אנו מודים לד&quot;ר דוריס ק וו עבור פלסמידים הביטוי והן בדיקות באתרו, במרכז האוניברסיטאי ג&#39;ונס הופקינס עבור מתקן הדמיה ביולוגיה חושי והמרכז השמיעה ושיווי המשקל. עבודה זו נתמכה על ידי NIDCD גרנט T32 DC000023 אל LE

הביצים עובר שלא נולד הם דאגו וטפלו אתיים ובאנושיות. כל הפרוטוקולים לשימוש עובר שלא נולד אושרו על ידי הטיפול בבעלי חי הוועדה השתמשתי בבית ספר ג&#39;ונס הופקינס לרפואה, בולטימור, מרילנד. 1. ביצים הכנת בונה הביטוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 3 - 4 ביצים עוף מופרית תריסר (גאלוס גאלוס) שוכב על צדם על 37 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות של דגירה, למשוך 3 סמ&quot;ק של חלבון עם מזרק מתום הסיבוב לאחור של הביצה לאטום את החור עם קלטת ברורה. זה יוצר אוויר בין העובר לבין קליפת הביצה, המאפשר נוחות הגישה עובר ללא עובר דבק הקליפה בעת חיתוך בחלון לגישה על גבי הביצה 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 117 שעות של זמן דגירה, לביים את העוברים על פי המבורגר המילטון 20 שלבי התפתחותב E4 (HH24-25) (ראה איור 1D). </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביטוי בונה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה- DNA פלסמיד באמצעות ריאגנטים והפרוטוקול שספק היצרן של ערכת הכנה זמינה מסחרי. בצעד של הכנה הסופי, elute את ה- DNA לתוך 500 μl TE (טריס-EDTA) חיץ המסופק בערכה לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתנול להאיץ את ה- DNA להתרכז אותו על ידי הוספת 50 μl של 3 M נתרן אצטט 1 מ&quot;ל של אתנול 100% אל הצינור. מניחים את הצינור ב -20 ° CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור במשך 30 דקות ב 14,000 סל&quot;ד ב 4 ° C.. הסר את supernatant ואוויר-יבש גלולה במשך 10 דקות ב RT. ממיסים את גלולה ב 15 μl חיץ TE, אשר אמור להניב ריכוז של ~ 4 מיקרוגרם / μl. ההערה: בונת ביטוי השליטה בשימוש הנה pMES-IRES-GFP 10, אשר מונע על ידי אמרגן העוף β-יקטין, או-H2B PCI-IRES-RFP <sעד&gt; 10, אשר מונע על ידי האמרגן CMV. </li></ol></li></ol> 2. עוף ב אובו מיקרו electroporation ו ב assay שגשוג התאים לג&#39;ימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב אובו מיקרו הזרקה של Construct הביטוי-electroporation מיקרו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את צינורות זכוכית נימי לתוך מחטים דקות באמצעות חולץ מיקרו-פיפטה עם פרמטרים אופטימיזציה הבאים עבור 2.5 x 2.5 מ&quot;מ Box פלטינום חימום נימה: לחץ = 500, חום = 600 ° C, משוך = 64, מהירות = 105, ושעה = 150 msec (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מתייחסות לזה בשלבים-מניפולטור מיקרו ימניים איגוף המיקרוסקופ (ראו איור 1 א). The-מניפולטור מייקרו הימני מחזיק את מחט נימי הזכוכית במייקרו-מניפולטור האם אתה השמאלי מחזיק האלקטרודות (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מחט זכוכית נימי דק משכו עבור הזרקת מיקרו ידי חיתוךקצה המחט עם מלקחיים תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המחט באופן ידני על ידי היד באמצעות-מניפולטור מיקרו עם 2.5 μl של ה- DNA פלסמיד כהים עם 0.1% Fast הירוק תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הביצה שוכבת על צידו בתוך מכשיר חזק עובש / ביצה (ראה איור 1 א). חותכי חלון עגול על גבי הביצה באמצעות מספריים 19 (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי העבודה תחת מיקרוסקופ, לפתוח בזהירות את שתי ממברנות שכיסו את העובר באמצעות מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, לספק כ ~ 0.5 μl של ה- DNA פלסמיד לומן שלפוחית ​​תקין otic ידי הזרקת מיקרו באופן ידני באמצעות יד ימין באמצעות-מניפולטור מיקרו ידי-electroporation מיקרו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, מיקרו-להזריק לומן שלפוחית ​​otic תקין עם ה- DNA עם-מניפולטור מיקרו ימנית ביד (איור 1 ב- D) בעוד באותו זמן באמצעות אוחזים ביד שמאלמלקחי ga כדי לייצב את הראש של העובר, כי הראש של העובר טובל בשלב E4. אל מיקרו-להזריק בעבר לומן שלפוחית ​​otic, כי זה יפגע שלפוחית ​​otic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הזרקת מיקרו, תוך כדי עבודה תחת מיקרוסקופ, השתמש-מניפולטור מיקרו שבצד שמאל כדי למקם את (האנודה) חיובי 2 מ&quot;מ הקדמי-הגחון אלקטרודה פלטינה אל שלפוחית ​​תקין otic לבין אלקטרודה 2 מ&quot;מ שלילית (הקתודה) במקביל 1 מ&quot;מ זה מזה (ראה איור ג 1). לספק 4 פעימות ב 12 V עם 100 משך msec וריווח 200 msec. שלפוחית ​​otic עזבה משמשת קבוצת ביקורת פנימית. הערה: יש לנקות את האלקטרודות בין electroporations עם מקלון צמר גפן שקצהו טבול 1x PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב assay שגשוג התאים לג&#39;ימי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר electroporation להוסיף 50 μl של 0.25 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​edu