This research was supported by the AXonomIX research project financed by the Provincia Autonoma di Trento, Italy.

Le pratiche utilizzate per ottenere i tessuti di topo sono stati approvati dal corpo per la protezione degli animali (OPBA) dell&#39;Università degli Studi di Trento (Italia), il protocollo n. 04-2015, il decreto di cui al art.31 legislativo n. 26/2014. Tutti i topi sono stati mantenuti al Organismo modello Struttura del Centro per la Biologia Integrata (CIBIO), Università degli Studi di Trento, Italia. Attenzione: Per evitare qualsiasi degradazione dell&#39;RNA dei campioni, preparare tutti i buffer con acqua DEPC trattati per ridurre al minimo la contaminazione RNasi. 1. Preparazione di polisomi da Brains Interi <ol><li> Raccolta di tessuti cerebrali (15 min) <ol><li> Euthanize wild-type ceppo di topi C57BL / 6 con CO 2 asfissia per 5 min 36. Sezionare accuratamente il cervello dal cranio 36, posizionare il tessuto in una provetta da 1,5 ml e metterlo immediatamente in azoto liquido. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione del lisato (30 min) <ol><li> Polverizzare l&#39;intero tessuto cerebrale utilizzandoun mortaio e pestello sotto azoto liquido. </li><li> Trasferire circa 25 mg di polvere in una provetta fredda e immediatamente (per evitare lo scongelamento del tessuto polverizzato) aggiungere 0,8 ml di tampone di lisi (vedi Tabella 1) e disturbare la cella pipettando su e giù 25 volte rapidamente. </li><li> Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 1 min a 4 ° C per sedimentare detriti cellulari. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta e mantenere il tubo in ghiaccio per 15 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 12,000 xg per 5 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e mitocondri. </li><li> Trasferire il surnatante in una nuova provetta. </li><li> Conservare il supernatante a -80 ° C per un massimo di 6 mesi o utilizzare immediatamente. </li></ol></li><li> Saccarosio preparazione gradiente e centrifugazione (2 ore e 30 min) <ol><li> tubi ultracentrifuga Lavare a lungo con RNase-free acqua (acqua trattata dietilpirocarbonato (DEPC-acqua) o commerciale) di und 3% H 2 O / DEPC H soluzione 2 O 2. </li><li> Mettere i tubi in ghiaccio e aggiungere 5,5 ml di soluzione di saccarosio al 50% freddo nella parte inferiore di ciascun tubo (vedi Tabella 1 per soluzioni di saccarosio). Aggiungere con cautela la caduta di soluzione di saccarosio al 15% a goccia, rimanendo vicino al interfase per preservare un interfase tagliente, finché il tubo sia completamente riempito. Quando il tubo viene riempito completamente, chiuderla con un tappo di gomma per evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> In una stanza fredda delicatamente fissare i tubi in orizzontale e tenerlo in questa posizione per 2 ore. Trascorso questo tempo, lentamente raddrizzare i tubi nella posizione verticale e metterli in ghiaccio. I gradienti sono ora pronti per essere utilizzati. In alternativa, preparare il gradiente di saccarosio 15-50% utilizzando un gradiente convenzionale ex. </li><li> In una stanza fredda rimuovere attentamente 1,0 ml dalla sommità del gradiente e sovrapporre la goccia di saccarosio a goccia con il lisato citosolica (cioè, il supernatante ottenuto in step 1.2). </li><li> Abbassare con cautela i tubi nei secchi di rotore oscillante. Centrifugare i gradienti per 100 min a 180.000 xg a 4 ° C usando un&#39;ultracentrifuga. </li><li> Dopo la centrifugazione, lasciare i tubi in loro secchi per 20 min a 4 ° C per consentire ai gradienti stabilizzano. </li></ol></li><li> frazionamento