This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

Die Praktiken verwendet, um die Mausgewebe zu erhalten, wurden zum Schutz der Tiere nach der zugelassenen Stelle (OPBA) der Universität von Trento (Italien), Protokoll Nr. 04-2015, gemäß Art.31 Gesetzesverordnung Nr. 26/2014. Alle Mäuse wurden am Modellorganismus der Einrichtung des Zentrums für Integrative Biologie (CIBIO), Universität Trento, Italien gehalten. Achtung: Um eine RNA-Abbau der Proben zu vermeiden, bereiten alle Puffer DEPC-behandeltem Wasser zur Minimierung von RNase Kontamination mit. 1. Herstellung von Polysomen von Whole Brains <ol><li> Sammeln von Gehirngewebe (15 min) <ol><li> Euthanize Wildtyp - Maus - Stamm C57BL / 6 mit CO 2 Ersticken für 5 min 36. Sezieren vorsichtig das Gehirn aus dem Schädel 36, legen Sie das Gewebe in ein Röhrchen von 1,5 ml und es sofort in flüssigem Stickstoff statt. Bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol></li><li> Herstellung von Lysat (30 min) <ol><li> Pulverisieren der gesamten Hirngewebe mitein Mörser und Stößel unter flüssigem Stickstoff. </li><li> Übertragen etwa 25 mg Pulver zu einem kalten Mikrozentrifugenröhrchen und sofort (das Auftauen des pulverisierten Gewebe zu vermeiden) in 0,8 ml Lysepuffer (siehe Tabelle 1) und stören die Zelle durch Auf- und Abpipettieren 25 - mal schneller. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 × g für 1 min bei 4 ° C um Zelltrümmer zu pelletieren. </li><li> Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen und halten Sie die Röhrchen auf Eis für 15 min. </li><li> Zentrifugiere die Röhrchen bei 12.000 xg für 5 min bei 4 ° C Kerne und Mitochondrien zu pelletieren. </li><li> Den Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für maximal 6 Monate oder es sofort ab. </li></ol></li><li> Saccharosegradienten Vorbereitung und Zentrifugation (2 h und 30 min) <ol><li> Wash Ultrazentrifuge Rohre ausgiebig mit RNase-freiem Wasser (Diethylpyrocarbonat behandeltem Wasser (DEPC-Wasser) oder kommerziell) eind 3% H 2 O 2 / DEPC H 2 O Lösung. </li><li> Setzen die Röhrchen auf Eis und fügen Sie 5,5 ml kalter 50% iger Saccharoselösung am Boden jedes Röhrchens (Tabelle 1 für Saccharoselösungen sehen). Sorgfältig in den der Inter um eine scharfe Interphase zu erhalten, die 15% Saccharose-Lösung tropfenweise Aufenthalt in der Nähe, bis das Rohr vollständig gefüllt ist. Wenn das Rohr vollständig gefüllt ist, schließen Sie ihn mit einem Gummistopfen in die Luft Blasenbildung zu vermeiden. </li><li> In einem kalten Raum lag sanft die Rohre horizontal nach unten und halten ihn in dieser Position für 2 Std. Nach dieser Zeit gerade langsam die Rohre zurück in die vertikale Position und legte sie auf Eis. Die Gradienten können jetzt verwendet werden. Alternativ bereiten die 15-50% Saccharose Gradientenformer einen herkömmlichen Gradienten. </li><li> In einem kalten Raum sorgfältig 1,0 ml von der Spitze des Gradienten zu entfernen und die Saccharose - Tropfen für Tropfen mit dem Cytosol - Lysat überlagern (dh der Überstand in Ste erhaltenp 1,2). </li><li> die Rohre in die Eimer Schwingbecherrotor vorsichtig absenken. Zentrifugation der Gradienten für 100 Minuten bei 180.000 × g bei 4 ° C eine Ultrazentrifuge. </li><li> Nach der Zentrifugation bei 4 ° C für 20 Minuten die Röhrchen in ihren Eimer verlassen die Gradienten zu lassen stabilisieren. </li></ol></li><li> Saccharosegradienten-Fraktionierung (2 h) <ol><li> Sorgfältig ein Ultrazentrifugenröhrchen aus der Ultrazentrifuge Rotor zu entfernen und sie auf der Sammelvorrichtung von einem Dichtegradienten Fraktionierungssystem montieren. Sammeln 1 ml Fraktionen Überwachen der Extinktion bei 260 nm mit einem UV / VIS - Detektor (siehe 1 oben). Halten Sie die gesammelten Fraktionen auf Eis. </li><li> Bereiten Sie Teilmengen von 30 bis 40 &amp; mgr; l der Fraktionen von Interesse, halten sie auf Eis, bevor sie bei -80 ° C bis Verwendung zu speichern. Nicht Aliquots oder Saccharose Fraktionen verwenden , die mehr als zwei Gefrier-Tau - Zyklen unterzogen (Abbildung 1 untere Tafel sehen). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Probenvorbereitung für die Rasterkraftmikroskopie (3 Stunden) <ol><li> Mit Band, die Glimmerplättchen abziehen. </li><li> Waschen Sie die Glimmerplättchen 3-4 mal mit DEPC-Wasser und legen Sie sie in eine kleine Petrischale. Dann trocknen Sie die Oberfläche Luft. </li><li> Decken Sie den Glimmer mit 200 ul 1 mM NiSO 4 und Inkubation für 3 min bei RT. </li><li> Entfernen Sie die Nickellösung und dann trocknen Sie die Oberfläche Luft. Führen Sie alle weiteren Schritte bei 4 ° C durch die Petrischale platziert mit dem Glimmer auf Eis. </li><li> Tauwetter ein Aliquot in 1.4.2 auf Eis erhalten und sanft die gesamte Probe tropfen auf dem Glimmer hinzufügen. Mit einer 100-200 ul Spitze, verteilt die Probe auf die gesamte Oberfläche des Glimmer. Inkubieren Sie die Probe auf Eis für 3 min. </li><li> Bedecken Sie den Glimmerplättchen tropfenweise mit 200 ul kaltem Puffer-AFM (siehe Tabelle 1) und Inkubation für 1 Stunde auf Eis. </li><li> Imaging in Flüssigkeit <ol><li> Entfernen Sie vorsichtig den Buffer-AFM und waschen Sie die Glimmerplättchen 3-4 Mals mit 200 ul kaltem Puffer-AFM zur Entfernung von überschüssigem