ב 1x PBS על ידי הטלת ידני 50 μl פתרון Edu על כלהעובר ב אובו בעזרת פיפטה. חותם את הביצים עם קלטת ולחזור בחממה במשך 18 - 96 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הקלטת ולבדוק את העוברים על אות ה- GFP או RFP ניאון בתוך שלפוחית ​​otic לאחר 18 - 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי (ראה איור 1 א &#39;א&#39; &#39;). אם אות ניאון הוא ההווה, בשלב זה לקצור את העוברים ניתוחים או לאטום עם קלטת ולהחזיר אותו אל האינקובטור לקציר ומנתח בשלבים מאוחרים יותר (ראה איור 1 FP &#39;&#39;). הערה: הביטוי של אות ה- GFP עם מבנה pMES-IRES-GFP ניכר 6 - 7 שעות לאחר electroporation 10. </li></ol></li></ol> קציר העובר 3. עיבוד רקמות עבור RNA הכלאה באתרו ו אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר את העוברים באמצעות מלקחיים. יש לשטוף את העובר ב PBS 1x הקר. הסר את הראש של העוברים, על ידי חיתוך הראש בצווארובאמצעות מלקחיים, ומניחים את הראש לתוך O paraformaldehyde 4% / N ב 4 ° C. לנקב את המוח באמצעות מלקחיים כדי לאפשר חדיר של paraformaldehyde 4% בתוך הראש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייבשים את הראשים סוכרוז 30% (ב 1x PBS) O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר ראשי במדיום cryoprotective ידי להקפאה מהירה בתוך slurry קרח methylbutane יבש (2-Methylbutane). לחלופין, מהיר להקפיא את הראשים במדיום cryoprotective עם חנקן נוזלי. אחסן את ראשי הרכוב ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryosection הראשי לתוך 12 מיקרומטר סעיפי רקמה עבים לאסוף את כל חלקי רקמה הפנימיים המכילה אוזן על גבי שקופיות זכוכית מיקרוסקופ superfrosted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע RNA תקן הכלאה באתרו אימונוהיסטוכימיה כפי שתואר לעיל 4,21, ולנתח עבור התפשטות תאים edu בעקבות פרוטוקול שסיפק היצרן של הערכה. הערה: תאי שיער ניתן לזהות באמצעות ארנב polyclonal α-MyosinVIIa (Myo7a)tibody (1: 1,000, Biosciences פרוטאוס) ו נוגדנים משני שכותרתו fluorescently (1: 250, נגד ארנב עיזים AlexaFluor 488; Invitrogen). </li></ol> לכידת תמונה 4. ועיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות עם ציוד הדמיה דיגיטלית. תוצאות אימונוהיסטוכימיה תמונה עם מיקרוסקופ ותוצאות תקן הניאון של באתרו באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב סטנדרטי (החל 5x כדי 40x בהגדלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את התמונות באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bissonnette, J. P., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+atlas+of+the+gross+anatomy+of+the+developing+inner+ear+of+the+chicken.">Standard atlas of the gross anatomy of the developing inner ear of the chicken.</a> The Journal of comparative neurology. 368, 620-630 (1996).</li><li>Cantos, R., Cole, L. K., Acampora, D., Simeone, A., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+of+the+mammalian+cochlea.">Patterning of the mammalian cochlea.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 11707-11713 (2000).</li><li>Whitfield, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+inner+ear.">Development of the inner ear.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 32, 112-118 (2015).</li><li>Raft, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-regulation+of+Ngn1+and+Math1+coordinates+the+production+of+neurons+and+sensory+hair+cells+during+inner+ear+development.">Cross-regulation of Ngn1 and Math1 coordinates the production of neurons and sensory hair cells during inner ear development.</a> Development. 134, 4405-4415 (2007).</li><li>Satoh, T., Fekete, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+analysis+of+the+relationships+between+mechanosensory+cells+and+the+neurons+that+innervate+them+in+the+chicken+ear.">Clonal analysis of the relationships between mechanosensory cells and the neurons that innervate them in the chicken ear.</a> Development. 132, 1687-1697 (2005).</li><li>Katayama, A., Corwin, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+production+in+the+chicken+cochlea.">Cell production in the chicken cochlea.</a> The Journal of comparative neurology. 281, 129-135 (1989).</li><li>Cotanche, D. A., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+stereociliary+bundles+in+the+cochlear+duct+of+chick+embryos.">The development of stereociliary bundles in the cochlear duct of chick embryos.</a> Brain Res. 318, 181-193 (1984).</li><li>Alsina, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+is+required+for+determination+of+otic+neuroblasts+in+the+chick+embryo.">FGF signaling is required for determination of otic neuroblasts in the chick embryo.