gradiente di saccarosio (2 ore) <ol><li> Rimuovere con cautela un tubo ultracentrifuga dal rotore ultracentrifuge e montarlo sul dispositivo di raccolta di un gradiente di densità frazionamento del sistema. Raccogliere 1 ml frazioni di monitoraggio l&#39;assorbanza a 260 nm con una VIS ​​rivelatore UV / (vedi figura 1 pannello superiore). Mantenere le frazioni raccolte sul ghiaccio. </li><li> Preparare aliquote di 30-40 ml delle frazioni di interesse, tenerli in ghiaccio prima di riporli a -80 ° C fino all&#39;uso. Non utilizzare aliquote o frazioni di saccarosio che hanno subito più di due cicli di gelo-disgelo (vedi Figura 1 inferiore del pannello). </li></ol> &lt;/ Li&gt; </ol> 2. Preparazione del campione per la microscopia a forza atomica (3 ore) <ol><li> Con del nastro, staccare i fogli di mica. </li><li> Lavare i fogli di mica 3-4 volte con DEPC-acqua e metterlo in una piccola capsula di Petri. Quindi asciugare la superficie con l&#39;aria. </li><li> Coprire la mica con 200 ml di 1 mM Niso 4 e incubare per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione di nichel e poi asciugare la superficie con l&#39;aria. Eseguire tutte le fasi future a 4 ° C mettendo la piastra di Petri con la mica su ghiaccio. </li><li> Scongelare una aliquota ottenuta in 1.4.2 su ghiaccio e delicatamente aggiungere tutti della goccia campione goccia sulla mica. Utilizzando una punta 100-200 microlitri, spalmare il campione su tutta la superficie della mica. Incubare il campione in ghiaccio per 3 min. </li><li> Coprire la goccia foglio di mica a goccia con 200 ml freddo Buffer-AFM (vedi Tabella 1) e incubare per 1 ora su ghiaccio. </li><li> Imaging a liquido <ol><li> Rimuovere con attenzione il Buffer-AFM e lavare i fogli di mica 3-4 tempos con 200 ml freddo Buffer-AFM per rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio. Poi lavare i fogli di mica 3 volte con tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1), lasciando la superficie di mica ricoperta da alcuni microlitri di soluzione. </li><li> Vai al punto 3 (acquisizione immagine). </li></ol></li><li> Imaging in aria <ol><li> Rimuovere con cautela il Buffer-AFM e lavare la mica 3-4 volte con 200 pl freddo Buffer-AFM per rimuovere l&#39;eccesso di saccarosio. Poi, lavare il mica 3 volte con soluzione di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1) e scaricare l&#39;acqua in eccesso con carta. </li><li> Lasciare asciugare il campione sotto il cofano chimica con la parte superiore della scatola di Petri parzialmente aperta. Dopo 2 ore, chiudere la piastra di Petri e conservare a temperatura ambiente. Misurare il campione dopo 2-3 ore come sono stabili per anni. </li></ol></li></ol> 3. Acquisizione di immagini (15 min per immagine dopo la stabilizzazione termica) Nota: polisomi immobilizzati su mica possono essere esposte in aria o in liquido, utilizzando la modalità AC. <ol><li> Fissare la mica a supporto del campione con del nastro biadesivo. </li><li> Inserire il supporto del campione nella fase AFM seguendo le indicazioni del produttore. Quando l&#39;imaging in liquido, se possibile, cercare di mantenere il campione ad una temperatura inferiore a 25 ° C per aumentare polysome stabilità nel tempo. </li><li> Selezionare un cantilever adatta per l&#39;imaging CA e montarlo sul supporto punta seguendo le indicazioni del produttore. Qui, l&#39;uso cantilever con forza costante tra 2-20 N / m per l&#39;imaging e l&#39;aria intorno a 0,1 N / m per l&#39;imaging liquido. </li><li> Regolare il punto laser sulla mensola e azzerare i segnali rivelatori