نشكر الدكتور دوريس ك وو لالبلازميدات التعبير وفي تحقيقات الموقع، ومركز جامعة جونز هوبكنز للمنشأة الأحياء التصوير الحسي ومركز السمع والتوازن. وأيد هذا العمل من قبل NIDCD غرانت T32 DC000023 جنيه

تتم رعاية البيض والأجنة لم يفقس لومعاملة أخلاقية وإنسانية. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات للاستخدام الجنين لم يفقس من قبل رعاية الحيوان واستخدام اللجنة في كلية جونز هوبكنز للطب في بالتيمور بولاية ماريلاند. 1. البيض وإعداد التركيبات التعبير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيض: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان 3-4 عشرات المخصبة بيض الدجاج (جالوس جالوس) الاستلقاء على جنوبهم عند 37 درجة مئوية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24 ساعة من الحضانة، وسحب 3 سم مكعب من زلال مع حقنة من النهاية الخلفية وإيابا للبيضة واغلاق فتحة مع الشريط واضح. وهذا يخلق غرفة الهواء بين الجنين وقشر البيض، والسماح لسهولة الوصول إلى الجنين دون الجنين التمسك قذيفة عند قطع نافذة للوصول على أعلى من البيض 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 117 ساعة من وقت الحضانة، مرحلة الأجنة وفقا للهمبرغر وهاميلتون 20 مراحل النموفي E4 (HH24-25) (انظر الشكل 1D). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بنيات التعبير: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد البلازميد باستخدام الكواشف وبروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للإعداد ملف المتاحة تجاريا. في الخطوة الأخيرة من الإعداد، أزل الحمض النووي في 500 ميكرولتر TE (تريس، EDTA) العازلة المنصوص عليها في عدة في أنبوب 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الايثانول ترسيب الحمض النووي على التركيز من خلال إضافة 50 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم و 1 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى الأنبوب. وضع أنبوب في -20 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 10 دقيقة في RT. حل بيليه في المخزن TE 15 ميكرولتر، والتي ينبغي أن تسفر عن تركيز ~ 4 ميكروغرام / ميكرولتر. ملاحظة: التحكم بنيات التعبير المستخدمة هنا هي pMES-IRES-GFP 10، التي يقودها المروج الدجاج β-الأكتين، أو PCI-H2B-IRES-طلب تقديم العروض <sتصل&gt; 10، التي يقودها المروج CMV. </li></ol></li></ol> 2. الدجاج في البيضة الصغيرة Electroporation للوفي البيضة تكاثر الخلايا الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البيضة الصغيرة حقن تعبيد التعبير والصغرى Electroporation لل: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب أنابيب زجاجية الشعرية إلى إبر رفيعة باستخدام مجتذب ماصة الجزئي مع المعلمات الأمثل التالية ل2.5 × 2.5 ملم مربع البلاتين التدفئة الشعيرة: الضغط = 500، الحرارة = 600 ° C، سحب = 64، السرعة = 105، والوقت = 150 مللي ثانية (انظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد واليسارية ومراحل مناور الصغيرة اليد اليمنى المرافقة المجهر (انظر الشكل 1A). وتتلاعب الدقيقة اليد اليمنى يحمل الزجاج الشعرية الإبرة وتتلاعب الدقيقة أعسر يحمل أقطاب (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير الزجاج الشعرية إبرة سحب ناعما لحقن الجزئي عن طريق خفضغيض من الإبرة مع ملقط بينما تعمل تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شغل الإبرة يدويا باليد باستخدام مناور الصغير مع 2.5 ميكرولتر من البلازميد ملون مع 0.1٪ سريع الخضراء بينما كان يعمل تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع البيض ملقاة على جانبها داخل جهاز العفن / بيضة عقد (انظر الشكل 1A). قطع نافذة مستديرة حول الجزء العلوي من البيضة باستخدام مقص 19 (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما كان يعمل تحت المجهر، وفتح بعناية الأغشية اثنين تتراكب الجنين باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بينما كان يعمل تحت المجهر، وتقديم ما يقرب من ~ 0.5 ميكرولتر من البلازميد إلى اليمين تجويف الحويصلة