Name: gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation at JoVE.com

Ringraziamo il Dr. Doris K. Wu per plasmidi di espressione e di sonde in situ, la Johns Hopkins University Center for sensoriale struttura di imaging Biologia e il Centro di udito e l&#39;equilibrio. Questo lavoro è stato sostenuto da NIDCD di Grant T32 DC000023 a LE

Le uova non schiuse e gli embrioni sono curati e trattati eticamente e umanamente. Tutti i protocolli per l&#39;uso degli embrioni unhatched sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Usa presso la Johns Hopkins School of Medicine, Baltimora, Maryland. 1. Le uova e la preparazione di costrutti di espressione <ol><li> Uova: <ol><li> Incubare 3-4 dozzina di uova di gallina fecondate (Gallus gallus) disteso su un fianco a 37 ° C. <ol><li> Dopo 24 ore di incubazione, tirare 3 cc di albume con una siringa dal back-end round del uovo e sigillare il foro con nastro adesivo trasparente. Questo crea una camera d&#39;aria tra l&#39;embrione e il guscio, consentendo facilità di accesso all&#39;embrione senza l&#39;embrione attaccare allo scafo durante il taglio la finestra di accesso sulla parte superiore dell&#39;uovo 19. </li><li> A 117 ore di tempo di incubazione, in scena gli embrioni in base alla Hamburger e Hamilton 20 fasi di sviluppoa E4 (HH24-25) (Vedi Figura 1D). </li></ol></li></ol></li><li> Espressione crea: <ol><li> Preparare il DNA plasmide utilizzando reagenti e il protocollo fornito dal produttore di un kit di preparazione disponibile in commercio. Nella fase finale di preparazione, eluire il DNA in 500 microlitri TE (Tris-EDTA) tampone fornito nel kit in una provetta da 1,5 ml. </li><li> Etanolo precipitare il DNA di concentrare aggiungendo 50 ml di 3 M acetato di sodio e 1 ml di etanolo al 100% al tubo. Posizionare il tubo a -20 ° CO / N. </li><li> Centrifugare la provetta per 30 min a 14.000 rpm a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e aria asciugare il pellet per 10 minuti a RT. Sciogliere il pellet in 15 microlitri di buffer TE, che dovrebbe ottenere una concentrazione di ~ 4 mg / mL. NOTA: Il controllo costrutti di espressione usati qui sono pMES-IRES-GFP 10, che è guidato da un promotore di pollo β-actina, o PCI-H2B-IRES-RFP <sup&gt; 10, che è guidato dal promotore CMV. </li></ol></li></ol> 2. Pollo In Ovo Micro-elettroporazione e In Ovo Cell Proliferation Assay <ol><li> In Ovo micro-iniezione di Construct espressione e Micro-elettroporazione: <ol><li> Tirare i tubi di vetro capillari in aghi sottili con un estrattore di micro-pipetta con i seguenti parametri ottimizzati per un x 2,5 mm Box Platinum riscaldamento filamento 2.5: Pressione = 500, Calore = 600 ° C, Pull = 64, Velocity = 105, e ora = 150 msec (vedi tabella 1). </li><li> Impostare la sinistra e fasi di micro-manipolatore di mano destra che fiancheggiano il microscopio (vedi figura 1A). Il micro-manipolatore Destro tiene il capillare ago di vetro e la sinistra-handed micro-manipolatore mantiene gli elettrodi (Figura 1A). </li><li> Preparare l&#39;ago capillare di vetro finemente tirato per la micro-iniezione tagliandola punta dell&#39;ago con una pinza mentre lavora sotto il microscopio. </li><li> Riempire l&#39;ago manualmente a mano con il micro-manipolatore con 2,5 ml di DNA plasmidico colorati con 0,1% veloce verde mentre lavora sotto il microscopio. </li><li> Mettere l&#39;uovo sdraiata su un fianco all&#39;interno di un dispositivo di stampo / uovo partecipazione (vedi Figura 1A). Tagliare una finestrella sulla parte superiore dell&#39;uovo con le forbici 19 (Figura 1A). </li><li> Mentre si lavora sotto il microscopio, aprire con cautela le due membrane sovrapposte l&#39;embrione con pinze. </li><li> Lavorando al microscopio, fornire circa ~ 0,5 ml di DNA plasmidico per il giusto lume vescicola otic da micro-iniezione manualmente utilizzando la mano destra utilizzando micro-manipolatore e