Name: gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation
Uploaded: 2016-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation at JoVE.com

אנו מודים לד&quot;ר דוריס ק וו עבור פלסמידים הביטוי והן בדיקות באתרו, במרכז האוניברסיטאי ג&#39;ונס הופקינס עבור מתקן הדמיה ביולוגיה חושי והמרכז השמיעה ושיווי המשקל. עבודה זו נתמכה על ידי NIDCD גרנט T32 DC000023 אל LE

הביצים עובר שלא נולד הם דאגו וטפלו אתיים ובאנושיות. כל הפרוטוקולים לשימוש עובר שלא נולד אושרו על ידי הטיפול בבעלי חי הוועדה השתמשתי בבית ספר ג&#39;ונס הופקינס לרפואה, בולטימור, מרילנד. 1. ביצים הכנת בונה הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 - 4 ביצים עוף מופרית תריסר (גאלוס גאלוס) שוכב על צדם על 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, למשוך 3 סמ&quot;ק של חלבון עם מזרק מתום הסיבוב לאחור של הביצה לאטום את החור עם קלטת ברורה. זה יוצר אוויר בין העובר לבין קליפת הביצה, המאפשר נוחות הגישה עובר ללא עובר דבק הקליפה בעת חיתוך בחלון לגישה על גבי הביצה 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 117 שעות של זמן דגירה, לביים את העוברים על פי המבורגר המילטון 20 שלבי התפתחותב E4 (HH24-25) (ראה איור 1D). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי בונה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד באמצעות ריאגנטים והפרוטוקול שספק היצרן של ערכת הכנה זמינה מסחרי. בצעד של הכנה הסופי, elute את ה- DNA לתוך 500 μl TE (טריס-EDTA) חיץ המסופק בערכה לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול להאיץ את ה- DNA להתרכז אותו על ידי הוספת 50 μl של 3 M נתרן אצטט 1 מ&quot;ל של אתנול 100% אל הצינור. מניחים את הצינור ב -20 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 30 דקות ב 14,000 סל&quot;ד ב 4 ° C.. הסר את supernatant ואוויר-יבש גלולה במשך 10 דקות ב RT. ממיסים את גלולה ב 15 μl חיץ TE, אשר אמור להניב ריכוז של ~ 4 מיקרוגרם / μl. ההערה: בונת ביטוי השליטה בשימוש הנה pMES-IRES-GFP 10, אשר מונע על ידי אמרגן העוף β-יקטין, או-H2B PCI-IRES-RFP <sעד&gt; 10, אשר מונע על ידי האמרגן CMV. </li></ol></li></ol> 2. עוף ב אובו מיקרו electroporation ו ב assay שגשוג התאים לג&#39;ימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב אובו מיקרו הזרקה של Construct הביטוי-electroporation מיקרו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את צינורות זכוכית נימי לתוך מחטים דקות באמצעות חולץ מיקרו-פיפטה עם פרמטרים אופטימיזציה הבאים עבור 2.5 x 2.5 מ&quot;מ Box פלטינום חימום נימה: לחץ = 500, חום = 600 ° C, משוך = 64, מהירות = 105, ושעה = 150 msec (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מתייחסות לזה בשלבים-מניפולטור מיקרו ימניים איגוף המיקרוסקופ (ראו איור 1 א). The-מניפולטור מייקרו הימני מחזיק את מחט נימי הזכוכית במייקרו-מניפולטור האם אתה השמאלי מחזיק האלקטרודות (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחט זכוכית נימי דק משכו עבור הזרקת מיקרו ידי חיתוךקצה המחט עם מלקחיים תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המחט באופן ידני על ידי היד באמצעות-מניפולטור מיקרו עם 2.5 μl של ה- DNA פלסמיד כהים עם 0.1% Fast הירוק תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הביצה שוכבת על צידו בתוך מכשיר חזק עובש / ביצה (ראה איור 1 א). חותכי חלון עגול על גבי הביצה באמצעות מספריים 19 (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי העבודה תחת מיקרוסקופ, לפתוח בזהירות את שתי ממברנות שכיסו את העובר באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, לספק כ ~ 0.5 μl של ה- DNA פלסמיד לומן שלפוחית ​​תקין otic ידי הזרקת מיקרו באופן ידני באמצעות יד ימין באמצעות-מניפולטור מיקרו ידי-electroporation מיקרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, מיקרו-להזריק לומן שלפוחית ​​otic תקין עם ה- DNA עם-מניפולטור מיקרו ימנית ביד (איור 1 ב- D) בעוד באותו זמן באמצעות אוחזים ביד שמאלמלקחי ga כדי לייצב את הראש של העובר, כי הראש של העובר טובל בשלב E4. אל מיקרו-להזריק בעבר לומן שלפוחית ​​otic, כי זה יפגע שלפוחית ​​otic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הזרקת מיקרו, תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, השתמש-מניפולטור מיקרו שבצד שמאל כדי למקם את (האנודה) חיובי 2 מ&quot;מ הקדמי-הגחון אלקטרודה פלטינה אל שלפוחית ​​תקין otic לבין אלקטרודה 2 מ&quot;מ שלילית (הקתודה) במקביל 1 מ&quot;מ זה מזה (ראה איור ג 1). לספק 4 פעימות ב 12 V עם 100 משך msec וריווח 200 msec. שלפוחית ​​otic עזבה משמשת קבוצת ביקורת פנימית. הערה: יש לנקות את האלקטרודות בין electroporations עם מקלון צמר גפן שקצהו טבול 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב assay שגשוג התאים לג&#39;ימי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר electroporation להוסיף 50 μl של 0.