quadrante. </li><li> Selezionare una frequenza di pilotaggio opportune e guidare il cantilever con un&#39;ampiezza di 10-20 nm. </li><li> Approccio il campione fino a quando la punta impegna la superficie. </li><li> Selezionare un&#39;area di scansione di 2x2 micron, acquisire almeno 512x512 pixel immagini (larghezza in pixel &lt;4 nm), selezionare una modalità di sottrazione dello sfondo dal vivo e una scala Z di 20-25 nm. </li><li> ispezionare tsi cerca di immagine per la presenza di oggetti rotondi caratterizzati dalla altezza tra 10 e 15 nm quando l&#39;acquisizione in aria e 25 e 30 nm quando nel liquido e la larghezza nell&#39;intervallo 25-30 nm. Regolare i parametri di setpoint e un giudizio fino ad oggetti appuntiti sono visualizzati. Lo sfondo deve apparire relativamente piatta in buoni campioni, con alcuni oggetti di altezza 2-4 nm (vedi Figura 2A e B). </li><li> Se l&#39;immagine sembra buono (come indicato al punto 3.8), acquisire diversi (almeno dieci) scansioni 2x2 micron a diverse aree campione. </li><li> (opzionale). Se necessario, acquisire immagini ad alta risoluzione di polisomi selezionati (vedi Figura 2C). </li><li> Applicare correzioni software (piano sottrazione e line-by-line algoritmi di correzione) per correggere le immagini AFM rimozione inclinazione arbitraria e alla deriva effetti. </li></ol> 4. Analisi dei dati (30 min per immagine) <ol><li> esportare immagini in ImageJ (opzionale: applicare un fattore di scala) Preferentbuona resa utilizzando un formato di compressione senza perdita di dati, ad esempio, il formato TIFF (vedi Figura 3A). </li><li> Utilizzare la macro set di strumenti RiboPick.ijm ImageJ (da copiare nella macro / set di strumenti sottodirectory ImageJ) per contare ribosomi in polisomi (vedi Figura 3B) e calcolare le proprietà statistiche del campione (vedi Figura 3C). <ol><li> Inizia il caricamento di un&#39;immagine utilizzando il &lt;Leggi image&gt; strumento che inizializza il programma. </li><li> Scegli i centri ribosoma con il &lt;selezione Point&gt; standard di ImageJ strumento (shift + click sinistro consente la selezione multipla dei ribosomi). Segnare i ribosomi selezionati con il &lt;Mark ribosomi&gt; strumento. coordinate Ribosoma verranno visualizzati in una finestra di testo personalizzato. </li><li> Aggiungere più ribosomi allo stesso polysome ripetendo la procedura indicata al punto 4.2.2. </li><li> Rimuovere ribosomi erroneamente contrassegnati con l&#39;&lt;Annulla l&#39;ultima scelta&gt; strumento (inizia la rimozione dall&#39;ultimo ribosoma aggiunto al primo212; nel polysome corrente). </li><li> Quando la polysome è completata, utilizzare il &lt;Nuovo polysome&gt; strumento. Come si aggiunge il numero polysome come una sovrapposizione all&#39;immagine, viene aggiornata la finestra di testo. </li><li> Utilizzare il &lt;Salva risultati e vicino&gt; di scrivere il ribosoma un&#39;immagine PNG che riassume ribosomi e polisomi la raccolte di file (le unità predefinite dell&#39;immagine vengono utilizzati) e coordina. L&#39;immagine originale è chiuso senza essere salvato. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscope+studies+of+ribosomal+clusters+synthesizing+hemoglobin.">Electron microscope studies of ribosomal clusters synthesizing hemoglobin.</a> Science. 138, 1399-1403 (1962).</li><li>Yazaki, K., Yoshida, T., Wakiyama, M., Miura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysomes+of+eukaryotic+cells+observed+by+electron+microscopy.">Polysomes of eukaryotic cells observed by electron microscopy.</a> J. Electron Microsc (Tokyo). 49, 663-668 (2000).</li></ol>