الأذنية عن طريق الحقن الصغيرة يدويا باستخدام اليد اليمنى باستخدام تتلاعب الدقيقة وElectroporation للالصغيرة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للقيام بذلك، والصغرى حقن الأيمن تجويف الحويصلة الأذنية مع الحمض النووي مع اليد اليمنى الدقيقة مناور (الشكل 1B-D) في الوقت نفسه باستخدام على holdin الأيسرالجا forcep لتحقيق استقرار رأس الجنين، لأن رأس الجنين الانخفاضات في مرحلة E4. لا الجزئي حقن-الماضي تجويف الحويصلة الأذنية، لأن هذا سيضر الحويصلة الأذنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد الحقن الصغيرة، بينما كان يعمل تحت المجهر، واستخدام اليسار اليد الصغيرة مناور لوضع إيجابي (الأنود) 2 مم البلاتين القطب الأمامي بطني إلى الحويصلة الأذنية اليمنى والسلبية القطب 2 مم (الكاثود) بالتوازي 1 مم وبصرف النظر (انظر الشكل 1 C). تسليم 4 البقول بنسبة 12 V مع 100 ميللي ثانية مدتها و 200 تباعد مللي ثانية. تخدم الحويصلة الأذنية ترك كعنصر تحكم غير المعالجة الداخلية. ملاحظة: تنظيف الأقطاب بين electroporations مع مسحة ذات الرؤوس القطن مغموسة في برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في البيضة تكاثر الخلايا الفحص: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد Electroporation للإضافة 50 ميكرولتر من 0.25 ملغ / مل ايدو في برنامج تلفزيوني 1X بإسقاط EDU حل 50 ميكرولتر يدويا على وجه العمومالجنين في البيضة باستخدام ماصة. ختم البيض مع الشريط والعودة إلى الحاضنة لمدة 18-96 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعناية إزالة الشريط والتحقق من الأجنة لGFP الفلورسنت أو إشارة طلب تقديم العروض داخل الحويصلة الأذنية بعد 18 - 24 ساعة باستخدام المجهر الفلورسنت القياسية (انظر الشكل 1 EE). إذا إشارة الفلورسنت الحالية، في هذه المرحلة حصاد الأجنة للتحليلات أو ختم مع الشريط وإعادته إلى حاضنة للحصاد والتحليلات في مراحل لاحقة (انظر الشكل 1 FP &#39;&#39;). ملاحظة: التعبير عن إشارة GFP مع بناء pMES-IRES-GFP هو واضح 6-7 ساعة بعد Electroporation لل10. </li></ol></li></ol> حصاد 3. الأجنة ومعالجة الأنسجة لRNA في الموقع التهجين والمناعية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الأجنة باستخدام ملقط. شطف الجنين في 1X PBS الباردة. إزالة رؤوس الأجنة، عن طريق قطع الرأس عنقهباستخدام ملقط، ووضع رؤساء إلى 4٪ امتصاص العرق O / N عند 4 درجات مئوية. ثقب الدماغ باستخدام forcep للسماح للتغلغل في امتصاص العرق 4٪ داخل الرأس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يذوى رؤساء في 30٪ سكروز (في برنامج تلفزيوني 1X) O / N عند 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل رؤساء في وسط واق من البرد قبل التجميد السريع في الطين من الثلج الجاف وmethylbutane (2-Methylbutane). بدلا من ذلك، سريعة تجميد رؤساء في وسط واق من البرد مع النيتروجين السائل. تخزين رؤساء شنت في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection رؤساء إلى 12 ميكرومتر أقسام الأنسجة السميكة وجمع كل أقسام الأنسجة التي تحتوي على الأذن الداخلية على شرائح المجهر الزجاجية superfrosted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء RNA القياسية في الموقع التهجين والمناعية كما هو موضح سابقا 4،21، وتحليل لتكاثر الخلايا ايدو بعد بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة للمجموعة. ملاحظة: يمكن التعرف على خلايا الشعر باستخدام الأرنب بولكلونل α-MyosinVIIa (Myo7a) لtibody (1: 1000، بروتيوس العلوم البيولوجية) والضد الثانوية fluorescently المسمى (1: 250، الماعز المضادة للأرنب AlexaFluor 488؛ إينفيتروجن). </li></ol> 4. التقاط الصور والمعالجة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط صور مع معدات التصوير الرقمية. النتائج صورة المناعية مع المجهر ونتائج في الموقع باستخدام المجهر واسعة المجال القياسية (التي تتراوح بين 5X إلى 40X في التكبير) الفلورسنت القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معالجة الصور باستخدام برامج معالجة الصور. </li></ol>