micro-elettroporazione. <ol><li> Per fare ciò, micro-iniettare la giusta lume vescicole otic con il DNA con la mano destra micro-manipolatore (Figura 1B-D), mentre allo stesso tempo con la mano sinistra Holdinga pinza per stabilizzare la testa dell&#39;embrione, perché la testa dell&#39;embrione immerge nella fase E4. Non micro-iniezione passato lume vescicole otic, perché questo potrebbe danneggiare la vescicola otica. </li><li> Subito dopo micro-iniezione mentre lavora sotto il microscopio, utilizzare la mano sinistra micromanipolatore per posizionare il positivo (anodo) 2 millimetri elettrodo di platino antero-ventrale vescicola otica destra e 2 millimetri negativo elettrodo (catodo) in parallelo 1 mm l&#39;uno dall&#39;altro (vedi Figura 1 C). Invia 4 impulsi a 12 V con durata di 100 msec e 200 msec spaziatura. La vescicola otica sinistra serve come un controllo non trattato interno. NOTA: Pulire gli elettrodi tra electroporations con un batuffolo di cotone imbevuto con punta in 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li> In Ovo Cell Proliferation Assay: <ol><li> Subito dopo l&#39;elettroporazione aggiungere 50 ml di 0,25 mg / ml EdU in 1x PBS facendo cadere manualmente la soluzione di 50 microlitri EdU su tuttaembrione in ovo con una pipetta. Sigillare le uova con nastro e tornare alla incubatore per 18-96 ore. </li><li> Rimuovere con attenzione il nastro e verificare gli embrioni per la GFP fluorescenza o il segnale di richiesta di offerta all&#39;interno della vescicola otica dopo 18 - 24 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza standard (vedi Figura 1 EE &#39;). Se segnale fluorescente è presente, a questo punto, raccogliere gli embrioni per analisi o richiudere con nastro adesivo e restituirlo al incubatore per la raccolta ed analisi in fasi successive (vedi Figura 1 FP &#39;&#39;). NOTA: L&#39;espressione di segnale GFP con il costrutto pMES-IRES-GFP è evidente 6-7 ore dopo l&#39;elettroporazione 10. </li></ol></li></ol> 3. Embrione la raccolta e la lavorazione dei tessuti per l&#39;RNA ibridazione in situ e immunoistochimica <ol><li> Raccogliere gli embrioni con pinze. Lavare l&#39;embrione in 1x PBS freddo. Rimuovere le teste degli embrioni, tagliando la testa per il collousando pinze, e posizionare le teste in paraformaldeide al 4% O / N a 4 ° C. Perforare il cervello utilizzando una pinza per consentire la penetrazione del paraformaldeide 4% all&#39;interno della testa. </li><li> Disidratare le teste di 30% di saccarosio (in 1x PBS) O / N a 4 ° C. </li><li> Montare le teste a medio crioprotettiva da congelamento rapido in un impasto di ghiaccio secco e metilbutano (2-metilbutano). In alternativa, rapida congelare le testine in media crioprotettiva con azoto liquido. Conservare le teste montate a -80 ° C. </li><li> Cryosection le teste in 12 sezioni micron di tessuto di spessore e raccogliere tutte le sezioni di tessuto dell&#39;orecchio contenenti interno su vetrini da microscopio superfrosted. </li><li> Eseguire RNA standard di ibridazione in situ e immunoistochimica come precedentemente descritto 4,21, e analizzare per la proliferazione cellulare EdU seguendo il protocollo fornito dal produttore del kit. NOTA: le cellule dei capelli possono essere identificati utilizzando il coniglio policlonali α-MyosinVIIa (MYO7A) untibody (1: 1.000, Proteus Biosciences) e anticorpo secondario fluorescenza marcata (1: 250, di capra anti-coniglio AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> 4. Acquisizione Immagine e lavorazione <ol><li> Prendere le immagini con apparecchiature di imaging digitale. Risultati Immagine immunoistochimica con un microscopio a fluorescenza standard ed i risultati dei controlli in loco utilizzando un microscopio a livello di campo standard (che vanno da 5x a 40x in un ingrandimento). </li><li> Elaborare le immagini utilizzando il software di elaborazione delle immagini. </li></ol>