The authors have no competing financial interests in this paper and nothing to disclose.

Poiché la struttura del DNA è stato dimostrato di essere di fondamentale importanza per descrivere il processo di trascrizione e l&#39;organizzazione della cromatina avanzata nostra comprensione di controllo trascrizionale dell&#39;espressione genica, è essenziale analizzare l&#39;organizzazione e la struttura dei polisomi per migliorare la comprensione veritiera della traduzione e la sua regolazione. Con il protocollo descritto, una densità ottimale di polisomi delicatamente immobilizza...

La sintesi delle proteine ​​è la più processo consumo di energia nelle cellule 1,2. Quindi, non è sorprendente che abbondanza di proteine ​​sono controllate principalmente al traslazionale piuttosto che 3,4,5 livello trascrizionale. Il polysome è il componente macromolecolare fondamentale che converte le informazioni mRNA in letture proteici funzionali. Polisomi sono finora riconosciuti come complessi macromolecolari dove diversi controlli traslazionali convergono 6-13. Nonostante centinaia di studi sulla struttura dei ribosomi 14- 16, le intuizioni molecolari dettagliata delle dinamiche della traduzione e della topologia di polisomi è verificato un interesse limitato. Di conseguenza, l&#39;organizzazione del complesso polisomale ribonucleoproteico nativo e il suo potenziale effetto sulla traduzione sono ancora problemi piuttosto oscuri. Polisomi possono nascondere ancora organizzazioni ordinate e funzionali sconosciuti, potenzialmente mirroring quali nucleosomi e Contro epigeneticols hanno rappresentato per il campo di trascrizione. In effetti, l&#39;indagine di questa ipotesi intrigante richiede ulteriori studi e nuovi approcci tecnici. In questa linea, le tecniche strutturali e microscopia a forza atomica possono proficuamente collaborare per svelare nuovi meccanismi per il controllo dell&#39;espressione genica, in modo simile a quanto realizzato per il nucleosoma 17,18. Dalla scoperta del ribosoma 14-16, la sua struttura è stata ampiamente caratterizzata procarioti 19,20, lievito 21 e più recentemente in umano 22, fornendo la descrizione molecolare dei meccanismi alla base della sintesi proteica. Polisomi sono stati inizialmente rilevati sulla membrana del reticolo endoplasmatico, formando organizzazioni geometriche 2D tipici 14. Come accennato prima, polysome assembly non è stato oggetto di interesse costante come la struttura ribosoma. In passato, polisomi sono stati studiati essenzialmente trtecniche asmissione EM-based. Solo di recente, le tecniche di crio-EM hanno consentito la ricostruzione 3D della polisomi purificati dai sistemi in vitro di traduzione 23-26, lisati cellulari umani 27 o 28 nelle cellule. Queste tecniche offerto informazioni più raffinata sull&#39;organizzazione ribosoma-ribosoma in polisomi 23, 26-28 e una descrizione molecolare preliminare delle superfici di contatto dei ribosomi adiacenti in polisomi germe di grano 24. Così, Cryo-EM tomografia permette la divulgazione delle interazioni ribosoma-ribosoma con dettaglio molecolare, ma è gravata da un ampio post-elaborazione e analisi di ricostruzione che richiedono risorse di calcolo pesanti per la gestione dei dati. Inoltre, per ottenere dettaglio molecolare delle interazioni ribosoma-ribosoma, è necessaria una mappa altamente risolto del ribosoma, e questo tipo di ribosoma riferimento è disponibile solo per poche specie. È importante sottolineare che, Cryo-EM tomografia non è in grado di rilevare l&#39;RNA libero. Therefminerale, nuove tecniche sono necessari per comprendere appieno l&#39;organizzazione della macchina di traduzione. Accanto a Cryo-EM, AFM è stato anche impiegato come uno strumento utile per l&#39;imaging diretto di polisomi negli eucarioti inferiori 29-33 e gli esseri umani 27. Rispetto a EM, AFM non richiede la fissazione del campione o l&#39;etichettatura. Inoltre, le misurazioni possono essere eseguite in condizioni fisiologiche vicino e con la possibilità unica di individuare chiaramente sia ribosomi e filamenti di RNA nudi 27. Imaging singoli polisomi può essere eseguita in tempi relativamente brevi, ottenendo migliaia di immagini a nano risoluzione con poco sforzo di post-trattamento rispetto al vasto e pesante post-elaborazione e ricostruzione delle analisi previste dalla crioconservati microscopia-EM. Di conseguenza, AFM manipolazione e l&#39;analisi dei dati non ha bisogno di posti di lavoro costosi e potenza di calcolo. Come tale, questa tecnica raccoglie informazioni su forme polisomale, caratteristiche morfologiche (ad esempioaltezza, lunghezza e larghezza), densità ribosoma, la presenza di RNA libero e il numero dei ribosomi per polysome 27 con un volume maggiore di crio-EM. In tal modo, AFM rappresenta un approccio potente e complementare alle tecniche EM per ritrarre polisomi 27. Qui vi presentiamo una pipeline completa da purificazione per l&#39;analisi dei dati in cui AFM viene applicata all&#39;immagine e analizzare il mouse polisomi cerebrali. Il protocollo proposto concentra sui problemi di depurazione e sulla deposizione accurata di polisomi su substrati mica che vengono utilizzati per l&#39;imaging AFM. Oltre all&#39;analisi delle particelle convenzionale che può essere facilmente effettuata con il software comune usato dalla comunità AFM, un plugin ImageJ 34, chiamato RiboPick, viene presentato per il conteggio del numero dei ribosomi per polysome 27, 35.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>01810</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAseI</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>89836</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RiboLock RNAse Inhibitor</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>EO-0381</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>40718</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8532</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td>Prepararation of lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5016</td>
			<td>Sucrose gradient preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima LE-80K</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SW 41 Ti</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyallomer tube</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td>Sucrose gradient centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Density Gradient Fractionation System&#160;</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td>67-9000-176</td>
			<td>Sucrose gradient fractionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>Asylum Research</td>
			<td>Cypher</td>
			<td>Polysome visualization</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peering at brain polysomes with atomic force microscopy