</a> Developmental biology. 267, 119-134 (2004).</li><li>Chang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp4+is+essential+for+the+formation+of+the+vestibular+apparatus+that+detects+angular+head+movements.">Bmp4 is essential for the formation of the vestibular apparatus that detects angular head movements.</a> PLoS genetics. 4, e1000050 (2008).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3879-3890 (2013).</li><li>Freeman, S., Chrysostomou, E., Kawakami, K., Takahashi, Y., Daudet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2-mediated+gene+transfer+and+in+ovo+electroporation+of+the+otic+placode:+a+powerful+and+versatile+approach+for+investigating+embryonic+development+and+regeneration+of+the+chicken+inner+ear.">Tol2-mediated gene transfer and in ovo electroporation of the otic placode: a powerful and versatile approach for investigating embryonic development and regeneration of the chicken inner ear.</a> Methods in molecular biology. 916, 127-139 (2012).</li><li>Kamaid, A., Neves, J., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Id+gene+regulation+and+function+in+the+prosensory+domains+of+the+chicken+inner+ear:+a+link+between+Bmp+signaling+and+Atoh1.">Id gene regulation and function in the prosensory domains of the chicken inner ear: a link between Bmp signaling and Atoh1.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30, 11426-11434 (2010).</li><li>Neves, J., Kamaid, A., Alsina, B., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+Sox2+and+Sox3+in+neuronal+and+sensory+progenitors+of+the+developing+inner+ear+of+the+chick.">Differential expression of Sox2 and Sox3 in neuronal and sensory progenitors of the developing inner ear of the chick.</a> The Journal of comparative neurology. 503, 487-500 (2007).</li><li>Neves, J., Uchikawa, M., Bigas, A., Giraldez, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prosensory+function+of+Sox2+in+the+chicken+inner+ear+relies+on+the+direct+regulation+of+Atoh1.">The prosensory function of Sox2 in the chicken inner ear relies on the direct regulation of Atoh1.</a> PLoS One. 7, 30871 (2012).</li><li>Das, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust+system+for+RNA+interference+in+the+chicken+using+a+modified+microRNA+operon.">A robust system for RNA interference in the chicken using a modified microRNA operon.</a> Developmental biology. 294, 554-563 (2006).</li><li>Wu, C. Y., Hooper, R. M., Han, K., Taneyhill, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migratory+neural+crest+cell+alphaN-catenin+impacts+chick+trigeminal+ganglia+formation.">Migratory neural crest cell alphaN-catenin impacts chick trigeminal ganglia formation.</a> Developmental biology. 392, 295-307 (2014).</li><li>Kumar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+non-small+cell+lung+tumor+development+by+the+let-7+microRNA+family.">Suppression of non-small cell lung tumor development by the let-7 microRNA family.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3903-3908 (2008).</li><li>Jacques, B. E., Dabdoub, A., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf+signaling+regulates+development+and+transdifferentiation+of+hair+cells+and+supporting+cells+in+the+basilar+papilla.">Fgf signaling regulates development and transdifferentiation of hair cells and supporting cells in the basilar papilla.</a> Hearing research. 289, 27-39 (2012).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , e306 (2007).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of morphology. 88, 49-92 (1951).</li><li>Oh, S. H., Johnson, R., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+bone+morphogenetic+proteins+in+the+developing+vestibular+and+auditory+sensory+organs.">Differential expression of bone morphogenetic proteins in the developing vestibular and auditory sensory organs.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 16, 6463-6475 (1996).</li><li>Bell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+segregation+of+auditory+and+vestibular+neurons+in+the+otic+placode.">Spatial and temporal segregation of auditory and vestibular neurons in the otic placode.</a> Developmental biology. 322, 109-120 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