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	<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken.">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li><li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+mammalian+cochlea.">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li><li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+inner+ear.">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 32, 112-118 (2015).</li><li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development.">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li><li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear.">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li><li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+production+in+the+chicken+cochlea.">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li><li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos.">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li><li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo.">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements.">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li><li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode:+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear.">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li><li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear:+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1.">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li><li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick.">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li><li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1.">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871 (2012).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation.">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li><li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family.">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li><li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla.">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs.">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li><li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode.">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Il metodo qui descritto di in ovo micro-elettroporazione è ottimizzato per il trasferimento genico in via di sviluppo dell&#39;organo uditivo. E &#39;compatibile con il plasmide vettori di espressione basati sul DNA tipicamente utilizzati per manipolare la funzione del gene / espressione. I tempi di elettroporazione in E4 è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell&#39;organo uditivo. Le fasi più critiche sono micro-iniezione del DNA nel lume vescicola otic senza andare troppo in profondità con l&#39;ago e danneggiando la vescicola otica (vedi Fig. 1A-D), il targeting del DNA nel dominio antero-ventrale vescicola otica by posizionare gli elettrodi di conseguenza (vedi Fig 1C.), e la consegna dei parametri di elettroporazione ottimizzate di 4 impulsi a 12 V. Questi sono ottimizzati i parametri di elettroporazione e la concentrazione del DNA plasmide ottimizzato (~ 3,5-4 mg / mL) per destinatario principale la uditivo presuntiva organo a E4. Inizialmente abbiamo iniziato out condurre electroporations a 6 V, che non ha prodotto segnali fluorescenti. La tensione è stata gradualmente aumentata utilizzando 8 V e 10 V, con l&#39;essere ottimale 12 V. Analogamente, il numero di impulsi per fornire e la durata degli impulsi e la spaziatura degli impulsi sono state ottimizzate. A 12 V, 4 impulsi con durata di 100 msec e 200 msec spaziatura è l&#39;ideale. Questi parametri sono non solo ideale per ottenere il trasferimento di geni efficiente a E4, ma sono ideali anche per un tasso di sopravvivenza degli embrioni di circa ~ 50%. Se nessun segnale fluorescente viene ottenuto entro 24 ore di elettroporazione, dovrebbe essere considerata la seguente: 1.) Assicurarsi che la concentrazione plasmide DNA è di almeno 3,5 mg / mL. 2.) Regolare il parametro elettroporazione da 2 V, per esempio per 10 o 14 V. Come all&#39;ottenimento embrioni E4 (HH24-25) fase entro 117 ore di tempo di incubazione (vedi Fig. 1D), la temperatura incubatrice per le uova dovrebbero essere ottimizzato tra 37-39 ° C, con più o meno ore di incutempo bation bisogno di 117 ore a seconda della temperatura utilizzata, perché ci sono variazioni di detenzione e l&#39;esecuzione temperature utilizzando diversi incubatori tra i diversi laboratori. Vari analoghi della timidina tra BrdU (5-bromo-2&#39;-deossiuridina) o EdU possono essere utilizzati per studiare nella proliferazione cellulare ovo. Tuttavia, l&#39;uso di due composti deve essere ottimizzato per ogni stadio di sviluppo come troppo