Il meccanismo di traslazione, cioè il polysome o polyribosome, è uno dei più grandi e complessi macchinari citoplasmatici nelle cellule. Polisomi, formate dai ribosomi, mRNA, diverse proteine ​​e RNA non codificanti, rappresentano le piattaforme in cui i controlli di traslazione avvengono integrati. Tuttavia, mentre il ribosoma è stato ampiamente studiato, l&#39;organizzazione di polisomi è ancora carente comprensione globale. Così molto sforzo è necessaria per chiarire organizzazione polysome e ogni nuovo meccanismo di controllo traduzionale che potrebbe essere incorporato. microscopia a forza atomica (AFM) è un tipo di scansione di sonda microscopio che permette l&#39;acquisizione di immagini 3D con risoluzione nanometrica. Rispetto alle tecniche di microscopia elettronica (EM), uno dei principali vantaggi di AFM è che può acquisire migliaia di immagini sia in aria ed in soluzione, consentendo il campione da mantenere in condizioni fisiologiche vicino senza alcuna necessità di colorazione e fissaggio proprocedure. Qui, un protocollo dettagliato per la purificazione accurata polisomi da cervello di topo e la loro deposizione su substrati di mica è descritto. Questo protocollo permette l&#39;imaging polysome in aria e liquidi con AFM e loro ricostruzione come oggetti tridimensionali. Complementare alla microscopia crioelettronica (crio-EM), il metodo proposto può essere comodamente utilizzato per analizzare sistematicamente polisomi e studiare la loro organizzazione.