השיטה המתוארת כאן של מיקרו-electroporation אובו מותאמת במיוחד עבור העברת גנים לתוך איבר השמיעה מתפתחות. זה תואם עם וקטורי ביטוי פלסמיד מבוסס DNA משמשים בדרך כלל כדי לתפעל גן פונקציה / ביטוי. העיתוי של electroporation ב E4 הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. הש...

למרות הבדלים במורפולוגיה דפוסים הסלולר בין יונקי איבר חישת שמיעת עופות, הגורמים המולקולריים והשבילים אחראים לפיתוח HC חושי נחשבים ישומרו 1-3 אבולוציונית. את הגבשושיות basilar, שבו שוכנים HCS שמיעתי גיל שמסביב שלהם, מפתחת כקובץ outpocketing של otocyst האוזן הפנימית. מוקדם על מאגר של אבות HC ו SC המצוין בתוך placode otic / כוס otic עצבית-החושי התחום המוסמך (NSD). נתוני גורל מיפוי לספק ראיות כי שושלות עצביות ועל חושים תהיינה צמודות לנבוע NSD ממוקם באזור הגחון-אנטרו של כוס otic או otocyst בעכברים ועוף 4,5. ראשית, neuroblasts delaminate מן NSD להצמיח נוירונים של גנגליון השמיעתי-שיווי משקל, אשר בסופו של דבר התפצל גרעינים שמיעתיים שיווי משקל. נוירונים אלה מעצבב HCS החושית של האוזן הפנימית גרעינים בגזע המוח. תאי הב להישאר NSD נחשבים להצמיח טלאים חושיים שונים, כוללים איבר חישת השמיעה, מורכב של HCS החושית transducing-mechano ו SCS הקשורים בם. בשני האפרוח ואת Murine, יציאת אב חוש שמיעת איבר מחזור התא והבחנת HC להתרחש מנוגדים הדרגתיים. בשנת חומוס, יציאה-מחזור תא שמיעת אבי מתחילה בסביבות ~ E5 ומתקדם מהבסיס אל הקודקוד, ומן המרכז לפריפריה 6. יום אחד מאוחר יותר, בידול HC מתחיל ב איפקס ומתקדם לבסיס 7. לימוד הפיתוח של האוזן הפנימית עוף מספק יתרונות טכניים רבים ככל שניתן לחקור מנגנונים תפקודיים בקלות יחסית ב אובו בניגוד המניפולציה עוברת ברחם במערכות מודל אחרים, מחייב ניתוחים מורכבים. השיטה המתוארת כאן משתמשת במיקרו-electroporation אובו למקד הגנים של עניין באזילה משוערתr באזור פטמית-ventrally הקדמי של שלפוחית ​​otic ספציפית E4. Electroporation ב אובו הוא טכניקה כי הוא מבוסס היטב נפוץ 8-14. העיקרון של טכניקת electroporation מבוסס על העובדה כי נוקלאוטידים (למשל, ה- DNA פלסמיד, DNA הסינטטי, או RNA oligonucleotides) הם בעלי מטען שלילי. ה- DNA מוזרק לתוך הרקמה של עניין. כאשר זרם חשמלי ומוצבות הרקמות, הזרם פותח נקבוביים חולף מרכיבי דופן התא ומאפשר הספיג של DNA, כמו ה- DNA המטען השלילי זורם לכיוון האלקטרודה החיובית (האנודה). בניסויים הרווחים של פונקציה, גנים של עניין הם subcloned נפוץ לתוך פלסמידים ביטוי המכילים קלטות ביטוי מתאימות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). בניסויים הפסד של פונקציה בונה מדכא שלילי דומיננטי מבוססי פלסמיד, או RNAi, או בונה morpholino הם גommonly בשימוש 15,16. כדי לעכב microRNA (מירנה) miRNAs פונקציה בונה ספוג, שהן בדרך כלל פלסמיד מבוסס, יכול לשמש 17. השיטה המתוארת כאן מאפשר לחקור את המנגנונים המולקולריים השולטים התפשטות והבחנה באיבר השמיעה, כמו בשיטה מיקרו-electroporation אובו ניתן לשלב בקלות עם ב assay שגשוג התאים אובו ידי הוספת edu לעובר שלם. את electroporation והוספת edu מתבצע E4 של שלפוחית ​​otic, שהוא יום אחד לפני תחילת היציאה מחזור התא באיבר השמיעה. ניתוח של איבר השמיעה הוא בדרך כלל מבוצע 18 - 96 שעות לאחר electroporation ב E5 (תחילת יציאת מחזור תא ובתאים חושיים), E6 (תחילת בידול HC), ו E7 (במהלך התמיינות HC); ובהמשך עד ~ E9 (סוף בידול HC). שיטת electroporation זה של העברת גנים הוא חולף שנמשך כ ~ 4 ימים, because הגנים של עניין לא להשתלב בגנום, אבל השיטה ישימה לשימוש עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד המתאים, אשר יש להם את היכולת להשתלב בגנום, כגון העברת גנים בתיווך Tol2 11. באמצעות שיטה זו GFP החזק או ביטוי RFP נמשך ~ 4 ימי השבלול, ולאחר מכן הם האותות לדעוך, עדיין מספקים חלון זמן מספיק כדי ללמוד על ההתפתחות הסבוכה של איבר השמיעה. זה בשיטת העברת גני אובו הוא רומן ומאפשר למקד את איבר השמיעה המשוער ספציפית E4, שבו הוא אופטימלי עבור חקירות המתמקדות בפיתוח HC באיבר השמיעה. זוהי תוספת טובה שיטות חלופיות, אשר electroporate בבית הרבה שלבי התפתחות צעירים 11,12 או בהשוואה לשימוש של תרבויות explant גבשושיות basilar במבחנת 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1129">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:621px;">Sterile 1x PBS pH 7.4</td>