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​edu ב 1x PBS על ידי הטלת ידני 50 μl פתרון Edu על כלהעובר ב אובו בעזרת פיפטה. חותם את הביצים עם קלטת ולחזור בחממה במשך 18 - 96 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הקלטת ולבדוק את העוברים על אות ה- GFP או RFP ניאון בתוך שלפוחית ​​otic לאחר 18 - 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי (ראה איור 1 א &#39;א&#39; &#39;). אם אות ניאון הוא ההווה, בשלב זה לקצור את העוברים ניתוחים או לאטום עם קלטת ולהחזיר אותו אל האינקובטור לקציר ומנתח בשלבים מאוחרים יותר (ראה איור 1 FP &#39;&#39;). הערה: הביטוי של אות ה- GFP עם מבנה pMES-IRES-GFP ניכר 6 - 7 שעות לאחר electroporation 10. </li></ol></li></ol> קציר העובר 3. עיבוד רקמות עבור RNA הכלאה באתרו ו אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את העוברים באמצעות מלקחיים. יש לשטוף את העובר ב PBS 1x הקר. הסר את הראש של העוברים, על ידי חיתוך הראש בצווארובאמצעות מלקחיים, ומניחים את הראש לתוך O paraformaldehyde 4% / N ב 4 ° C. לנקב את המוח באמצעות מלקחיים כדי לאפשר חדיר של paraformaldehyde 4% בתוך הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הראשים סוכרוז 30% (ב 1x PBS) O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר ראשי במדיום cryoprotective ידי להקפאה מהירה בתוך slurry קרח methylbutane יבש (2-Methylbutane). לחלופין, מהיר להקפיא את הראשים במדיום cryoprotective עם חנקן נוזלי. אחסן את ראשי הרכוב ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection הראשי לתוך 12 מיקרומטר סעיפי רקמה עבים לאסוף את כל חלקי רקמה הפנימיים המכילה אוזן על גבי שקופיות זכוכית מיקרוסקופ superfrosted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RNA תקן הכלאה באתרו אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר לעיל 4,21, ולנתח עבור התפשטות תאים edu בעקבות פרוטוקול שסיפק היצרן של הערכה. הערה: תאי שיער ניתן לזהות באמצעות ארנב polyclonal α-MyosinVIIa (Myo7a)tibody (1: 1,000, Biosciences פרוטאוס) ו נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (1: 250, נגד ארנב עיזים AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> לכידת תמונה 4. ועיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות עם ציוד הדמיה דיגיטלית. תוצאות אימונוהיסטוכימיה תמונה עם מיקרוסקופ ותוצאות תקן הניאון של באתרו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטי (החל 5x כדי 40x בהגדלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken.">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li><li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+mammalian+cochlea.">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li><li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+inner+ear.">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 32, 112-118 (2015).</li><li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development.">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li><li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear.">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li><li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+production+in+the+chicken+cochlea.">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li><li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos.">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li><li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo.">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements.">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li><li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode:+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear.">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li><li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear:+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1.">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li><li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick.">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li><li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1.">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871 (2012).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation.">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li><li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family.">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li><li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla.">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs.">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li><li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode.">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה המתוארת כאן של מיקרו-electroporation אובו מותאמת במיוחד עבור העברת גנים לתוך איבר השמיעה מתפתחות. זה תואם עם וקטורי ביטוי פלסמיד מבוסס DNA משמשים בדרך כלל כדי לתפעל גן פונקציה / ביטוי. העיתוי של electroporation ב E4 הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. הש...