Saccharose. Dann waschen Sie die Glimmerplättchen 3 mal mit kaltem Waschlösung (siehe Tabelle 1), die Glimmeroberfläche von einigen Mikroliter Lösung bedeckt bleibt. </li><li> Zum 3 (Bildaufnahme) zu verweisen. </li></ol></li><li> Imaging in der Luft <ol><li> Vorsichtig die Buffer-AFM entfernen und den Glimmer 3-4 mal mit 200 ul kaltem Puffer-AFM waschen Sie die überschüssige Saccharose zu entfernen. Dann waschen Sie die Glimmer 3 mal mit kaltem Waschlösung (siehe Tabelle 1) und lassen Sie das überschüssige Wasser Papier. </li><li> Lassen Sie die Probe unter der chemischen Haube teilweise offen mit der Spitze der Petrischale zu trocknen. Nach 2 Stunden, schließen Sie die Petrischale und lagern bei RT. Messen Sie die Probe nach 2-3 Stunden, da sie seit Jahren stabil sind. </li></ol></li></ol> 3. Bildaufnahme (15 min pro Bild nach der thermischen Stabilisierung) Anmerkung: Polysomen an immobilisierte Glimmer kann in Luft oder in flüssiger abgebildet werden, AC-Modus. <ol><li> Bringen Sie den Glimmer an den Probenhalter mit doppelseitigem Klebeband. </li><li> Setzen Sie den Probenhalter in der AFM-Bühne Richtungen folgenden Hersteller. Wenn Bildgebung in Flüssigkeit, wenn möglich, versuchen, die Probe bei einer Temperatur unter 25 ° C zu halten Polysomen-Stabilität mit der Zeit zu erhöhen. </li><li> Wählen Sie einen Ausleger geeignet für AC-Bildgebung und montieren Sie ihn an der Spitze des Inhabers Richtungen folgenden Hersteller. Hierbei kann die Verwendung Auslegern mit Kraftkonstante zwischen 2-20 N / m für Luft-Bildgebung und etwa 0,1 N / m für flüssige Bildgebung. </li><li> Stellen Sie den Laserpunkt auf dem Ausleger und Null die Quadranten Detektorsignale. </li><li> Wählen Sie ein opportun Ansteuerfrequenz und Antrieb des Auslegers mit einer Amplitude von 10-20 nm. </li><li> Nähern Sie sich die Probe, bis die Spitze die Oberfläche angreift. </li><li> Wählen Sie einen Scanbereich von 2x2 um, erwerben mindestens 512x512 Pixel-Bilder (Pixelbreite &lt;4 nm), wählen Sie eine Live-Untergrundsubtraktion-Modus und eine Z-Skala von 20 bis 25 nm. </li><li> Überprüfen Sie ter betrachtet für das Vorhandensein von runden Objekten durch die Höhe charakterisiert zwischen 10 und 15 nm, wenn in Luft und 25 und 30 nm, wenn sie in Flüssigkeit und der Breite im Bereich von 25-30 nm zu erwerben. Passen Sie die Soll- und Istwert Parameter bis scharfe Gegenstände sichtbar gemacht werden. Der Hintergrund sollte relativ flach erscheinen in guten Proben, mit einigen 2-4 nm Höhe Objekten (siehe 2A und B). </li><li> Wenn das Bild gut aussieht (wie bei Punkt 3.8 angegeben), erwerben mehrere (mindestens zehn) 2x2 Mikron-Scans an unterschiedlichen Probenbereiche. </li><li> (Optional). Falls erforderlich, hochauflösende Bilder von ausgewählten Polysomen erwerben (siehe Abbildung 2C). </li><li> Anwenden Softwarekorrekturen (Ebene Subtraktion und line-by-line Korrekturalgorithmen) die AFM-Bilder zu entfernen beliebige Neigung und driften Effekte zu korrigieren. </li></ol> 4. Datenanalyse (30 min pro Bild) <ol><li> Export von Bildern in ImageJ (optional: Anwendung eines Skalierungsfaktors) preferentmathematisch eine verlustfreie Komprimierung Format, zB das TIFF - Format (siehe 3A). </li><li> Verwenden Sie das ImageJ Makro Toolset RiboPick.ijm (in der ImageJ Makro / Toolset Unterverzeichnis kopiert werden) an Ribosomen in Polysomen (siehe Abbildung 3B) und berechnen statistische Eigenschaften der Probe zählen (siehe Abbildung 3C). <ol><li> Starten Sie ein Bild Laden mit dem &lt;lesen image&gt; Werkzeug, das das Programm initialisiert. </li><li> Wählen Sie die Ribosomen-Zentren mit dem Standard ImageJ &lt;Punkt Auswahl&gt; Werkzeug (Shift + Linksklick ermöglicht die Multiselektion von Ribosomen). Markieren Sie die ausgewählten Ribosomen mit dem &lt;Mark Ribosomen&gt; Werkzeug. Ribosome Koordinaten werden in einem benutzerdefinierten Textfenster angezeigt. </li><li> Fügen Sie mehr Ribosomen an die gleiche Polysoms Wiederholung des Verfahrens an dem Punkt 4.2.2 angegeben. </li><li> Entfernen Sie falsch markierte Ribosomen mit der &lt;Undo letzte Pick&gt; Werkzeug (beginnt mit dem zuletzt hinzugefügten Ribosom zum ersten Entfernen212; im aktuellen Polysoms nur). </li><li> Wenn die Polysoms abgeschlossen ist, verwenden Sie die &lt;New Polysoms&gt; Werkzeug. Da die Polysomen-Nummer als Overlay zu dem Bild hinzugefügt wird, wird das Textfenster aktualisiert. </li><li> Mit &lt;Ergebnisse speichern und schließen&gt; das Ribosom-Koordinaten-Datei zu schreiben (die Standardeinheiten des Bildes verwendet werden) und ein PNG-Bild, das das aufgenommene Ribosomen und Polysomen zusammenfasst. Das Originalbild wird geschlossen, ohne gespeichert zu werden. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Da die Struktur der DNA bewiesen wurde von größter Bedeutung sein, den Prozess der Transkription und die Organisation von Chromatin voran unser Verständnis der Transkriptionskontrolle der Genexpression zu beschreiben, ist es wichtig, die Organisation und Struktur der Polysomen zu analysieren, um die wahrheitsgemäße Verständnis zu verbessern der Übersetzung und deren Regulierung. Mit dem beschriebenen Protokoll wird eine optimale Dichte von Polysomen sanft auf eine flache Oberfläche i...