			<td style="width:249px;">gibco</td>
			<td style="width:259px;">10010-023</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green FCF Powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7252-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EdU Powder</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>E10187</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Click-IT EdU Alexa Fluor 555 Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10338</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HiSpeed Plasmid Midi Kit (25)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td align="right">12643</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ECM 830 ElectroSquarePorator&#160;</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Banana to Micrograbber Cable Kit</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0216</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Right Handed &#38; Left Handed Micromanipulators</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>M3301R &#38; M3301L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Two 12 mm Magnetic Holding Device Stages with 7 inch vertical posts</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td>M10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metal Steel Base Plate 12x24 inch</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td align="right">5479</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors for Eggs 12 cm long curved, 12 mm extrafine blades; Spring Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments Inc.&#160;</td>
			<td align="right">14120</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micropippette Puller for pulling needles</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td>P-97</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.5x2.5 mm Box Platinum Heating Filament</td>
			<td>Sutter Instrument Co.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Capillary Tubes/Needles/No Fiber/Borosil 1 mm</td>
			<td>FHC</td>
			<td>27-30-0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hamilton Glass Syringe 100 &#956;l</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601 Model 710LT</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mineral Oil (Heavy) for Hamilton Glass Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O122-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing for connecting the Glass Syringe and Glass Cappillary Needles/ Non Toxic</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>427420 Intramedic Clay Adams Brand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3 cc Disposable Syringes</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td align="right">309657</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable 21 Gauge Needles</td>
			<td>Becton Dickinson and Company (BD)</td>
			<td align="right">305122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of 2 mm Platinum Electrodes</td>
			<td>Bulldog Bio. / Nepagene</td>
			<td>CUY611P3-2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electrode Holder</td>
			<td>Bulldog Bio. / Nepagene</td>
			<td>CUY580</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">One pair of Dumont fine forceps number 5</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matte finish invisible tape for sealing eggs</td>
			<td>Office Depot</td>
			<td>520-928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cotton-Tipped Swabs</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-101</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile filter tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation

עוברי עוף הם מערכות מודל אידיאלי ללימוד ההתפתחות העוברית מניפולציות של תפקוד הגן ניתן לבצע בקלות יחסית ב אובו. האורגן החושי השמיעה באוזן הפנימית הוא קריטי ליכולת שלנו לשמוע. זה בתים האפיתל חושי מאוד מיוחד שמורכב בתאי שיער transducing-mechano (HCS) וסביבת גליה דמוית תאים תומכים (SCS). למרות הבדלים מבניים באיברי השמיעה, מנגנונים מולקולריים להסדיר את הפיתוח של איבר השמיעה שמורים אבולוציונית בין יונקי עופות ב electroporation אובו מוגבל בעיקר בשלבים מוקדמים ב E1 -. E3. בשל ההתפתחות מאוחר יחסית של איבר השמיעה ב E5, מניפולציות של איבר השמיעה על ידי ב electroporation אובו בעבר E3 הן להיתקל בקשיים עקב הפיתוח המתקדם של עובר העוף בשלבים מאוחר יותר. השיטה המוצגת כאן היא שיטת העברת גנים חולפת למיקוד גנים של ריביתבשלב E4 - E4.5 באיבר חושי השמיעה עוף בפיתוח באמצעות in-electroporation מיקרו אובו. שיטה זו חלה על gain- ואובדן-של-פונקציות עם וקטורי ביטוי מבוסס DNA פלסמיד הקונבנציונלי יכולה להיות משולבת עם ב assay שגשוג תאי אובו ידי הוספת EDU (5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine) לעובר השלם בבית זמן של electroporation. השימוש של חלבון פלואורסצנטי ירוק או אדום (GFP או RFP) פלסמידים הביטוי מאפשר הנסיין לברר במהירות אם electroporation בהצלחה ממוקד החלק השמיעתי של האוזן הפנימית בפיתוח. במאמר שיטה זו, דוגמאות מייצגות של דגימות electroporated GFP מומחשות; עובר נבצרו 18 - 96 שעות לאחר electroporation ומיקוד של GFP לאזור פרו-החושי של איבר השמיעה אושר על ידי RNA כלאה באתרה. עיתון השיטה גם מספק פרוטוקול אופטימיזציה עבור שימוש thymidine אנלוגי edu לנתח תא proliferation; דוגמא assay התפשטות תאים מבוססת edu המשלב תיוג חיסוני ולחץ כימית edu מסופקת.