del composto dimostra tossico per la cellula / vitalità dell&#39;embrione e troppo poco del composto dimostra inefficace. Questo metodo descrive l&#39;uso ottimizzato di EdU ad una concentrazione di 0,25 mg / ml applicatori 50 microlitri sull&#39;intera embrione in ovo specificamente per studiare la proliferazione cellulare e ciclo cellulare-uscita dalla E4 in poi. In elettroporazione ovo come metodo di manipolazione genetica ha alcune limitazioni. Un gran numero relativo di uova sono necessari per electroporations a E4 con appropriati costrutti di controllo e per le experimentacondizioni l. Ciò è dovuto ad una percentuale di uova, circa il ~ 27%, essendo inutilizzabile per elettroporazione causa di una combinazione di mancanza di concimazione, difetti di sviluppo, e morte embrionale. Un altro fattore importante da considerare è il tasso di sopravvivenza degli embrioni dopo l&#39;elettroporazione. Il tasso di sopravvivenza è di circa ~ 50%. Ciò è dovuto al fatto che gli embrioni anziani a E4 non sopravvivono bene dopo essere manipolato; embrioni più giovani sono più resistenti e tollerare di essere manipolati meglio. Espressione di geni di interesse dopo elettroporazione in E4 sono focale e localizzata nell&#39;intero dotto cocleare compreso il tessuto non sensoriale e sensoriale nonché ganglio uditivo. La ragione per l&#39;espressione più focale e localizzato è perché la destinazione del elettroporazione è il presuntiva, non sviluppato organo uditivo a E4, prima che il pollo organo uditivo inizia a crescere in E5 ed allunga nella sua caratteristica forma a falce di ~ E9 1 . Infine, thMetodo e è transitoria in cui i segnali di espressione rimangono solo per ~ 4 giorni, perché i geni di interesse utilizzati qui non si integrano nel genoma. Tuttavia, il metodo può essere utilizzato con opportuni costrutti plasmide di espressione-based che non hanno la capacità di integrarsi nel genoma. Padroneggiare il metodo di elettroporazione richiede una certa pratica, gli occhi e le mani esperte, e l&#39;esperienza nel lavoro con embrioni di pollo. I riferimenti forniti per lo sviluppo dell&#39;orecchio interno e pollo atlanti di sviluppo servono come buone guide e sono buoni punti di partenza per un novizio. Dopo padronanza il metodo con questi parametri di elettroporazione ottimizzati, il metodo può essere utilizzato per manipolazioni sugli vescicola otica chiusa da E2 a ~ E4.5. Anche se per electroporating a E2 e E3, 10 V deve essere usato al posto di 12 V. Per l&#39;elettroporazione in E1 mira il placode otic e coppa otic, elettrodi di platino personalizzate con i parametri di elettroporazione modificati possono essere utilizzati <sup&gt; 10. La manipolazione anteriore può essere usato per studiare gli eventi precedenti nello sviluppo otic compresi neurogenesi orecchio interno e lo sviluppo di organi sensoriali vestibolari 8-10. Oltre a studiare lo sviluppo dell&#39;organo uditivo questo metodo si presta anche per studiare lo sviluppo del innervano ganglion uditivo. Analisi di espressione GFP in campioni elettroporate ha rivelato che il targeting specificamente la vescicola otica antero-ventrale, non si rivolge solo il dominio sensoriale all&#39;interno del competente (NSD) epitelio neurale-sensoriale, ma si rivolge anche alla popolazione neuronale che risiedono all&#39;interno del NSD. neuroni afferenti che innervano gli organi sensoriali vestibolari e uditivi sono principalmente di origine placodal otic. La neurogenesi si verifica nel corso di un periodo di tempo prolungato circa da ~ E1.5 - E4.5 nel pulcino, dove neuroblasti, in fase di intensa proliferazione cellulare continuamente delaminano da epitelio NSD della coppa otic (~ E1.5) e vescicole otica (~ E2.5 - E4.5) e popolare come differenziare i neuroni del ganglio cocleare-vestibolare (CVG; VIII nervo cranico) 8,10,13,22. Inoltre, con alcune modifiche organi vestibolari possono essere mirati con il metodo presentato. Ad esempio, il crista anteriore presuntiva può essere mirata a E3, che si trova sulla punta dorsale anteriore del NSD antero-ventrale 9. Electroporating a E4 mira le antero-ventrale rendimenti vescicola otic focali ancora robuste espressioni GFP trascrizione all&#39;interno del tessuto sensoriale e non sensoriale tutti gli organi sensoriali vestibolari, vale a dire la creste e utricluar e macule sacciforme (dati non riportati). In conclusione, il metodo in ovo qui presentato è specifico per condurre guadagno e perdita di funzioni da E4 e per studiare la proliferazione e differenziazione nel pollo sviluppo dell&#39;organo uditivo. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato per studiare altri aner orecchio fenomeni evolutivi, tra neurogenesi orecchio interno e lo sviluppo di organi vestibolari.