למרות הבדלים במורפולוגיה דפוסים הסלולר בין יונקי איבר חישת שמיעת עופות, הגורמים המולקולריים והשבילים אחראים לפיתוח HC חושי נחשבים ישומרו 1-3 אבולוציונית. את הגבשושיות basilar, שבו שוכנים HCS שמיעתי גיל שמסביב שלהם, מפתחת כקובץ outpocketing של otocyst האוזן הפנימית. מוקדם על מאגר של אבות HC ו SC המצוין בתוך placode otic / כוס otic עצבית-החושי התחום המוסמך (NSD). נתוני גורל מיפוי לספק ראיות כי שושלות עצביות ועל חושים תהיינה צמודות לנבוע NSD ממוקם באזור הגחון-אנטרו של כוס otic או otocyst בעכברים ועוף 4,5. ראשית, neuroblasts delaminate מן NSD להצמיח נוירונים של גנגליון השמיעתי-שיווי משקל, אשר בסופו של דבר התפצל גרעינים שמיעתיים שיווי משקל. נוירונים אלה מעצבב HCS החושית של האוזן הפנימית גרעינים בגזע המוח. תאי הב להישאר NSD נחשבים להצמיח טלאים חושיים שונים, כוללים איבר חישת השמיעה, מורכב של HCS החושית transducing-mechano ו SCS הקשורים בם. בשני האפרוח ואת Murine, יציאת אב חוש שמיעת איבר מחזור התא והבחנת HC להתרחש מנוגדים הדרגתיים. בשנת חומוס, יציאה-מחזור תא שמיעת אבי מתחילה בסביבות ~ E5 ומתקדם מהבסיס אל הקודקוד, ומן המרכז לפריפריה 6. יום אחד מאוחר יותר, בידול HC מתחיל ב איפקס ומתקדם לבסיס 7. לימוד הפיתוח של האוזן הפנימית עוף מספק יתרונות טכניים רבים ככל שניתן לחקור מנגנונים תפקודיים בקלות יחסית ב אובו בניגוד המניפולציה עוברת ברחם במערכות מודל אחרים, מחייב ניתוחים מורכבים. השיטה המתוארת כאן משתמשת במיקרו-electroporation אובו למקד הגנים של עניין באזילה משוערתr באזור פטמית-ventrally הקדמי של שלפוחית ​​otic ספציפית E4. Electroporation ב אובו הוא טכניקה כי הוא מבוסס היטב נפוץ 8-14. העיקרון של טכניקת electroporation מבוסס על העובדה כי נוקלאוטידים (למשל, ה- DNA פלסמיד, DNA הסינטטי, או RNA oligonucleotides) הם בעלי מטען שלילי. ה- DNA מוזרק לתוך הרקמה של עניין. כאשר זרם חשמלי ומוצבות הרקמות, הזרם פותח נקבוביים חולף מרכיבי דופן התא ומאפשר הספיג של DNA, כמו ה- DNA המטען השלילי זורם לכיוון האלקטרודה החיובית (האנודה). בניסויים הרווחים של פונקציה, גנים של עניין הם subcloned נפוץ לתוך פלסמידים ביטוי המכילים קלטות ביטוי מתאימות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). בניסויים הפסד של פונקציה בונה מדכא שלילי דומיננטי מבוססי פלסמיד, או RNAi, או בונה morpholino הם גommonly בשימוש 15,16. כדי לעכב microRNA (מירנה) miRNAs פונקציה בונה ספוג, שהן בדרך כלל פלסמיד מבוסס, יכול לשמש 17. השיטה המתוארת כאן מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים התפשטות והבחנה באיבר השמיעה, כמו בשיטה מיקרו-electroporation אובו ניתן לשלב בקלות עם ב assay שגשוג התאים אובו ידי הוספת edu לעובר שלם. את electroporation והוספת edu מתבצע E4 של שלפוחית ​​otic, שהוא יום אחד לפני תחילת היציאה מחזור התא באיבר השמיעה. ניתוח של איבר השמיעה הוא בדרך כלל מבוצע 18 - 96 שעות לאחר electroporation ב E5 (תחילת יציאת מחזור תא ובתאים חושיים), E6 (תחילת בידול HC), ו E7 (במהלך התמיינות HC); ובהמשך עד ~ E9 (סוף בידול HC). שיטת electroporation זה של העברת גנים הוא חולף שנמשך כ ~ 4 ימים, because הגנים של עניין לא להשתלב בגנום, אבל השיטה ישימה לשימוש עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד המתאים, אשר יש להם את היכולת להשתלב בגנום, כגון העברת גנים בתיווך Tol2 11. באמצעות שיטה זו GFP החזק או ביטוי RFP נמשך ~ 4 ימי השבלול, ולאחר מכן הם האותות לדעוך, עדיין מספקים חלון זמן מספיק כדי ללמוד על ההתפתחות הסבוכה של איבר השמיעה. זה בשיטת העברת גני אובו הוא רומן ומאפשר למקד את איבר השמיעה המשוער ספציפית E4, שבו הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. זוהי תוספת טובה שיטות חלופיות, אשר electroporate בבית הרבה שלבי התפתחות צעירים 11,12 או בהשוואה לשימוש של תרבויות explant גבשושיות basilar במבחנת 18.