ב DNA פלסמיד נייר שיטה זו מורכבת של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) קלטות ביטוי הייתה ממוקדת לתוך פטמית basilar עוף מתפתחות (BP) עם פרמטרים אופטימיזציה של 12 וולט ו -4 פעימות עם 100 משך ומרווחי דופק msec של 200 msec, מניב ~ 50% שיעור הישרדות עובר ויעילות של ה- DNA פלסמיד מיקוד ...

Watch this Scientific Journal Video about Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation at JoVE.com

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי<em&gt; ב אובו</em&gt; מיקרו electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

gene-transfer-into-chicken-auditory-organ-ovo-micro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

9.4K Views.  The Johns Hopkins University, School of Medicine. The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ. 

Video: Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

העברה יעילה ג&#39;ין בצ&#39;יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:<em&gt; אקס-אוב</em&gt; גישת Electroporation

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Grafting of Beads into Developing Chicken Embryo Limbs to Identify Signal Transduction Pathways Affecting Gene Expression

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression and activation of signal transduction pathways. This technique allows the delivery of signaling molecules at precisely defined developmental stages for specific times. After this embryos can be harvested and gene expression examined, for example by in situ hybridization, or activation of signal transduction pathways observed with immunostaining.
In this video heparin beads soaked in FGF18 or AG 1-X2 beads soaked in U0126, a MEK inhibitor, are grafted into the limb bud in ovo. This shows that FGF18 induces expression of MyoD and ERK phosphorylation and both endogenous and FGF18 induced MyoD expression is inhibited by U0126. Beads soaked in a retinoic acid antagonist can potentiate premature MyoD induction by FGF18.
This approach can be used with a wide range of different growth factors and inhibitors and is easily adapted to other tissues in the developing embryo.

By grafting beads soaked in growth factors or specific inhibitors of signaling pathways into developing embryos it is possible to directly test their effects in vivo. In this protocol beads are grafted into the limb bud to determine the effects of these molecules on gene expression and signal transduction.

הארכת חרוזים לפיתוח איברי העובר עוף לזהות מסלולי העברת אותות המשפיעים על ביטוי גנים

Using chicken embryos it is possible to test directly the effects of either growth factors or specific inhibitors of signaling pathways on gene expression ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that the chicken embryo is an effective research model for studying basic biological functions of auditory system development. More recently, the chicken embryo has become particularly valuable in studying gene expression, regulation and function associated with hearing. In ovo electroporation can be used to target auditory brainstem regions responsible for highly specialized auditory functions. These regions include the chicken nucleus magnocellularis (NM) and nucleus laminaris (NL). NM and NL neurons arise from distinct precursors of rhombomeres 5 and 6 (R5/R6). Here, we present in ovo electroporation of plasmid-encoded genes to study gene-related properties in these regions. We show a method for spatial and temporal control of gene expression that promote either gain or loss of functional phenotypes. By targeting auditory neural progenitor regions associated with R5/R6, we show plasmid transfection in NM and NL. Temporal regulation of gene expression can be achieved by adopting a tet-on vector system. This is a drug inducible procedure that expresses the genes of interest in the presence of doxycycline (Dox). The in ovo electroporation technique &#8211; together with either biochemical, pharmacological, and or in vivo functional assays &#8211; provides an innovative approach to study auditory neuron development and associated pathophysiological phenomena.

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditory brainstem neurons of avians and mammals are specialized for fast neural encoding, a fundamental process for normal hearing functions. These neurons arise from distinct precursors of embryonic hindbrain. We present techniques utilizing electroporation to express genes in the hindbrain of chicken embryos to study gene function during auditory development.

ב Electrooration Ovo ב המוח עוף שמיעה

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors of the diseases. To validate the contribution of a dysfunction of the mutated genes to disease development, the generation of animal models carrying the mutations is one obvious approach. While germline genetically engineered mouse models (GEMMs) are popular biological tools and exhibit reproducible results, it is restricted by time and costs. Meanwhile, non-germline GEMMs often enable exploring gene function in a more feasible manner. Since some brain diseases (e.g., brain tumors) appear to result from somatic but not germline mutations, non-germline chimeric mouse models, in which normal and abnormal cells coexist, could be helpful for disease-relevant analysis. In this study, we report a method for the induction of CRISPR-mediated somatic mutations in the cerebellum. Specifically, we utilized conditional knock-in mice, in which Cas9 and GFP are chronically activated by the CAG (CMV enhancer/chicken &#223;-actin) promoter after Cre-mediated recombination of the genome. The self-designed single-guide RNAs (sgRNAs) and the Cre recombinase sequence, both encoded in a single plasmid construct, were delivered into cerebellar stem/progenitor cells at an embryonic stage using in utero electroporation. Consequently, transfected cells and their daughter cells were labeled with green fluorescent protein (GFP), thus facilitating further phenotypic analyses. Hence, this method is not only showing electroporation-based gene delivery into embryonic cerebellar cells but also proposing a novel quantitative approach to assess CRISPR-mediated loss-of-function phenotypes.

CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer

Conventional loss-of-function studies of genes using knockout animals have often been costly and time-consuming. Electroporation-based CRISPR-mediated somatic mutagenesis is a powerful tool to understand gene functions in vivo. Here, we report a method to analyze knockout phenotypes in proliferating cells of the cerebellum.