Nonostante le differenze nella morfologia e patterning cellulare tra mammiferi e aviaria organo sensoriale uditivo, i fattori molecolari e dei percorsi responsabili dello sviluppo HC sensoriali sono pensati per essere evolutivamente conservato 1-3. La papilla basilare, che ospita le HC uditive e le loro SC circostanti, si sviluppa come un outpocketing del otocyst dell&#39;orecchio interno. Nella fase iniziale di un pool di progenitori HC e SC è specificato all&#39;interno del / otic dominio competente tazza neurale-sensoriale otic placode (NSD). Fate dati di mappatura dimostrano che lignaggi neuronali e sensoriali sono collegati e nascono dalla NSD situato nella regione antero-ventrale della coppa otic o otocyst nei topi e pollo 4,5. In primo luogo, neuroblasti delaminano dal NSD per dare origine ai neuroni del ganglio uditivo-vestibolare, che alla fine diviso in gangli uditivo e vestibolare. Questi neuroni innervano i HC sensoriali dell&#39;orecchio interno e nuclei del tronco cerebrale. Le cellule Tha rimanere nel NSD si pensa di dare origine a varie patch sensoriali, tra cui l&#39;organo sensoriale uditivo, costituito dai HC sensoriali meccano-trasduzione e le loro SC associati. In entrambi il pulcino e murino, organo uditivo progenitrice sensoriale uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC si verificano in opposte gradienti. In pulcino, uditivo progenitrice uscita del ciclo cellulare inizia intorno ~ E5 e progredisce dalla base all&#39;apice, e dal centro alla periferia 6. Il giorno dopo, la differenziazione HC inizia nel vertice e progredisce alla base 7. Studiando lo sviluppo dell&#39;orecchio interno nei polli offre molti vantaggi tecnici meccanismi funzionali possono essere studiate con relativa facilità in ovo al contrario di manipolare embrioni in utero in altri sistemi modello, che richiede interventi complessi. Il metodo descritto qui utilizza in ovo micro-elettroporazione per indirizzare i geni di interesse nella Basila presuntivaR zona della papilla antero-ventrale nella vescicola otica specificamente a E4. Elettroporazione in ovo è una tecnica che è ben consolidata e comunemente usato 8-14. Il principio della tecnica elettroporazione si basa sul fatto che i nucleotidi (ad esempio, DNA plasmidico, DNA sintetico, o RNA oligonucleotidi) sono caricati negativamente. Il DNA viene iniettato nel tessuto di interesse. Quando una corrente elettrica viene inserito attraverso il tessuto, la corrente si apre pori transitori nelle pareti cellulari e permette l&#39;assorbimento del DNA, come il DNA caricato negativamente fluisce verso l&#39;elettrodo positivo (anodo). Per gli esperimenti di guadagno di funzione, i geni di interesse sono comunemente subclonati in plasmidi di espressione che contengono adeguate cassette di espressione per Green Fluorescent Protein (GFP) o proteina fluorescente rossa (RFP). Per la perdita di funzione esperimenti plasmide-based dominanti costrutti negativi repressori, o RNAi, o costrutti morpholino sono commonly usato 15,16. Per inibire microRNA (miRNA) funzione miRNA costrutti spugna, che sono tipicamente plasmide base, può essere utilizzato 17. Il metodo qui descritto permette di indagare i meccanismi molecolari che controllano la proliferazione e la differenziazione nell&#39;organo uditivo, come nel metodo di micro-elettroporazione ovo possono essere facilmente combinati con in test di proliferazione cellulare ovo aggiungendo EdU a tutta dell&#39;embrione. L&#39;elettroporazione e l&#39;aggiunta di EdU viene eseguita a E4 nella vescicola otica, che è un giorno prima della comparsa di uscita del ciclo cellulare nell&#39;organo uditivo. L&#39;analisi dell&#39;organo uditivo è in genere eseguita 18-96 ore dopo l&#39;elettroporazione in E5 (insorgenza di uscita del ciclo cellulare progenitrici sensoriale), E6 (insorgenza di differenziazione HC), e E7 (durante la differenziazione HC); e poi fino a ~ E9 (fine differenziazione HC). Questo metodo elettroporazione del trasferimento genico è transitorio della durata di circa ~ 4 giorni, because i geni di interesse non si integrano nel genoma, ma il metodo è applicabile per l&#39;uso con adeguato plasmide vettori di espressione basati sul DNA, che hanno la capacità di integrarsi nel genoma, come ad esempio il trasferimento genico mediato Tol2 11. Con questo metodo GFP robusto o espressione RFP dura ~ 4 giorni nella coclea, dopo che indicano i segnali di dissolvenza, ma forniscono una finestra di tempo sufficiente per studiare lo sviluppo intricato dell&#39;organo uditivo. Questo metodo di trasferimento genico in ovo è nuovo e consente di indirizzare specificamente l&#39;organo uditivo presuntiva in E4, che è ottimale per le indagini che si concentrano sullo sviluppo HC nell&#39;organo uditivo. Si tratta di una buona aggiunta ai metodi alternativi, che l&#39;elettroporazione in molto più giovani stadi di sviluppo o 11,12 rispetto all&#39;uso di in vitro basilare papille culture espianto 18.