Die Synthese von Protein ist der energieverbrauchenden Prozess in Zellen 1,2. Daher ist es nicht verwunderlich , dass Protein Abundanzen vor allem auf der Translations gesteuert werden , anstatt Transkriptionsebene 3,4,5. Die Polysoms ist die grundlegende Komponente, die die hochmolekularen mRNA Information in funktionelle proteinöse Ablesungen umwandelt. Polysomen werden so weit als makromolekulare Komplexe erkannt , wo mehrere Translations Kontrollen 13.06 konvergieren. Trotz Hunderten von Studien über die Ribosomenstruktur 14- 16, die detaillierte molekulare Einblicke in die Dynamik der Übersetzung und die Topologie von Polysomen hat ein begrenztes Interesse gestoßen. Als Folge davon sind die Organisation des nativen polysomaler Ribonukleoproteinkomplex und seine möglichen Auswirkungen auf die Übersetzung noch ziemlich unklar Fragen. Polysomen kann noch unbekannt bestellt und funktionale Organisationen verbergen, potenziell Spiegelung was Nukleosomen und epigenetische controls haben für die Transkription Feld dargestellt. Tatsächlich erfordert die Untersuchung dieser faszinierenden Hypothese zusätzliche Studien und neue technische Ansätze. In dieser Zeile können zusammenarbeiten , um Strukturtechniken und Rasterkraftmikroskopie fruchtbarer neue Mechanismen entwirren für die Genexpression steuern, ähnlich zu dem, was für die Nukleosomen 17,18 erreicht. Seit der Entdeckung des Ribosoms 14-16 hat seine Struktur wurde in Prokaryoten 19,20, Hefe 21 und in jüngerer Zeit in der Human 22, die Bereitstellung der molekulare Beschreibung der Mechanismen an der Basis der Proteinsynthese umfassend charakterisiert. Polysomen wurden zunächst auf die Membran des endoplasmatischen Retikulums erkannt, typische 2D geometrische Organisationen 14 bilden. Wie bereits erwähnt, hat Polysoms Montage Gegenstand ständiger Interesse, wie die Ribosomenstruktur nicht gewesen. In der Vergangenheit Polysomen wurden im wesentlichen durch tr studiertansmission EM-basierte Techniken. Erst vor kurzem freigegeben Kryo-EM - Techniken , um die 3D - Rekonstruktion von gereinigtem Polysomen von in - vitro - Translationssysteme 23-26, menschliche Zellysaten 27 oder in den Zellen 28. Diese Techniken angeboten verfeinerte Information über das Ribosom-Ribosomen Organisation in Polysomen 23, 26-28 und eine vorläufige molekulare Beschreibung der Kontaktflächen benachbarter Ribosomen in Weizenkeim Polysomen 24. Somit ermöglicht Kryo-EM-Tomographie die Offenlegung von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen mit molekularen Detail, aber es ist durch umfangreiche Nachbearbeitung belastet und Rekonstruktion Analysen, erfordern schwere Rechenressourcen für die Datenverarbeitung. Darüber hinaus wird die molekulare Detail von Ribosomen Ribosomen Wechselwirkungen, eine hochaufgelöste Karte des Ribosoms zu erhalten erforderlich, und diese Art von Referenz Ribosom ist nur für wenige Arten. Wichtig ist, dass Kryo-EM-Tomographie freie RNA nachzuweisen nicht in der Lage. d daherErz, werden neue Techniken benötigt, um vollständig die Organisation der Translationsmaschinerie zu verstehen. Neben Kryo-EM wurde AFM auch als ein nützliches Werkzeug für die direkte Abbildung von Polysomen in niederen Eukaryoten 29-33 und Menschen 27 eingesetzt. Im Vergleich zu EM, erfordert AFM keine Probe Fixierung oder Kennzeichnung. Darüber hinaus können Messungen in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und mit der einzigartigen Möglichkeit , beide Ribosomen und nackter RNA - Stränge 27 eindeutig zu identifizieren. Abbildung einzelner Polysomen kann relativ schnell durchgeführt werden, Tausende von Bildern auf der nano-Auflösung mit wenig Nachbearbeitung Aufwand im Vergleich zu der umfangreichen und schweren Nachbearbeitung Erhalt und Wiederaufbau Analysen durch Kryo-EM-Mikroskopie erforderlich. Folglich stellt AFM Datenverarbeitung und Analyse nicht teuer Workstations benötigen und eine hohe Rechenleistung. Als solches sammelt sich diese Technik Informationen über polysomaler Formen, morphologischen Eigenschaften (wieHöhe, Länge und Breite), Ribosom Dichten, das Vorhandensein von freien RNA und die Anzahl der Ribosomen pro Polysomen 27 mit einem höheren Durchsatz als Kryo-EM. In einer solchen Weise stellt AFM eine leistungsfähige und komplementären Ansatz Techniken zur EM Polysomen zu porträtieren 27. Hier präsentieren wir eine komplette Pipeline von der Reinigung bis zur Datenanalyse in dem AFM Bild angewendet wird und Mausgehirn Polysomen analysieren. Das vorgeschlagene Protokoll konzentriert sich auf die Reinigung Fragen und auf die genaue Ablagerung von Polysomen auf Glimmersubstraten, die für AFM-Bildgebung verwendet werden. Zusätzlich zu den herkömmlichen Partikelanalyse , die leicht mit gängigen Software ausgeführt werden können , von der AFM - Gemeinschaft verwendet wird , ein ImageJ 34 - Plugin, genannt RiboPick wird zum Zählen der Anzahl von Ribosomen pro Polysoms 27 präsentiert, 35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89836</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock RNAse Inhibitor</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>EO-0381</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40718</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Sucrose gradient preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima LE-80K</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW 41 Ti</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Fractionation System&#160;</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td>67-9000-176</td>
			<td>Sucrose gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>Cypher</td>
			<td>Polysome visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