בתיווך CRISPR אובדן ניתוח פונקציה גרגר אסטרוציטומה תאים באמצעות בתוך הרחם מבוסס-אלקטרופורציה את ההעברה של ג'ין

Brain malformation is often caused by genetic mutations. Deciphering the mutations in patient-derived tissues has identified potential causative factors ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Organotypic תלת מימדי התרבויות שיווי המשקל ושמיעתיים אברי החישה

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The continuously growing mouse incisor provides an excellent model to study tissue-specific stem cells. The epithelial tissue-specific stem cells of the incisor are located at the proximal end of the tooth in a niche called the cervical loop. They provide a continuous influx of cells to counterbalance the constant abrasion of the self-sharpening tip of the tooth. Presented here is a detailed protocol for the isolation and culture of the proximal end of the mouse incisor that houses stem cells and their niche. This is a modified Trowell-type organ culture protocol that enables in vitro culture of tissue pieces (explants), as well as the thick tissue slices at the liquid/air interface on a filter supported by a metal grid. The organ culture protocol described here enables tissue manipulations not feasible in vivo, and when combined with the use of a fluorescent reporter(s), it provides a platform for the identification and tracking of discrete cell populations in live tissues over time, including stem cells. Various regulatory molecules and pharmacological compounds can be tested in this system for their effect on stem cells and their niches. This ultimately provides a valuable tool to study stem cell regulation and maintenance.

The Trowell-type organ culture method has been used to unravel complex signaling networks that govern tooth development and, more recently, for studying regulation involved in stem cells of the continuously growing mouse incisor. Fluorescent-reporter animal models and live-imaging methods facilitate in-depth analyses of dental stem cells and their specific niche microenvironment.

שימוש בתרבית איברים מסוג טרוול לחקר ויסות תאי גזע דנטליים

Organ development, function, and regeneration depend on stem cells, which reside within discrete anatomical spaces called stem cell niches. The ...

Isolation of Rat Adipose Tissue Mesenchymal Stem Cells for Differentiation into Insulin-producing Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of stem cells that does not pose any ethical concerns. However, current methods to isolate Ad-MSCs are not standardized and employ complicated protocols that require special equipment. We isolated Ad-MSCs from the epididymal fat of Sprague-Dawley rats using a simple, reproducible method. The isolated Ad-MSCs usually appear within 3 days post isolation, as adherent cells display fibroblastic morphology. Those cells reach 80% confluency within 1 week of isolation. Afterward, at passage 3-5 (P3-5), a full characterization was carried out for the isolated Ad-MSCs by immunophenotyping for characteristic MSC cluster of differentiation (CD) surface markers such as CD90, CD73, and CD105, as well as inducing differentiation of these cells down the osteogenic, adipogenic, and chondrogenic lineages. This, in turn, implies the multipotency of the isolated cells. Furthermore, we induced the differentiation of the isolated Ad-MSCs toward the insulin-producing cells (IPCs) lineage via a simple, relatively short protocol by incorporating high glucose Dulbecco&#39;s modified Eagle medium (HG-DMEM), &#946;-mercaptoethanol, nicotinamide, and exendin-4. IPCs differentiation was genetically assessed, firstly, via measuring the expression levels of specific &#946;-cell markers such as MafA, NKX6.1, Pdx-1, and Ins1, as well as dithizone staining for the generated IPCs. Secondly, the assessment was also carried out functionally by a glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assay. In conclusion, Ad-MSCs can be easily isolated, exhibiting all MSC characterization criteria, and they can indeed provide an abundant, renewable source of IPCs in the lab for diabetes research.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) can be a potential source of MSCs that differentiate into insulin-producing cells (IPCs). In this protocol, we provide detailed steps for the isolation and characterization of rat epididymal Ad-MSCs, followed by a simple, short protocol for the generation of IPCs from the same rat Ad-MSCs.

בידוד של תאי גזע מזנכימליים של רקמת שומן חולדה לצורך התמיינות לתאים המייצרים אינסולין

Mesenchymal stem cells (MSCs)-especially those isolated from adipose tissue (Ad-MSCs)-have gained special attention as a renewable, abundant source of ...

העברת גנים לתוך האיברים השמיעתיים עוף ידי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

העברה יעילה ג'ין בצ'יק הרשתיות לסלולריים יסודי לימודי תרבות:

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג'ין העברה על ידי Electroporation