<table><tbody><tr><td>Sterile 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&amp;nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Right Handed &amp;amp; Left Handed Micromanipulators</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M3301R &amp;amp; M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metal Steel Base Plate 12x24 inch</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette Puller for pulling needles</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glass Syringe 100 &amp;mu;l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Disposable Syringes</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Disposable 21 Gauge Needles</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>One pair of 2 mm Platinum Electrodes</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>One pair of Dumont fine forceps number 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matte finish invisible tape for sealing eggs</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Swabs</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation

Embrioni di pollo sono sistemi modello ideale per lo studio dello sviluppo embrionale, come manipolazioni di funzione del gene possono essere svolte con relativa facilità in ovo. L&#39;orecchio interno uditiva organo sensoriale è fondamentale per la nostra capacità di sentire. Ospita un epitelio altamente specializzato sensoriale che è costituito da cellule ciliate meccano-trasduzione (HC) e dintorni gliali-come le cellule di supporto (SCS). Nonostante le differenze strutturali negli organi uditivi, meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo dell&#39;organo uditivo sono evolutivamente conservati tra mammiferi e aves In elettroporazione Ovo è in gran parte limitata alle prime fasi a E1 -. E3. A causa della relativa ritardato sviluppo dell&#39;organo uditivo a E5, manipolazioni dell&#39;organo uditivo di elettroporazione in ovo passato E3 sono difficili a causa dello sviluppo advanced dell&#39;embrione di pollo in fasi successive. Il metodo qui presentato è un metodo di trasferimento genico transitoria per il targeting dei geni di interesse afase E4 - E4.5 in via di sviluppo pollo uditivo organo sensoriale via in ovo micro-elettroporazione. Questo metodo è applicabile per GAIN- e perdita di funzioni con plasmide convenzionale vettori di espressione basati sul DNA e può essere combinato con in saggio di proliferazione delle cellule ovo aggiungendo EdU (5-etinil-2&#39;-deossiuridina) per l&#39;intero embrione allo tempo di elettroporazione. L&#39;uso di proteina fluorescente verde o rosso (GFP o RFP) plasmidi di espressione consente allo sperimentatore di determinare rapidamente se l&#39;elettroporazione di mira con successo la porzione uditiva del sviluppo dell&#39;orecchio interno. In questo lavoro il metodo, esempi rappresentativi di esemplari GFP elettroporate sono illustrate; embrioni sono stati raccolti 18-96 ore dopo l&#39;elettroporazione e il targeting della GFP per l&#39;area pro-sensoriale dell&#39;organo uditivo è stata confermata da RNA ibridazione in situ. Il documento metodo fornisce anche un protocollo ottimizzato per l&#39;uso della timidina analogico EdU analizzare prolif cellulerazione; un esempio di un saggio di proliferazione cellulare basato EdU che combina immuno-etichettatura e cliccare EdU chimica è fornito.