Il saccarosio gradiente polisomale profiling dell&#39;intero cervello di topo È possibile purificare polisomi da un lisato cellulare mediante profilatura polisomale, che separa macromolecole conformemente al loro peso e dimensioni. Con profiling polisomale, lisati citoplasmatici ottenuti da cellule o tessuti coltivati, come in questo esempio, vengono caricati su un gradiente di saccarosio lineare e trattati d...

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Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid.

Scrutando Cervello polisomi con microscopia a forza atomica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Views.  Fondazione Bruno Kessler. While ribosome structure has been extensively characterized, the organization of polysomes is still understudied. To overcome this lack of knowledge, we present here a detailed preparation protocol for accurate imaging of mammalian polysomes by atomic force microscopy (AFM) in air and liquid. 

Video: Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Stato-dipendenza Effetti sulla TMS: uno sguardo al comportamento Motive fosfene

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Ricerca

Neuroscienze

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Neuroimaging funzionale con l&#39;impiego dell&#39;ecografia emato-encefalica e la barriera di Turbativa del Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Experimental Demyelination and Remyelination of Murine Spinal Cord by Focal Injection of Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost oligodendrocytes, myelin, axons, and neurons. Remyelination is an endogenous repair mechanism whereby new myelin is produced subsequent to proliferation, recruitment, and differentiation of oligodendrocyte precursor cells into myelin-forming oligodendrocytes, and is necessary to protect axons from further damage. Currently, all therapeutics for the treatment of multiple sclerosis target the aberrant immune component of the disease, which reduce inflammatory relapses but do not prevent progression to irreversible neurological decline. It is therefore imperative that remyelination-promoting strategies be developed which may delay disease progression and perhaps reverse neurological symptoms. Several animal models of demyelination exist, including experimental autoimmune encephalomyelitis and curprizone; however, there are limitations in their use for studying remyelination. A more robust approach is the focal injection of toxins into the central nervous system, including the detergent lysolecithin into the spinal cord white matter of rodents. In this protocol, we demonstrate that the surgical procedure involved in injecting lysolecithin into the ventral white matter of mice is fast, cost-effective, and requires no additional materials than those commercially available. This procedure is important not only for studying the normal events involved in the remyelination process, but also as a pre-clinical tool for screening candidate remyelination-promoting therapeutics.

Demyelinating diseases can be modeled in animals by focal application of lysolecithin into the CNS. A single injection of lysolecithin into mouse spinal cord produces a lesion that spontaneously repairs over time. The goal is to study factors involved in de- and remyelination, and to test agents for enhancing repair.

Demielinizzazione sperimentale e rimielinizzazione di Murine midollo spinale da iniezione focale Lysolecithin

Multiple sclerosis is an inflammatory demyelinating disease of the central nervous system characterized by plaque formation containing lost ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

La caratterizzazione delle proprietà meccaniche del multiscala cervello tessuti utilizzando microscopia a forza atomica, Impatto rientro, e Reometria

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Automated Gait Analysis in Mice with Chronic Constriction Injury

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some disadvantages such as subjective data and the requirement of a skilled, experienced experimenter. To date, a variety of modifications have improved the von Frey method, but it still has a few limitations. Recent reports have suggested that gait analysis produces more accurate and objective data from the neuropathic animals. This protocol demonstrates how to perform the automated gait analysis to determine the degree of neuropathic pain in mice. After several days of acclimation, the mice were allowed to walk freely on the glass floor to illuminate footprints. Then, quantification of the footprints and gait were performed through video clips with automatic analysis of various walking parameters, such as area of paw print, swing time, angle of paw, etc.
The main purpose of this study is to describe the methodology of automated gait analysis and briefly compare it with data from the classical sensory test using von Frey filament.

The precise assessment of pain response in a neuropathic animal model is critical to investigate the pathophysiology of pain diseases and develop new analgesics. We present a sensitive and objective method to determine the sensory function of the rodent hind paw by an automated gait analysis system.

Analisi automatizzata di andatura in topi con lesione da costrizione cronica

The von Frey test is a classical method that has been widely used to examine the sensory function of neuropathic pain animals. However, it has some ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.