방법은 편리 체계적 polysom​​es를 분석하고 조직을 연구에 사용될 수있다.

전체 마우스 뇌의 자당 그라데이션 polysomal 프로파일 그들의 무게와 크기에 따라 거대 분자를 분리 polysom​​al 프로파일 링하여 세포 용 해물에서 polysom​​es을 정화 할 수있다. polysom​​al 프로파일로, 이러한 예에서와 같이 배양 된 세포 또는 조직에서 얻은 세포질 해물은 (자신의 침강 계수에 따라 40S와 60S 서?...

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

원자 힘 현미경과 뇌 Polysom​​es에서 피어링

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K 조회수.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

원자 힘 현미경을 사용하여 재조합 DNA와 단백질 단지의 시각화

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

연구

생체공학

Atomic Force Microscopy of Red-Light Photoreceptors Using PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be measured to ~10 pN by a laser and sectored detector, which can be converted to image topography. Amplitude modulation or &#8220;tapping mode&#8221; AFM involves the probe making intermittent contact with the surface while oscillating at its resonant frequency to produce an image. Used in conjunction with a fluid cell, tapping-mode AFM enables the imaging of biological macromolecules such as proteins in physiologically relevant conditions. Tapping-mode AFM requires manual tuning of the probe and frequent adjustments of a multitude of scanning parameters which can be challenging for inexperienced users. To obtain high-quality images, these adjustments are the most time consuming.
PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) produces an image by measuring a force response curve for every point of contact with the sample. With ScanAsyst software, PF-QNM can be automated. This software adjusts the set-point, drive frequency, scan rate, gains, and other important scanning parameters automatically for a given sample. Not only does this process protect both fragile probes and samples, it significantly reduces the time required to obtain high resolution images. PF-QNM is compatible for AFM imaging in fluid; therefore, it has extensive application for imaging biologically relevant materials.
The method presented in this paper describes the application of PF-QNM to obtain images of a bacterial red-light photoreceptor, RpBphP3 (P3), from photosynthetic R. palustris in its light-adapted state. Using this method, individual protein dimers of P3 and aggregates of dimers have been observed on a mica surface in the presence of an imaging buffer. With appropriate adjustments to surface and/or solution concentration, this method may be generally applied to other biologically relevant macromolecules and soft materials.

A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.

PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

Atomic force microscopy (AFM) uses a pyramidal tip attached to a cantilever to probe the force response of a surface. The deflections of the tip can be ...

공학

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

생화학

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

액체의 진폭 변조 원자 힘 현미경과 서브 나노 미터 해상도 이미징

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription to take place in eukaryotic cells. The dynamics of nucleosomes provides access to the DNA by replication and transcription machineries, and critically contributes to the molecular mechanisms underlying chromatin functions. Single-molecule studies such as atomic force microscopy (AFM) imaging have contributed significantly to our current understanding of the role of nucleosome structure and dynamics. The current protocol describes the steps enabling high-resolution AFM imaging techniques to study the structural and dynamic properties of nucleosomes. The protocol is illustrated by AFM data obtained for the centromere nucleosomes in which H3 histone is replaced with its counterpart centromere protein A (CENP-A). The protocol starts with the assembly of mono-nucleosomes using a continuous dilution method. The preparation of the mica substrate functionalized with aminopropyl silatrane (APS-mica) that is used for the nucleosome imaging is critical for the AFM visualization of nucleosomes described and the procedure to prepare the substrate is provided. Nucleosomes deposited on the APS-mica surface are first imaged using static AFM, which captures a snapshot of the nucleosome population. From analyses of these images, such parameters as the size of DNA wrapped around the nucleosomes can be measured and this process is also detailed. The time-lapse AFM imaging procedure in the liquid is described for the high-speed time-lapse AFM that can capture several frames of nucleosome dynamics per second. Finally, the analysis of nucleosome dynamics enabling the quantitative characterization of the dynamic processes is described and illustrated.

Here, we present a protocol to characterize nucleosome particles at the single-molecule level using static and time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging techniques. The surface functionalization method described allows for the capture of the structure and dynamics of nucleosomes in high-resolution at the nanoscale.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

Functionalization of Atomic Force Microscope Cantilevers with Single-T Cells or Single-Particle for Immunological Single-Cell Force Spectroscopy

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This technique allows for probing interaction strengths and dynamics on a live cell membrane, including those between cells, receptor and ligands, and alongside many other variations. It also works as a mechanism to deliver a physical or biochemical stimulus on single cells in a spatiotemporally controlled manner, thus allowing specific cell activation and subsequent cellular events to be monitored in real-time when combined with live-cell fluorescence imaging. The key step in those AFM-SCFS measurements is AFM-cantilever functionalization, or in other words, attaching a subject of interest to the cantilever. Here, we present methods to modify AFM cantilevers with a single T cell and a single polystyrene bead respectively for immunological studies. The former involves a biocompatible glue that couples single T cells to the tip of a flat cantilever in a solution, while the latter relies on an epoxy glue for single bead adhesion in the air environment. Two immunological applications associated with each cantilever modification are provided as well. The methods described here can be easily adapted to different cell types and solid particles.