Die Translationsmaschinerie, dh die Polysoms oder Polyribosom, ist eines der größten und komplexesten Cytoplasma - Maschinen in den Zellen. Polysomen, von Ribosomen gebildet, mRNAs, mehrere Proteine ​​und nicht-kodierenden RNAs repräsentieren Plattformen integriert die translationale Kontrollen stattfinden. Während jedoch das Ribosom wurde weitgehend untersucht, die Organisation von Polysomen noch fehlt umfassendes Verständnis. So viel Aufwand ist erforderlich, um Polysoms Organisation und jede neuen Mechanismus der Translationskontrolle aufzuklären, die eingebettet werden können. Rasterkraftmikroskopie (AFM) ist eine Art von Rastersondenmikroskopie, welche die Erfassung von 3D-Bildern in nanoskaliger Auflösung ermöglicht. Im Vergleich zu der Elektronenmikroskopie (EM) Techniken, einer der wichtigsten Vorteile von AFM ist, dass es Tausende von Bildern sowohl in der Luft als auch in Lösung zu erwerben, so dass die Probe aufrecht erhalten werden unter nahezu physiologischen Bedingungen, ohne dass für die Färbung und Fixierung Proverfahren. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die genaue Reinigung von Polysomen aus Gehirn der Maus und ihre Abscheidung auf Glimmersubstraten beschrieben. Dieses Protokoll ermöglicht Polysomen-Bildgebung in Luft und Flüssigkeit mit AFM und deren Rekonstruktion dreidimensionaler Objekte. Ergänzend zur Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) kann das vorgeschlagene Verfahren günstig für die systematische Analyse Polysomen verwendet werden, und ihre Organisation zu studieren.

