Name: determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi at JoVE.com

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV سلالات والمناولة ملاحظة: المؤتلف غير نشر HSV-1 (كوس) gL86 وHSV-2 (كوس) 333gJ - مع النشاط مراسل بيتا غالاكتوزيداز المستخدمة قدمتها خامسا Twiari 36،37. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفيروس من الكثير واحد ومخزن في -80 درجة مئوية في نسبة 1: 1 متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) والحليب الخالي من الدسم حتى الاستخدام. قبل الكثير تخزين الفيروسي، وتحديد تركيز الفيروس عن طريق س -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) و 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الجدوى فيروس وافر من العدوى (وزارة الداخلية) التي كتبها X-غال تلطيخ لتشغيل كل فحص تجريبي باستخدام فيروس مراسل فحص دخول، كما هو موضح سابقا (الشكل 1) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع فيروس (التقيد MEM) الى وزارة الداخلية المطلوبة. إصلاح الطبقات الوحيدة (لامتصاص العرق؛ 0.5 مل / جيد) قبل تلطيخ. وضع ضوابط بقاء الفيروس في العكبرية منفصلةلوحة ثالثا بالتوازي مع لوحات فحص متعدد المكروبات. </li></ol> 2. هيلا 299 التعامل مع خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في DMEM مع 4.5 جم / لتر جلوكوز، 10٪ للحرارة المعطل الجنين المصل البقري (FBS)، جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) ولام الجلوتامين. خلايا مرور في 80٪ التقاء مع الحل التربسين (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل، 0.53 M EDTA، 0.05٪ التربسين، 5 مل / قارورة). </li></ol> 3. C. البيض المناولة ملاحظة: C. البيض الحصول عليها من مصدر المختبرات الطبية وتخزينها في -80 درجة مئوية في Remmel الحليب الخالي من الدسم 2X المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة تجميد الأسهم على سابورو سكر العنب المتوسطة (37 درجة مئوية). بعد 24 ساعة ثقافة فرعية في C. البيض على Fungisel المتوسطة (37 درجة مئوية و 48 ساعة) للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد أنبوب الجرثومية (GT) أشكال (اختيار المستعمرات التمثيلية؛ 3 مل FBS، 3 ساعة و 37 درجة مئوية، عبس 600، 0.3). بعد مرور فترة الحضانة، وغسل GT (HBSS، 2X، 4000 x ج). إضافة GT غسلها لHBSS حرارة (37 &amp;# 176؛ ج. 0.32 عبس 600). وينبغي أن تكون أشكال GT 99٪ من الخلايا لوحظ على النحو الذي يحدده عدد عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المعلقات شكل الخميرة الأسهم (YF) عن طريق التقاط المستعمرات Fungisel التمثيلية (HBSS، 3 مل، 0.32 عبس 600). عد عدد من الأشكال YF / مل مجهريا باستخدام عدادة الكريات. وينبغي أن تكون أشكال YF 99٪ من الخلايا لوحظ على النحو الذي يحدده عدد عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العمل الأسهم الفطرية (250 ميكرولتر من GT أو الأسهم YF في 25 مل HBSS و 37 درجة مئوية و 10 5 خلية / مل) </li></ol> 4. س. الذهبية المناولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر س. الذهبية آي تي سي سي 25923 (-80 درجة مئوية؛ Remmel الخالي من الدسم 2X الحليب). ثقافة على أجار الدم الأغنام (5٪ و 37 درجة مئوية، و 24 ساعة). اختيار المستعمرات التمثيلية ونقل إلى مانيتول أملاح المتوسطة على بعد 2 أيام للسهم (37 درجة مئوية و 18 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل S. تعليق الذهبية الأسهم (3 مل HBSS، 1.32 عبس 600، 10 8 كفو / مل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العمل س. الأسهم الذهبية (100 ميكرولترمن الأسهم في 25 مل HBSS. 10 5 خلية / مل). </li></ol></li></ol> 5. المبيضات وس. الذهبية المعلقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مختلطة C. البيض وس. الذهبية تعليق (250 YF ميكرولتر أو الأسهم GT و 100 ميكرولتر الأسهم بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية في 25 مل HBSS). </li></ol> 6. متعدد المكروبات بيوفيلم الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور 96 لوحات جيدا مع 200 ميكرولتر من 2 × 10 5 هيلا خلية / مل (85٪ مستوى التقاء). لوحات روك (30 - 45 دقيقة و 37 درجة مئوية) قبل الحضانة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة و 18 ساعة). غسل الطبقات الوحيدة (1X، التقيد MEM) ثم البذور مع هامبورغ (HSV-1 (كوس) gL86 أو HSV-2 (كوس) 33 جيجا جول - في 100 ميكرولتر التقيد MEM، وزارة الداخلية 50 و 10). احتضان لوحات (3 ساعات و 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). استخدام سلالة فيروسية واحدة فقط في اليوم الواحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبقات الوحيدة المصابة (1X، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع المغنيسيوم والكالسيوم +2 +2؛ 100 ميكرولتر). استبدال برنامج تلفزيوني مع HBSS الدافئ ترك 25 &amp; #181؛ ل في كل بئر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة YF، GT و / أو س. الذهبية تعليق العمل (100 ميكرولتر، هدف إلى نسبة الخلايا = 5: 1، ن = 16). كما هو مبين في الجدول رقم 1 احتضان لوحات (ثابتة و 30 دقيقة و 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ونضح عمود واحد في وقت اعادة ملء فورا مع 300 ميكرولتر PBS مع المغنيسيوم والكالسيوم +2 +2. كرر هذه الخطوة مرتين ثم إضافة الراديو مناعي عازلة فحص تحلل (المعهد الملكي؛ مرشح وتعقيمها، 200 ميكرولتر من تخفيف 01:50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن بسرعة الخلية المحللة هيلا ثم ضع 50 ميكرولتر على أملاح مانيتول (MS) و / أو وسائل الإعلام Fungisel (F) (الشكل 2). نشر المحللة باستخدام عازمة الزجاج قضيب بزاوية 90 درجة. احتضان لوحات (18 ساعة على 37 درجة مئوية). حساب عدد من المستعمرات في لوحة يدويا. تتكون ضوابط S. الذهبية و / أو جيم البيض الالتزام خلايا هيلا غير مصاب HSV. </li></ol> 7. دراسات التصوير &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة الزجاج الجولة (12 مم، و 50 مل الأسيتون في 100 مل دورق). coverslips الجافة وتعقيم (Kimwipes، أطباق بتري زجاجي). ضع coverslips معقمة جافة في آبار العقيمة 24 لوحات جيدة مع الكحول لهب ملقط معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خلايا هيلا (1 مل، حجم 5X تستخدم لمدة 96 لوحات جيدة) إلى الآبار من 24 لوحات جيدة تحتوي على العقيمة coverslips الزجاج الجولة غسلها. إضافة الفيروسات والبكتيريا والفطريات وفقا للنموذج (الجدول 2) في 5X الحجم المستخدم ل96 لوحات جيدا، ثم احتضان وعملية كما هو موضح في الخطوات 6.2.1 إلى 6.4 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، وتحديد الخلايا للفحص المجهري عن طريق إغراق الشريحة مع الميثانول والسماح له لتتبخر. تخزين لوحات في RT حتى تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفحص المجهري مشرق الميدان (1،000x التكبير الأصلي النهائي) ملء الآبار التي تحتوي على coverslips ثابت الميثانول مع الماء منزوع الأيونات. نضح الماء على الفور. تغطية كل ساترة مع غرام البنفسجي الكريستال. غسل coverslips خالية من البقع غير المربوطة (الماء منزوع الأيونات). coverslips الجافة في الموقع ثم الالتزام بها مع مجموعة من الصعب متوسطة إلى شريحة وصفت تركيب (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفحص المجهري الفلورسنت (الهدف 100X، 1،000x الأصلي التكبير النهائي) غسل coverslips خالية من الميثانول أساسا كما هو موضح في الخطوة 7.4. تجفيف coverslips في الآبار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف، وإزالة زلات الغطاء ووضعها على الشرائح المسمى. ثم إضافة كمية كافية من 1:20 التخفيف من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -conjugated العقبول البسيط نوع الفيروس 1 + 2 GD الأجسام المضادة لتغطية ساترة (1-5 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل لل coverslips في 4 تغييرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، والعودة ساترة إلى الشريحة المسمى. وصمة عار مع 4 &quot;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، غرفة رطوبة و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). بعد مرور فترة الحضانة غسل لل coverslips في 4 تشانغيس من برنامج تلفزيوني، ثم يضعوا على الشريحة المسمى مع مجموعة من الصعب المتوسطة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للمتوسطة متزايدة لعلاج لمدة 24 ساعة على RT في الظلام. دراسة لل coverslips تحت هدف النفط على أي المجهر مشرق الميدان أو المجهر الفلورسنت مع مرشحات قطع FITC ودابي. دراسة الصور لا يقل عن 50 حقول (100 خلية في الحد الأدنى الحي) للمشاركة في التعريب (الشكل 4). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