We present a protocol to functionalize atomic force microscope (AFM) cantilevers with a single T cell and bead particle for immunological studies. Procedures to probe single-pair T cell-dendritic cell binding by AFM and to monitor the real-time cellular response of macrophages to a single solid particle by AFM with fluorescence imaging are shown.

단일 T 세포또는 면역 학적 단세포 힘 분광학을 위한 단입자를 가진 원자력 현미경 캔틸레버의 기능화

Atomic force microscopy based single cell force spectroscopy (AFM-SCFS) is a powerful tool for studying biophysical properties of living cells. This ...

면역학 및 감염병학

Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, polymers, and biological samples. AFM offers over 1000 times more resolution than the optical imaging system. Images generated from AFM are three-dimensional surface profiles, offering an advantage over the flat, two-dimensional images from other imaging techniques.
The AFM Probe
The probe is regarded as the heart of any AFM setup and comprises the cantilever and tip assembly. Probes are the most commonly replaced part on this type of microscope because&#160; the constant interaction with the samples wears down the tip. Therefore, the choice of material for the probe depends on the properties of the sample. Silicon probes, used to analyze hard samples, are stiffer and sharper than silicon nitride probes, which are better suited to scan softer samples. These sharp tips are produced using electrochemical etching or carbon nanotubes for higher accuracy analysis.
Imaging Modes of AFM
In AFM, surface topography is studied using the interaction between the probe tip and the sample surface. There are two main imaging modes &#8212; a static mode, also referred to as the contact mode, and a dynamic mode.
In the static or contact mode, the tip of the probe is in continuous contact with the sample surface. As the tip drags over the surface, repulsive forces between the sample and the tip result in the cantilever bending, which is recorded. The entire specimen surface is scanned back and forth in both x- and y-axes, called raster scanning, while the vertical movement of the cantilever records the z-axis, thus generating a 3D image.
In the dynamic mode, the probe oscillates just above the sample surface, coming close to, but not touching the surface. Attractive and repulsive forces determine the variation in distance between the tip and the sample, affecting the amplitude of cantilever oscillation. This feedback is recorded to construct the surface topography of the sample.

원자력 현미경

Atomic force microscopy (AFM) is a type of scanning probe microscopy that can analyze topographic details of various specimens like ceramics, glass, ...

교육

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

주요 용어 및 개념

Static Atomic Force Microscopy to Visualize and Characterize Assembled Nucleosomes

Prepare the mica surface for static AFM imaging. To do this, first prepare a 50-millimolar APS stock solution in deionized water. Store 1 milliliter aliquots of the solution at 4 degrees Celsius, until it is needed.
From the stock solution, prepare a working APS solution for mica modification by dissolving 50 microliters of the 50-millimolar APS stock in 15 milliliters of distilled deionized water. Mix the solution and then, fill a cuvette with the solution.
Next, cut 1 by 3-centimeter strips of mica from high-quality mica sheets. Check that the piece fits when place diagonally in a cuvette. Then, cleave layers of the mica until both sides are freshly cleaved and the piece is as thin as 0.1 millimeter.
Immediately place the mica piece into the APS-filled cuvette, and incubate the mica for 30 minutes. Transfer the mica piece to a cuvette filled with distilled deionized water and soak it for 30 seconds. Then, use argon to completely dry both sides of the APS-mica strip.
Apply double-faced adhesive tape to several magnetic pucks, and place them to the side. Then, cut the APS-mica substrate to 1-centimeter by 1-centimeter squares and cover them in a clean Petri dish. Next, prepare three dilutions of the assembled nucleosomes using a 0.22-micron filtered buffer containing 10-millimolar HEPES and 4-millimolar magnesium chloride at a pH of 7.5.
To limit the loss of nucleosomes at the low final concentration, the dilution should be done one at a time, immediately prior to deposition on the APS-mica.
Deposit 5 to 10 microliters of each nucleosome sample at the center of an APS-mica piece, and let them incubate for 2 minutes. Then, gently rinse the sample with 2 to 3 milliliters of distilled deionized water to remove the buffer components, and dry the deposited sample under a light flow of argon.
To begin, mount a tip on the tip holder of the AFM setup. Then, mount the first sample on the AFM stage, being careful not to contact the sample surface. Position the laser over the cantilever until its sum is at the maximum and adjust the vertical and lateral deflection values to near 0. Then, tune the AFM probe to find its resonance frequency. Adjust the drive amplitude, and set the image size to 100 by 100 nanometers. Once set up, click the Engage button to begin the approach.
When the approach is complete, gradually optimize the amplitude set point until the surface of the sample is clearly seen. Then, increase the scan size to 1 micron by 1 micron and the resolution to 512 by 512 pixels. Finally, click the Capture button to begin image acquisition.

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