<ol>
	<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken.">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li><li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+mammalian+cochlea.">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li><li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+inner+ear.">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 32, 112-118 (2015).</li><li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development.">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li><li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear.">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li><li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+production+in+the+chicken+cochlea.">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li><li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos.">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li><li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo.">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements.">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li><li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode:+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear.">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li><li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear:+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1.">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li><li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick.">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li><li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1.">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871 (2012).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation.">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li><li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family.">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li><li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla.">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs.">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li><li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode.">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

تم تحسين طريقة هنا وصف للفي البيضة Electroporation للالصغيرة للنقل الجينات في الجهاز السمعي النامية. وهو متوافق مع البلازميد ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي عادة ما تستخدم للتلاعب وظيفة الجين / التعبير. توقيت Electroporation للفي E4 هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على ا...

وعلى الرغم من الاختلافات في الشكل والزخرفة الخلوية بين الثدييات والطيور الجهاز الحسي السمعي، ويعتقد أن العوامل الجزيئية ومسارات المسؤولة عن التنمية HC الحسية يجب الحفاظ تطويريا 1-3. حليمة القاعدي، الذي يضم المراكز الصحية السمعية والمنبوذة المحيطة بها، ويطور باعتبارها تجيب خارجي من الكيسة السمعية في الاذن الداخلية. في وقت مبكر على مجموعة من الأسلاف HC وSC المحدد ضمن اللوحاء أذني / أذني نطاق المختصة كوب العصبية الحسية (إس دي). توفر البيانات مصير رسم خرائط دليل على أن الأنساب العصبية والحسية ترتبط وتنشأ من NSD تقع في منطقة انتيرو بطني من الكأس أذني أو الكيسة السمعية في الفئران والدجاج 4،5. أولا، neuroblasts delaminate من NSD تثير الخلايا العصبية من العقدة-السمعية الدهليزي، الذي انشق في نهاية المطاف إلى العقد السمعي والدهليزي. هذه الخلايا العصبية يعصب المراكز الصحية الحسية في الأذن ونوى الداخلية في الدماغ. الخلايا عشرفي البقاء في مديرية الأمن القومي ويعتقد أن تثير مختلف بقع الحسية، بما في ذلك الجهاز الحسي السمعي، ويتألف من المراكز الصحية الحسية transducing والميكانيكية والمنبوذة المرتبطة بها. في كل فرخ والفئران، الجهاز السمعي الحسي السلف خروج دورة الخلية وHC التمايز يحدث في معارضة التدرجات. في الفرخ، السلف السمعي-دورة الخلية خروج يبدأ حول ~ E5 وتقدم من القاعدة إلى القمة، ومن المركز إلى المحيط 6. في وقت لاحق يوم واحد، يبدأ HC التمايز في قمة وتقدم إلى قاعدة 7. دراسة تطوير الأذن الداخلية في الدجاج يوفر العديد من المزايا التقنية كما يمكن التحقيق الآليات الوظيفية مع السهولة النسبية في البيضة بدلا من التلاعب الأجنة في الرحم في نظم نموذج أخرى، الأمر الذي يتطلب عملية جراحية معقدة. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم في البيضة Electroporation للالجزئي لاستهداف الجينات في المصالح في باسيلا الظنيص منطقة حليمة الأمامي-البطني في الحويصلة الأذنية على وجه التحديد في E4. Electroporation للفي البيضة هو الاسلوب الذي راسخة وتستخدم عادة 8-14. ويستند مبدأ أسلوب Electroporation للفي حقيقة أن النيوكليوتيدات (على سبيل المثال، البلازميد، الحمض النووي الاصطناعي، أو الحمض النووي الريبي [أليغنوكليوتيد) واتهم سلبا. يتم حقن الحمض النووي في الأنسجة من الاهتمام. عندما يتم وضع التيار الكهربائي في جميع أنحاء الأنسجة، والتيار يفتح مسام عابرة في جدران الخلايا ويسمح لامتصاص الحمض النووي، كما يتدفق الحمض النووي سالبة الشحنة نحو القطب الموجب (الأنود). للتجارب مكاسب من وظيفة، وsubcloned جينات الفائدة عادة إلى التعبير البلازميدات التي تحتوي على أشرطة التعبير المناسبة للبروتين أخضر فلوري (GFP) أو بروتين أحمر فلوري (RFP). لفقدان وظيفة من التجارب القائمة على البلازميد المهيمنة يبني السلبية كاظمة، أو رني، أو يبني morpholino هم جتستخدم ommonly 15،16. لمنع الرنا الميكروي (ميرنا) وظيفة miRNAs يبني الاسفنج، التي عادة ما تكون البلازميد مقرها، ويمكن استخدامها 17. يسمح الطريقة هنا وصف للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تتحكم في انتشار والتمايز في الجهاز السمعي، كما في البيضة طريقة Electroporation للالصغيرة يمكن الجمع بسهولة مع البيضة في فحص تكاثر الخلايا بإضافة EDU إلى الجنين كله. يتم تنفيذ Electroporation للوإضافة ايدو في E4 في الحويصلة الأذنية، الذي هو قبل يوم واحد من بداية خروج دورة الخلية في الجهاز السمعي. تحليل الجهاز السمعي هو عادة يؤديها 18-96 ساعة بعد Electroporation للفي E5 (بداية من السلف الحسي خروج دورة الخلية)، E6 (بداية التمايز HC)، وE7 (خلال التمايز HC)؛ وفي وقت لاحق إلى ~ E9 (نهاية التمايز HC). هذه الطريقة Electroporation للنقل الجين هو عابر دائم تقريبا ~ 4 أيام، becau حدحد ذاته جينات الفائدة لا الاندماج في الجينوم، ولكن الأسلوب هو المعمول به للاستخدام مع البلازميد المناسب ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي، التي لا تملك القدرة على الاندماج في الجينوم، مثل نقل الجينات بوساطة Tol2-11. مع هذا الأسلوب GFP قوي أو التعبير طلب تقديم العروض يستمر ~ 4 أيام في القوقعة، وبعد ذلك نشير إشارات تتلاشى، بعد توفير نافذة متسع من الوقت لدراسة تطوير معقدة من الجهاز السمعي. هذا في البيضة طريقة نقل الجينات هي رواية ويسمح خصيصا لاستهداف الجهاز السمعي المفترض في E4، الذي هو الأمثل للتحقيقات التي تركز على التنمية HC في الجهاز السمعي. بل هو إضافة جيدة إلى الطرق البديلة، التي electroporate في مراحل نمو أصغر من ذلك بكثير 11،12 أو بالمقارنة مع استخدام في المختبر الحليمات القاعدي الثقافات يزدرع 18.

<table><tbody><tr><td>Sterile 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&amp;nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Right Handed &amp;amp; Left Handed Micromanipulators</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M3301R &amp;amp; M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metal Steel Base Plate 12x24 inch</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette Puller for pulling needles</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glass Syringe 100 &amp;mu;l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Disposable Syringes</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Disposable 21 Gauge Needles</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>One pair of 2 mm Platinum Electrodes</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>One pair of Dumont fine forceps number 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matte finish invisible tape for sealing eggs</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Swabs</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation

أجنة الدجاج هي أنظمة النموذج المثالي لدراسة التطور الجنيني كما يمكن إجراء التلاعب وظيفة الجين مع السهولة النسبية في البيضة. الأذن الداخلية السمعي الجهاز الحسي هو أمر حاسم لقدرتنا على الاستماع. ويضم ظهارة متخصصة للغاية الحسية التي تتكون من خلايا الشعر transducing والميكانيكية (المراكز الصحية) والمحيطة الدبقية مثل الخلايا الداعمة (المنبوذة). وعلى الرغم من الاختلافات الهيكلية في أجهزة السمع، الآليات الجزيئية التي تنظم تطوير الجهاز السمعي يتم حفظها تطويريا بين الثدييات وأفيس electroporation في البيضة محدودة إلى حد كبير في المراحل المبكرة في E1 - E3. نظرا للتطور في وقت متأخر نسبيا من الجهاز السمعي في E5، التلاعب من الجهاز السمعي بواسطة electroporation في البيضة الماضي E3 صعبة نتيجة لتطور متقدمة من الجنين الدجاج في مراحل لاحقة. الطريقة المعروضة هنا هي طريقة نقل الجينات عابرة لاستهداف الجينات في المصالح فيمرحلة E4 - E4.5 في تطوير السمعية الدجاج الجهاز الحسي عبر في البيضة-Electroporation للالصغرى. هذا الأسلوب ينطبق على gain- والخسارة من وظائف مع البلازميد التقليدية ناقلات التعبير المعتمدة على الحمض النووي ويمكن الجمع بين في البيضة مقايسة انتشار الخلايا بإضافة ايدو (5 إيثينيل-2&#39;-deoxyuridine) إلى الجنين كله في وقت Electroporation لل. استخدام أخضر أو ​​أحمر بروتين فلوري (GFP أو طلب تقديم العروض) البلازميدات التعبير يسمح للمجرب لتحديد بسرعة ما إذا كان Electroporation للاستهدفت بنجاح الجزء السمعي في الأذن الداخلية النامية. في هذه الورقة الطريقة، يتم توضيح الأمثلة النموذجية على GFP electroporated العينات. وكان حصاد الأجنة 18-96 ساعة بعد Electroporation للواستهداف GFP إلى منطقة موالية للالحسية للجهاز السمعي ما أكده الحمض النووي الريبي في الموقع التهجين. ويقدم ورقة الأسلوب أيضا على بروتوكول الأمثل لاستخدام الثيميدين التناظرية ايدو لتحليل prolif خليةeration. وتقدم مثالا للمقايسة انتشار الخلايا EDU على أساس أن يجمع المناعية وضع العلامات وانقر EDU الكيمياء.

في هذا الحمض النووي طريقة رقة البلازميد التي تتكون من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أشرطة التعبير استهدف في الدجاج تطوير حليمة القاعدي (BP) مع المعلمات الأمثل من 12 فولت و 4 البقول مع 100 مدة النبضة ميللي ثانية وفترات من 200 ميللي ثانية، مما أسفر عن ~ 50٪ معدل ...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation at JoVE.com

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها<em&gt; في البيضة</em&gt; الصغرى Electroporation لل

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

9.4K Views.  The Johns Hopkins University, School of Medicine. The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ. 

Video: Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل<em&gt; OVO السابقين</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط الفرخ

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية

نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل

تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

نقل الجينات إلى داخل الجهاز الدجاج السمعية التي كتبها

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ثقافة الجنينية الماوس القوقعة إإكسبلنتس وجين نقل من قبل Electroporation لل

Electroporations OVO في مرحلة الجنين سمو الدجاج 10

في أوفو إليكتروبوراتيون في الدماغ الدماغ السمعي

نقل الجينات إلى الأذن الداخلية عن طريق تطوير ماوس

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط ​​الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط ​​الفرخ

في طرق Ovo و Ex Ovo لدراسة تطور الأذن الداخلية للطيور

في Electroporation OVO في شبكية العين الفرخ الجنينية

نقل الجينات في أجنة الدجاج أقدم من قبل

تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo

في Electroporation البيضة في الدماغ المتوسط الفرخ لدراسة وظيفة الجينات في الخلية العصبية الدوبامين التنمية

في التعبير البيضة من الرنا الميكروي في بطني الدماغ المتوسط الفرخ