حاليا يتوفر على التفاعلات المعقدة بين الأعضاء الدائمين وشبه دائم في microbiome المضيفة التي تعبر متعددة المجالات التصنيفية، أي بدائيات النوى، حقيقيات النوى والفيروسية أية معلومات. لذلك وضعنا رواية في نظام نموذجي المختبر لدراسة بدء بيوفيلم من قبل س...

<html> يتضمن microbiome الإنسان الكائنات الحية المتنوعة من الممالك التصنيفية المتعددة التي تتقاسم مناطق جغرافية في الجسم. التمسك سطوح الخلايا هو خطوة أولى أساسية في تشكيل بيوفيلم، الذي هو جزء من عملية microbiome الاستعمار. وشملت في microbiome يمكن أن تكون الفيروسات التي تسبب الالتهابات المزمنة والمستمرة. عدوى الخلايا المزمن من قبل هذه الفيروسات يمكن أن تسبب تغيير في توفر مستقبلات المفترض 1،2 بالإضافة إلى ذلك، دخول الخلية عن طريق الجراثيم داخل الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على غشاء المضيف سيولة / للا مائية والتي بدورها قد يغير الحجز على أعضاء microbiome الآخرين، بما في ذلك البكتيريا والفطريات . من أجل فهم التفاعلات التي تحدث بين هذه الجراثيم المتعددة التي شاركت في توطين في مناطق جغرافية واحدة للمضيف البشري، يجب أن نكون قادرين على دراسة التفاعل من مسببات الأمراض التي تمثل طائفة من الممالك التصنيفية الحاضرة في سطح الغشاء المخاطي. ر &quot;&gt; إن فيروسات هربسية هي عائلة من الميكروبات الموجودة في 100٪ من البشر كأعضاء دائمين في microbiome 3،4. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أيضا أن تسلط باستمرار سواء في وجود وعدم وجود أعراض وعلى وجه التحديد، فيروس العقبول البسيط-1 وفيروس العقبول البسيط 2 (HSV-1 و HSV-2، على التوالي) أعضاء الدائمين في microbiome في oronasopharynx والجهاز التناسلي. في الأفراد المناعة المختصة، سواء HSV-1 و HSV-2 سبب التهاب اللثة، وكذلك الهربس التناسلي 5-8. في هذه المواقع، HSV يسبب العدوى الكامنة التي تتميز المزمن المستمر بدون أعراض الفيروسية تسليط 9. دخول HSV إلى نتائج الخلايا في إحداث تغييرات في التعبير سطح nectins، كبريتات heparan، الطوافات الدهنية وهربس دخول الوسيط نخر الورم / مستقبلات عامل (HVEM / TNFr) 10-25. هذه المستقبلات يحتمل أن تمثل المشتركة لبعض البكتيريا والفطريات، مثل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وجيم البيض، في حين أن الذي مسببات الأمراض الانتهازية،ويمكن أيضا أن يقيم كأعضاء في microbiome المخاطية للoronasopharynx 26،27. ضمن oronasopharynx س. الذهبية وجيم البيض تحتل موقعين متميزين من الاستعمار. في المضيفين مع الأسنان الطبيعية، ويشارك في الغشاء المخاطي للفم من قبل HSV-1 و C. البيض، في حين احتلت فتحتي الأنف الأنف الأمامية التي كتبها س. الذهبية 28. ومع ذلك، على الرغم من في المختبر النتائج أن S. الذهبية تلتزم الخلايا الظهارية الفم، 29،30 س. يتم عزل الذهبية نادرا من العينات عن طريق الفم عندما الأنسجة الطبيعية موجودة 29،30. ولا يعرف سوى القليل بشأن منافذ الجهاز المشارك الاستعمار التناسلية وراء النتائج السريرية التي S. ويرتبط الذهبية مع التهاب المهبل الهوائية، ويتميز بالتهاب الأعضاء التناسلية والتفريغ وعسر الجماع، بينما C. البيض تنتج الآفات المخاطية مماثلة لتلك التي لوحظت في تجويف الفم 31-35. وهكذا، على الرغم من أن هؤلاء الأعضاء من microbi عن طريق الفم والأعضاء التناسليةلى بعد الممالك التصنيفية عبر يعرف المتعلقة تفاعلها قليلا لأنه يؤثر قدرتها على الشروع في تشكيل بيوفيلم من خلال الانضمام إلى سطح الخلية المضيفة 5. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول على نحو فعال لتحديد عواقب وظيفية المشترك الاستعمار / العدوى.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