Saccharosegradienten polysomaler Profilierung der gesamten Gehirn der Maus Es ist möglich, Polysomen aus einem zellulären Lysat durch polysomaler Profilierung zu reinigen, die Makromoleküle entsprechend ihrem Gewicht und Größe trennt. Mit polysomaler Profilierung zytoplasmatischen Lysate aus kultivierten Zellen oder Geweben erhalten werden, wie in diesem Beispiel, werden auf einem lineare...

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Aufrufe.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Serie: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

State-Dependency Auswirkungen auf TMS: Ein Blick auf Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Forschung

Neurowissenschaften

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Fokussierten Ionenstrahl-Fräs-und Rasterelektronenmikroskopie des Hirngewebes

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Funktionelle Bildgebung mit Ultraschall-Blut-Hirnschranke Störung und Mangan-MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Genetische Manipulation von Kleinhirnkörnerzellen<em&gt; In-vitro-</em&gt; Und<em&gt; In Vivo</em&gt;, Um neuronale Morphologie und Migration Studieren

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Das olfaktorische System als Modell zur Axonal Wachstumsmuster und Morphologie Studieren<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Charakterisieren Multiskalige Mechanische Eigenschaften von Gehirngewebe mittels Rasterkraftmikroskopie, Schlag Einrückungen und Rheometrie

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Automatisierte Ganganalyse bei Mäusen mit chronischen Verengung Verletzungen

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.