<table><tbody><tr><td>Sterile 1x PBS pH 7.4</td><td>gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF Powder</td><td>Sigma</td><td>F7252-5G</td><td></td></tr><tr><td>EdU Powder</td><td>Invitrogen</td><td>E10187</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10338</td><td></td></tr><tr><td>HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 ElectroSquarePorator&amp;nbsp;</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banana to Micrograbber Cable Kit</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Right Handed &amp;amp; Left Handed Micromanipulators</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M3301R &amp;amp; M3301L</td><td></td></tr><tr><td>Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>M10</td><td></td></tr><tr><td>Metal Steel Base Plate 12x24 inch</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>5479</td><td></td></tr><tr><td>Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors</td><td>World Precision Instruments Inc.&amp;nbsp;</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>Micropippette Puller for pulling needles</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm</td><td>FHC</td><td>27-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton Glass Syringe 100 &amp;mu;l</td><td>Hamilton</td><td>80601 Model 710LT</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>O122-1</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td><td></td></tr><tr><td>3 cc Disposable Syringes</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Disposable 21 Gauge Needles</td><td>Becton Dickinson and Company (BD)</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>One pair of 2 mm Platinum Electrodes</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY611P3-2</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Holder</td><td>Bulldog Bio. / Nepagene</td><td>CUY580</td><td></td></tr><tr><td>One pair of Dumont fine forceps number 5</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matte finish invisible tape for sealing eggs</td><td>Office Depot</td><td>520-928</td><td></td></tr><tr><td>Cotton-Tipped Swabs</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Sterile filter tips</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation

עוברי עוף הם מערכות מודל אידיאלי ללימוד ההתפתחות העוברית מניפולציות של תפקוד הגן ניתן לבצע בקלות יחסית ב אובו. האורגן החושי השמיעה באוזן הפנימית הוא קריטי ליכולת שלנו לשמוע. זה בתים האפיתל חושי מאוד מיוחד שמורכב בתאי שיער transducing-mechano (HCS) וסביבת גליה דמוית תאים תומכים (SCS). למרות הבדלים מבניים באיברי השמיעה, מנגנונים מולקולריים להסדיר את הפיתוח של איבר השמיעה שמורים אבולוציונית בין יונקי עופות ב electroporation אובו מוגבל בעיקר בשלבים מוקדמים ב E1 -. E3. בשל ההתפתחות מאוחר יחסית של איבר השמיעה ב E5, מניפולציות של איבר השמיעה על ידי ב electroporation אובו בעבר E3 הן להיתקל בקשיים עקב הפיתוח המתקדם של עובר העוף בשלבים מאוחר יותר. השיטה המוצגת כאן היא שיטת העברת גנים חולפת למיקוד גנים של ריביתבשלב E4 - E4.5 באיבר חושי השמיעה עוף בפיתוח באמצעות in-electroporation מיקרו אובו. שיטה זו חלה על gain- ואובדן-של-פונקציות עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד הקונבנציונלי יכולה להיות משולבת עם ב assay שגשוג תאי אובו ידי הוספת EDU (5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine) לעובר השלם בבית זמן של electroporation. השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום (GFP או RFP) פלסמידים הביטוי מאפשר הנסיין לברר במהירות אם electroporation בהצלחה ממוקד החלק השמיעתי של האוזן הפנימית בפיתוח. במאמר שיטה זו, דוגמאות מייצגות של דגימות electroporated GFP מומחשות; עובר נבצרו 18 - 96 שעות לאחר electroporation ומיקוד של GFP לאזור פרו-החושי של איבר השמיעה אושר על ידי RNA כלאה באתרה. עיתון השיטה גם מספק פרוטוקול אופטימיזציה עבור שימוש thymidine אנלוגי edu לנתח תא proliferation; דוגמא assay התפשטות תאים מבוססת edu המשלב תיוג חיסוני ולחץ כימית edu מסופקת.