دراسة التفاعلات متعدد المكروبات في جميع أنحاء الممالك التصنيفية التي تشمل البكتيريا والفطريات والفيروسات لم تفحص سابقا في ما يتعلق بكيفية أعضاء الفيروسي من microbiome يؤثر على التفاعلات ميكروب لاحقة مع الخلايا المضيفة المصابة بالفيروسات هذه. والعيش المشترك بين الفيروس مع البكتيريا والفطريات موجودة أساسا على الأسطح المخاطية لتجويف الفم والجهاز التناسلي. خلايا الغشاء المخاطي، ولا سيما مع العدوى الفيروسية الكامنة المزمنة أو الدائمة المستمرة، يمكن أن يكون له تأثير كبير على أعضاء microbiome من خلال تغيير الفيروس في عدد ونوع من المستقبلات التي أعرب عنها. أن التعديل في العمارة غشاء الخلية المضيفة يؤدي إلى القدرة غيرت من أعضاء لاحق من النباتات الطبيعية ومسببات الأمراض الانتهازية لبدء الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم، أي التزام. توضح هذه الدراسة وسيلة لتحديد الكميات والفحص البصري للتأثير HSV على بدء biofilتشكيل م (الالتزام) س الذهبية وجيم البيض.

يظهر مستوى متانة البيانات التي يمكن الحصول عليها من النظام المذكور في هذا التقرير في الشكل 2 AF 38. من خلال استخدام هذا النظام لتعديل من التفاعل المكورات العنقودية والفطرية مع الخلايا المصابة فيروسي وتأثيرها على التزام كل منهما ويمكن ت...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi at JoVE.com

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Views.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Video: Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Biology

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

منهجيات لدراسة<em&gt; B. الرقيقة</em&gt; الأغشية الحيوية نموذجا للتميز الصغيرة جزيء بيوفيلم المانعون

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Bioengineering

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>قياس الهجرة وتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المختلفة

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

قياس الهجرة وتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المختلفة

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

Source: Kuchar&#237;kov&#225;, S., et al.&#160; <a href="https://app.jove.com/v/52239">Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal&#39;s back region for biofilm development.

المبيضات البيضاء تكوين الأغشية الحيوية في نموذج فأر In Vivo

1. C. albicans Growth

	Twenty-four hours before the initiation of the animal experiment, prepare yeast extract peptone dextrose, YPD plates by adding 10 ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://app.jove.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

طريقة لتحضير العينة لتصور البكتيريا المكونة للأغشية الحيوية على الخيوط الفطرية

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

منهجيات لدراسة

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

قياس الهجرة وتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المختلفة

قياس الهجرة وتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المختلفة

المبيضات البيضاء تكوين الأغشية الحيوية في نموذج فأر In Vivo

طريقة لتحضير العينة لتصور البكتيريا المكونة للأغشية الحيوية على الخيوط الفطرية

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

مقايسة للالتصاق وغزو آجار في البيرة س.

غزو ​​الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي

منهجيات لدراسة

طريقة جديدة لتحليل نوعي متعدد حجم البكتيرية الأغشية الحيوية على شعيري الفطرية المستعمرات عن طريق متحد البؤر والمجهر الإلكتروني

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

قياس الهجرة وتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المختلفة

قياس الهجرة وتكوين الأغشية الحيوية للبكتيريا المختلفة

المبيضات البيضاء تكوين الأغشية الحيوية في نموذج فأر In Vivo

طريقة لتحضير العينة لتصور البكتيريا المكونة للأغشية الحيوية على الخيوط الفطرية

غزو الخلايا البشرية من قبل الممرض الجرثومي