In questo DNA metodo della carta plasmide composto di proteina fluorescente verde (GFP) cassette di espressione è stata mirata al pollo in via di sviluppo papilla basilare (BP) con parametri ottimizzati da 12 V e 4 impulsi con 100 durata degli impulsi msec e gli intervalli di 200 msec, ottenendo un ~ tasso di sopravvivenza del 50% degli embrioni e l&#39;efficienza del plasmide-DNA mira alla BP. Imaging fluorescente di espressione GFP nativa in embrioni di mostrato questo metodo di elettroporazione rivolge preferenzialmente l&#39;aspetto antero-ventrale del otocyst, che dà luogo alla BP (Figura 1 EE &#39;; freccia bianca) e l&#39;espressione GFP può essere seguita nel corso tempo fino a circa ~ 4 giorni (Figura 1 EH). RNA ibridazione in situ (ISH) è stato utilizzato per determinare se l&#39;elettroporazione mirata correttamente la porzione uditiva del sviluppo dell&#39;orecchio interno. Per determinare se la GFP è stato ripreso da uditivoprogenitori sensoriali, gli esperimenti sono stati eseguiti su ISH sezioni BP adiacenti. All&#39;interno dei progenitori in via di sviluppo sensoriale BP sono stati identificati dal loro espressione di Sox2 (figura 1 K e N) e frangia Lunatic (Lfng) (Figura 1 J). Questi esperimenti dimostrano che i progenitori sensoriali in tutto il sviluppare BP, come mostrato per la base (Figura 1 I; staffa nero) e apice (Figura 1 L; staffa nero), sono stati presi di mira con successo ed esprimono GFP dopo 68 ore di elettroporazione (Figura 1 I e l; staffe neri). Inoltre, GFP è stato espresso fuori del dominio sensoriale in cellule epiteliali non sensoriali (Figura 1 I e L; frecce rosse) e nel ganglio uditivo (Figura 1I e L; ag, frecce gialle) caratterizzato da espressione Neurod1 (Figura 1M) . In un tipico esperimento GFP </em&gt; espressione in cellule bersaglio persisteva fino a ~ 4 giorni (Figura 1 H); questo permette al ricercatore di analizzare la distribuzione spaziale e temporale del progenitore sensoriale recesso del ciclo cellulare e la differenziazione in sviluppo BP. Per determinare il comportamento proliferativo dei progenitori sensoriali, la EDU timidina analogico è stato aggiunto al momento della elettroporazione a E4. Quattro giorni dopo, EdU incorporazione nella sviluppo di BP è stato analizzato in sezioni di tessuto usando &quot;click&quot; chimica. Immuno-etichettatura per la proteina specifica-HC MyosinVIIa (MYO7A) è stato utilizzato per identificare HC differenziano in via di sviluppo BP. Nella parte apicale della BP MYO7A + HC sono stati spesso EdU + (Figura 1 PP &#39;; P&#39; &#39;, frecce bianche), mentre nella base solo poche MYO7A + HC aveva incorporato EdU (Figura 1 OO&#39;; O &#39;&#39;, frecce bianche), suggerendo che al momento della EdU Oltre a E4, pro sensorialegenitors nella base sono già ampiamente inviare mitotico. Questi risultati confermano precedenti studi di opposte gradienti di uscita del ciclo cellulare e la differenziazione HC nel pulcino BP 6,7. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53864/53864fig1.jpg" /> Figura 1. In elettroporazione Ovo &amp; In Ovo Cell Proliferation Assay. (AD) immagini in campo chiaro di metodo elettroporazione. In micro-iniezione ovo nella vescicola otica destra (B) e il posizionamento degli elettrodi dopo micro-iniezione di targeting zona antero-ventrale vescicola otica (C). Embrione allo stadio HH24-25 dopo micro-iniezione ed elettroporazione (D; verde vescicola otica, freccia nera). (EH) proteina verde fluorescente (GFP) espressione dopo l&#39;elettroporazione. ( <sTrong&gt; E) immagine Brightfield ed espressione GFP nella vescicola otica (delineato in rosso) a 18 ore. (E &#39;) l&#39;espressione della GFP a 18 ore (vescicole otic, freccia bianca). (FH) Frecce bianche indicano l&#39;espressione della GFP a 40 ore (F, vescicole otic), 68 ore (G, BP), ea 88 ore (H, BP). (IN) adiacenti cocleari tessutali sezioni della BP sondato per GFP, Lfng, Sox2, e Neurod1 trascrizioni da RNA ibridazione in situ a 68 ore. Lfng (J, staffa nero) e Sox2 (K e N, staffa nera) segnano il dell&#39;epitelio sensoriale e Neurod1 (M) segna il ganglio uditivo (AG). GFP è espressa all&#39;interno sensoriale (I e L, la staffa nero) e tessuto non-sensoriale (I e L, frecce rosse), e l&#39;unaganglio uditory (I e L, frecce gialle). (PO &#39;&#39;) immagini fluorescenti di MyosinVIIa (MYO7A) / EdU etichettatura. (O&#39;-O &#39;&#39; e p&#39;- P &#39;&#39;) ingrandimenti maggiori di O e P. (O &#39;e P&#39;) Più EdU etichettatura è presente all&#39;interno dell&#39;epitelio sensoriale al vertice (P &#39;, staffa bianca) rispetto alla base (O&#39;, staffa bianca). O &#39;&#39; e P &#39;&#39;) Fusa immagini fluorescenti, frecce bianche indicano MYO7A (+) / EdU (+) cellule ciliate al vertice (P &#39;&#39;) e la base (O &#39;&#39;). Più EdU (+), le cellule sono presenti all&#39;interno del ganglio uditivo all&#39;apice (P, ag) rispetto alla base (O, ag). (sac; saccule a O). (A, anteriore e V, ventrale in pannelli B eE). Scala bar 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53864/53864fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-elettroporazione

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

9.4K Views.  The Johns Hopkins University, School of Medicine. The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ. 

Video: Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura della embrionali di topo cocleari espianti e Gene Transfer con elettroporazione

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biologia

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

In Ovo Electroporation nel Brainstem Auditory del pollo

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Neuroscienze

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

In elettroporazione Ovo in Retina Chick Embryonic

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

Il trasferimento genico in embrioni di pollo da anziani<em&gt; Ex ovo</em&gt; Elettroporazione

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

Gene Transfer nel pollo Auditory Organ

Riepilogo

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