ב DNA פלסמיד נייר שיטה זו מורכבת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קלטות ביטוי הייתה ממוקדת לתוך פטמית basilar עוף מתפתחות (BP) עם פרמטרים אופטימיזציה של 12 וולט ו -4 פעימות עם 100 משך ומרווחי דופק msec של 200 msec, מניב ~ 50% שיעור הישרדות עובר ויעילות של ה- DNA פלסמיד מיקוד ...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation at JoVE.com

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

9.4K Views.  The Johns Hopkins University, School of Medicine. The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ. 

Video: Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס<em&gt; In vivo</em&gt; Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Neuroscience

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ב electroporation לג&#39;ימי של המוח התיכון צ&#39;יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial and temporal control of ectopic microRNA expression. However, ventral brain structures like ventral midbrain are rather difficult to reach for any manipulations. Here, we demonstrate an efficient way to electroporate miRNA into ventral midbrain using thin platinum electrodes. This method offers a reliable way to transfect specific areas of the midbrain and a useful tool for in vivo studies.

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Ectopic expression is one technique to elucidate the microRNAs role in brain development. However, targeting specific areas using in ovo electroporation is challenging. Here, we show an efficient way to selectively electroporate ventral and dorsal midbrain regions.

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ&#39;יק מוח התיכון

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is comparatively very easy to manipulate the chick embryonic retina using recombinant DNA/RNA technology. Electroporation of DNA/RNA constructs into the embryonic retina have a great advantage to study gene regulation in retinal stem/progenitor cells during retinal development. Different type of assays such as reporter gene assay, gene over-expression, gene knock down (shRNA) etc. can be performed using the electroporation technique. This video demonstrates targeted retinal injection and in ovo electroporation into the embryonic chick retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). Here we show a rapid and convenient in ovo electroporation technique whereby a plasmid DNA that expresses green fluorescent protein (GFP) as a marker is directly delivered into the chick embryonic subretinal space and followed by electric pulses to facilitate DNA uptake by retinal stem/progenitor cells. The new method of retinal injection and electroporation at E4 allows the visualization of all retinal cell types, including the late-born neurons1, which has been difficult with the conventional method of injection and electroporation at E1.52.

In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina

The overall goal of this video is to show how to perform targeted retinal injection and in ovo electroporation of DNA/RNA constructs into the chick embryonic retina at the Hamburger and Hamilton stage 22-23, which is about embryonic day 4 (E4). This technique is very useful to study gene expression, gene regulation, and morphological change in developing chick retina.

ב electroporation לג&#39;ימי ברשתית צ&#39;יק עובריים

Chicken embryonic retina is an excellent tool to study retinal development in higher vertebrates. Because of large size and external development, it is ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation

ב Electroporations אובו של HH 10 עוברים שלב עוף

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס

ב electroporation לג'ימי של המוח התיכון צ'יק לחקר תפקוד הגן בהתפתחות Neuron דופאמין

בביטוי אוב של microRNA בגחון צ'יק מוח התיכון

בשיטות אובו ואקס אובו לחקר התפתחות האוזן הפנימית של העופות

ב electroporation לג'ימי ברשתית צ'יק עובריים

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo