This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV سلالات والمناولة ملاحظة: المؤتلف غير نشر HSV-1 (كوس) gL86 وHSV-2 (كوس) 333gJ - مع النشاط مراسل بيتا غالاكتوزيداز المستخدمة قدمتها خامسا Twiari 36،37. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الفيروس من الكثير واحد ومخزن في -80 درجة مئوية في نسبة 1: 1 متوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) والحليب الخالي من الدسم حتى الاستخدام. قبل الكثير تخزين الفيروسي، وتحديد تركيز الفيروس عن طريق س -nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) و 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-غال) فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الجدوى فيروس وافر من العدوى (وزارة الداخلية) التي كتبها X-غال تلطيخ لتشغيل كل فحص تجريبي باستخدام فيروس مراسل فحص دخول، كما هو موضح سابقا (الشكل 1) 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع فيروس (التقيد MEM) الى وزارة الداخلية المطلوبة. إصلاح الطبقات الوحيدة (لامتصاص العرق؛ 0.5 مل / جيد) قبل تلطيخ. وضع ضوابط بقاء الفيروس في العكبرية منفصلةلوحة ثالثا بالتوازي مع لوحات فحص متعدد المكروبات. </li></ol> 2. هيلا 299 التعامل مع خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ينمو بمعدل 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في DMEM مع 4.5 جم / لتر جلوكوز، 10٪ للحرارة المعطل الجنين المصل البقري (FBS)، جنتاميسين (50 ميكروغرام / مل) ولام الجلوتامين. خلايا مرور في 80٪ التقاء مع الحل التربسين (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل، 0.53 M EDTA، 0.05٪ التربسين، 5 مل / قارورة). </li></ol> 3. C. البيض المناولة ملاحظة: C. البيض الحصول عليها من مصدر المختبرات الطبية وتخزينها في -80 درجة مئوية في Remmel الحليب الخالي من الدسم 2X المتوسطة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة تجميد الأسهم على سابورو سكر العنب المتوسطة (37 درجة مئوية). بعد 24 ساعة ثقافة فرعية في C. البيض على Fungisel المتوسطة (37 درجة مئوية و 48 ساعة) للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد أنبوب الجرثومية (GT) أشكال (اختيار المستعمرات التمثيلية؛ 3 مل FBS، 3 ساعة و 37 درجة مئوية، عبس 600، 0.3). بعد مرور فترة الحضانة، وغسل GT (HBSS، 2X، 4000 x ج). إضافة GT غسلها لHBSS حرارة (37 &amp;# 176؛ ج. 0.32 عبس 600). وينبغي أن تكون أشكال GT 99٪ من الخلايا لوحظ على النحو الذي يحدده عدد عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل المعلقات شكل الخميرة الأسهم (YF) عن طريق التقاط المستعمرات Fungisel التمثيلية (HBSS، 3 مل، 0.32 عبس 600). عد عدد من الأشكال YF / مل مجهريا باستخدام عدادة الكريات. وينبغي أن تكون أشكال YF 99٪ من الخلايا لوحظ على النحو الذي يحدده عدد عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العمل الأسهم الفطرية (250 ميكرولتر من GT أو الأسهم YF في 25 مل HBSS و 37 درجة مئوية و 10 5 خلية / مل) </li></ol> 4. س. الذهبية المناولة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر س. الذهبية آي تي سي سي 25923 (-80 درجة مئوية؛ Remmel الخالي من الدسم 2X الحليب). ثقافة على أجار الدم الأغنام (5٪ و 37 درجة مئوية، و 24 ساعة). اختيار المستعمرات التمثيلية ونقل إلى مانيتول أملاح المتوسطة على بعد 2 أيام للسهم (37 درجة مئوية و 18 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل S. تعليق الذهبية الأسهم (3 مل HBSS، 1.32 عبس 600، 10 8 كفو / مل) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل العمل س. الأسهم الذهبية (100 ميكرولترمن الأسهم في 25 مل HBSS. 10 5 خلية / مل). </li></ol></li></ol> 5. المبيضات وس. الذهبية المعلقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل مختلطة C. البيض وس. الذهبية تعليق (250 YF ميكرولتر أو الأسهم GT و 100 ميكرولتر الأسهم بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية في 25 مل HBSS). </li></ol> 6. متعدد المكروبات بيوفيلم الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بذور 96 لوحات جيدا مع 200 ميكرولتر من 2 × 10 5 هيلا خلية / مل (85٪ مستوى التقاء). لوحات روك (30 - 45 دقيقة و 37 درجة مئوية) قبل الحضانة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 حاضنة و 18 ساعة). غسل الطبقات الوحيدة (1X، التقيد MEM) ثم البذور مع هامبورغ (HSV-1 (كوس) gL86 أو HSV-2 (كوس) 33 جيجا جول - في 100 ميكرولتر التقيد MEM، وزارة الداخلية 50 و 10). احتضان لوحات (3 ساعات و 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). استخدام سلالة فيروسية واحدة فقط في اليوم الواحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الطبقات الوحيدة المصابة (1X، الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع المغنيسيوم والكالسيوم +2 +2؛ 100 ميكرولتر). استبدال برنامج تلفزيوني مع HBSS الدافئ ترك 25 &amp; #181؛ ل في كل بئر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة YF، GT و / أو س. الذهبية تعليق العمل (100 ميكرولتر، هدف إلى نسبة الخلايا = 5: 1، ن = 16). كما هو مبين في الجدول رقم 1 احتضان لوحات (ثابتة و 30 دقيقة و 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، ونضح عمود واحد في وقت اعادة ملء فورا مع 300 ميكرولتر PBS مع المغنيسيوم والكالسيوم +2 +2. كرر هذه الخطوة مرتين ثم إضافة الراديو مناعي عازلة فحص تحلل (المعهد الملكي؛ مرشح وتعقيمها، 200 ميكرولتر من تخفيف 01:50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يسحن بسرعة الخلية المحللة هيلا ثم ضع 50 ميكرولتر على أملاح مانيتول (MS) و / أو وسائل الإعلام Fungisel (F) (الشكل 2). نشر المحللة باستخدام عازمة الزجاج قضيب بزاوية 90 درجة. احتضان لوحات (18 ساعة على 37 درجة مئوية). حساب عدد من المستعمرات في لوحة يدويا. تتكون ضوابط S. الذهبية و / أو جيم البيض الالتزام خلايا هيلا غير مصاب HSV. </li></ol> 7. دراسات التصوير &lt;/ P&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل ساترة الزجاج الجولة (12 مم، و 50 مل الأسيتون في 100 مل دورق). coverslips الجافة وتعقيم (Kimwipes، أطباق بتري زجاجي). ضع coverslips معقمة جافة في آبار العقيمة 24 لوحات جيدة مع الكحول لهب ملقط معقم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة خلايا هيلا (1 مل، حجم 5X تستخدم لمدة 96 لوحات جيدة) إلى الآبار من 24 لوحات جيدة تحتوي على العقيمة coverslips الزجاج الجولة غسلها. إضافة الفيروسات والبكتيريا والفطريات وفقا للنموذج (الجدول 2) في 5X الحجم المستخدم ل96 لوحات جيدا، ثم احتضان وعملية كما هو موضح في الخطوات 6.2.1 إلى 6.4 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، وتحديد الخلايا للفحص المجهري عن طريق إغراق الشريحة مع الميثانول والسماح له لتتبخر. تخزين لوحات في RT حتى تلطيخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفحص المجهري مشرق الميدان (1،000x التكبير الأصلي النهائي) ملء الآبار التي تحتوي على coverslips ثابت الميثانول مع الماء منزوع الأيونات. نضح الماء على الفور. تغطية كل ساترة مع غرام البنفسجي الكريستال. غسل coverslips خالية من البقع غير المربوطة (الماء منزوع الأيونات). coverslips الجافة في الموقع ثم الالتزام بها مع مجموعة من الصعب متوسطة إلى شريحة وصفت تركيب (الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للفحص المجهري الفلورسنت (الهدف 100X، 1،000x الأصلي التكبير النهائي) غسل coverslips خالية من الميثانول أساسا كما هو موضح في الخطوة 7.4. تجفيف coverslips في الآبار. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجفيف، وإزالة زلات الغطاء ووضعها على الشرائح المسمى. ثم إضافة كمية كافية من 1:20 التخفيف من ثيوسيانات فلوريسئين (FITC) -conjugated العقبول البسيط نوع الفيروس 1 + 2 GD الأجسام المضادة لتغطية ساترة (1-5 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الشرائح في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل لل coverslips في 4 تغييرات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد غسل النهائي، والعودة ساترة إلى الشريحة المسمى. وصمة عار مع 4 &quot;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، غرفة رطوبة و 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة). بعد مرور فترة الحضانة غسل لل coverslips في 4 تشانغيس من برنامج تلفزيوني، ثم يضعوا على الشريحة المسمى مع مجموعة من الصعب المتوسطة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للمتوسطة متزايدة لعلاج لمدة 24 ساعة على RT في الظلام. دراسة لل coverslips تحت هدف النفط على أي المجهر مشرق الميدان أو المجهر الفلورسنت مع مرشحات قطع FITC ودابي. دراسة الصور لا يقل عن 50 حقول (100 خلية في الحد الأدنى الحي) للمشاركة في التعريب (الشكل 4). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

حاليا يتوفر على التفاعلات المعقدة بين الأعضاء الدائمين وشبه دائم في microbiome المضيفة التي تعبر متعددة المجالات التصنيفية، أي بدائيات النوى، حقيقيات النوى والفيروسية أية معلومات. لذلك وضعنا رواية في نظام نموذجي المختبر لدراسة بدء بيوفيلم من قبل س...

<html> يتضمن microbiome الإنسان الكائنات الحية المتنوعة من الممالك التصنيفية المتعددة التي تتقاسم مناطق جغرافية في الجسم. التمسك سطوح الخلايا هو خطوة أولى أساسية في تشكيل بيوفيلم، الذي هو جزء من عملية microbiome الاستعمار. وشملت في microbiome يمكن أن تكون الفيروسات التي تسبب الالتهابات المزمنة والمستمرة. عدوى الخلايا المزمن من قبل هذه الفيروسات يمكن أن تسبب تغيير في توفر مستقبلات المفترض 1،2 بالإضافة إلى ذلك، دخول الخلية عن طريق الجراثيم داخل الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على غشاء المضيف سيولة / للا مائية والتي بدورها قد يغير الحجز على أعضاء microbiome الآخرين، بما في ذلك البكتيريا والفطريات . من أجل فهم التفاعلات التي تحدث بين هذه الجراثيم المتعددة التي شاركت في توطين في مناطق جغرافية واحدة للمضيف البشري، يجب أن نكون قادرين على دراسة التفاعل من مسببات الأمراض التي تمثل طائفة من الممالك التصنيفية الحاضرة في سطح الغشاء المخاطي. ر &quot;&gt; إن فيروسات هربسية هي عائلة من الميكروبات الموجودة في 100٪ من البشر كأعضاء دائمين في microbiome 3،4. وبالإضافة إلى ذلك يمكن أيضا أن تسلط باستمرار سواء في وجود وعدم وجود أعراض وعلى وجه التحديد، فيروس العقبول البسيط-1 وفيروس العقبول البسيط 2 (HSV-1 و HSV-2، على التوالي) أعضاء الدائمين في microbiome في oronasopharynx والجهاز التناسلي. في الأفراد المناعة المختصة، سواء HSV-1 و HSV-2 سبب التهاب اللثة، وكذلك الهربس التناسلي 5-8. في هذه المواقع، HSV يسبب العدوى الكامنة التي تتميز المزمن المستمر بدون أعراض الفيروسية تسليط 9. دخول HSV إلى نتائج الخلايا في إحداث تغييرات في التعبير سطح nectins، كبريتات heparan، الطوافات الدهنية وهربس دخول الوسيط نخر الورم / مستقبلات عامل (HVEM / TNFr) 10-25. هذه المستقبلات يحتمل أن تمثل المشتركة لبعض البكتيريا والفطريات، مثل بكتريا المكورة العنقودية البرتقالية وجيم البيض، في حين أن الذي مسببات الأمراض الانتهازية،ويمكن أيضا أن يقيم كأعضاء في microbiome المخاطية للoronasopharynx 26،27. ضمن oronasopharynx س. الذهبية وجيم البيض تحتل موقعين متميزين من الاستعمار. في المضيفين مع الأسنان الطبيعية، ويشارك في الغشاء المخاطي للفم من قبل HSV-1 و C. البيض، في حين احتلت فتحتي الأنف الأنف الأمامية التي كتبها س. الذهبية 28. ومع ذلك، على الرغم من في المختبر النتائج أن S. الذهبية تلتزم الخلايا الظهارية الفم، 29،30 س. يتم عزل الذهبية نادرا من العينات عن طريق الفم عندما الأنسجة الطبيعية موجودة 29،30. ولا يعرف سوى القليل بشأن منافذ الجهاز المشارك الاستعمار التناسلية وراء النتائج السريرية التي S. ويرتبط الذهبية مع التهاب المهبل الهوائية، ويتميز بالتهاب الأعضاء التناسلية والتفريغ وعسر الجماع، بينما C. البيض تنتج الآفات المخاطية مماثلة لتلك التي لوحظت في تجويف الفم 31-35. وهكذا، على الرغم من أن هؤلاء الأعضاء من microbi عن طريق الفم والأعضاء التناسليةلى بعد الممالك التصنيفية عبر يعرف المتعلقة تفاعلها قليلا لأنه يؤثر قدرتها على الشروع في تشكيل بيوفيلم من خلال الانضمام إلى سطح الخلية المضيفة 5. وقد تم تطبيق هذا البروتوكول على نحو فعال لتحديد عواقب وظيفية المشترك الاستعمار / العدوى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1185">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">C.albicans</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">BBL Sabouraud Dextrose</td>
			<td style="width:195px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">211584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Fungisel Agar</td>
			<td style="width:195px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">7205A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">S.aureus</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:481px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Mannitol Salt Agar</td>
			<td style="width:195px;">Troy Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">7143B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Sheep blood agar</td>
			<td style="width:195px;">Troy Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">221239</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Hela cells</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:391px;">1xDMEM (Dubelcco&#39;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gentamicin 50mg/ml</td>
			<td style="width:195px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1397</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration in the complete DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:391px;">Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:195px;">Atlanta Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">S11150</td>
			<td>10% final concentration in the complete DMEM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Other medium and reagents</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">ONPG</td>
			<td style="width:195px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">34055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Ultra-Pure X gal</td>
			<td style="width:195px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15520-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">1x HBSS (Hanks&#39; Balanced Salt Solution)</td>
			<td style="width:195px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">20-021-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">1XPBS</td>
			<td style="width:195px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">30042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">RIPA Lysis</td>
			<td style="width:195px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">89901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Staining</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Methanol</td>
			<td style="width:195px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A433P-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">HSV 1&#38;2, specific for gD</td>
			<td style="width:195px;">ViroStat</td>
			<td style="width:119px;">196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">DAPI</td>
			<td style="width:195px;">SIGMA</td>
			<td style="width:119px;">D8417-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Gram Crystal Violet</td>
			<td style="width:195px;">Troy Biologicals</td>
			<td style="width:119px;">212527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Supplies</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:391px;">Petri dish 100X15</td>
			<td style="width:195px;">Dot Scientific</td>
			<td style="width:119px;">229693&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="29">
			<td height="29" style="height:29px;width:391px;">Petri dish 150X15</td>
			<td style="width:195px;">Kord Valmark</td>
			<td style="width:119px;">2902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:391px;">96-Well plates</td>
			<td style="width:195px;">Evergreen Scientific</td>
			<td style="width:119px;">222-8030-01F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:391px;">24-well plates</td>
			<td style="width:195px;">Evergreen Scientific</td>
			<td style="width:119px;">222-8044-01F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Culture tubes 100x13</td>
			<td style="width:195px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:119px;">9187L61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:391px;">Cover slip circles, 12mm</td>
			<td style="width:195px;">Deckglaser</td>
			<td style="width:119px;">CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

دراسة التفاعلات متعدد المكروبات في جميع أنحاء الممالك التصنيفية التي تشمل البكتيريا والفطريات والفيروسات لم تفحص سابقا في ما يتعلق بكيفية أعضاء الفيروسي من microbiome يؤثر على التفاعلات ميكروب لاحقة مع الخلايا المضيفة المصابة بالفيروسات هذه. والعيش المشترك بين الفيروس مع البكتيريا والفطريات موجودة أساسا على الأسطح المخاطية لتجويف الفم والجهاز التناسلي. خلايا الغشاء المخاطي، ولا سيما مع العدوى الفيروسية الكامنة المزمنة أو الدائمة المستمرة، يمكن أن يكون له تأثير كبير على أعضاء microbiome من خلال تغيير الفيروس في عدد ونوع من المستقبلات التي أعرب عنها. أن التعديل في العمارة غشاء الخلية المضيفة يؤدي إلى القدرة غيرت من أعضاء لاحق من النباتات الطبيعية ومسببات الأمراض الانتهازية لبدء الخطوة الأولى في تشكيل بيوفيلم، أي التزام. توضح هذه الدراسة وسيلة لتحديد الكميات والفحص البصري للتأثير HSV على بدء biofilتشكيل م (الالتزام) س الذهبية وجيم البيض.

يظهر مستوى متانة البيانات التي يمكن الحصول عليها من النظام المذكور في هذا التقرير في الشكل 2 AF 38. من خلال استخدام هذا النظام لتعديل من التفاعل المكورات العنقودية والفطرية مع الخلايا المصابة فيروسي وتأثيرها على التزام كل منهما ويمكن ت...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi at JoVE.com

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

تحديد بيوفيلم بدء في الخلايا المصابة بالفيروسات من قبل البكتيريا والفطريات

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Views.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Video: Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

والزائفة الزنجارية السكيراء بيوفيلم في خلايا خميرة تدفق

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

Microtiter تشكيل بيوفيلم الطبق الفحص

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

بعد الخلوي في مصير<em&gt; E. القولونية</em&gt; بعد الإصابة التي كتبها لامدا بالعاثية

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Purification and Visualization of Lipopolysaccharide from Gram-negative Bacteria by Hot Aqueous-phenol Extraction

Lipopolysaccharide (LPS) is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of lipid A, which is embedded in the outer membrane, a core oligosaccharide and repeating O-antigen units that extend outward from the surface of the cell1, 2. LPS is an immunodominant molecule that is important for the virulence and pathogenesis of many bacterial species, including Pseudomonas aeruginosa, Salmonella species, and Escherichia coli3-5, and differences in LPS O-antigen composition form the basis for serotyping of strains. LPS is involved in attachment to host cells at the initiation of infection and provides protection from complement-mediated killing; strains that lack LPS can be attenuated for virulence6-8. For these reasons, it is important to visualize LPS, particularly from clinical isolates. Visualizing LPS banding patterns and recognition by specific antibodies can be useful tools to identify strain lineages and to characterize various mutants. 
In this report, we describe a hot aqueous-phenol method for the isolation and purification of LPS from Gram-negative bacterial cells. This protocol allows for the extraction of LPS away from nucleic acids and proteins that can interfere with visualization of LPS that occurs with shorter, less intensive extraction methods9. LPS prepared this way can be separated by sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and directly stained using carbohydrate/glycoprotein stains or standard silver staining methods. Many anti-sera to LPS contain antibodies that cross-react with outer membrane proteins or other antigenic targets that can hinder reactivity observed following Western immunoblot of SDS-PAGE-separated crude cell lysates. Protease treatment of crude cell lysates alone is not always an effective way of removing this background using this or other visualization methods. Further, extensive protease treatment in an attempt to remove this background can lead to poor quality LPS that is not well resolved by any of the aforementioned methods. For these reasons, we believe that the following protocol, adapted from Westpahl and Jann10, is ideal for LPS extraction.

We describe a modified hot aqueous-phenol extraction method for purifying lipopolysaccharide (LPS) from Gram-negative bacteria. Once extracted, the LPS can be subsequently analyzed by SDS-PAGE and visualized by direct staining or Western immunoblot.

تنقية والتصور من Lipopolysaccharide من البكتريا سالبة الجرام بواسطة استخراج مائي، الفينول الساخن

Lipopolysaccharide (LPS)  is a major component of Gram-negative bacterial outer membranes. It is a tripartite molecule consisting of  lipid A, which is ...

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

استخدام الخلوي على الصورة لعرض الكمي من الفطريات الممرضة في جمعية مع الخلايا المضيفة

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Application of Fluorescent Nanoparticles to Study Remodeling of the Endo-lysosomal System by Intracellular Bacteria

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we introduce a method using gold-BSA-rhodamine NPs to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells and monitor manipulations of host cellular pathways by the intracellular pathogen Salmonella enterica. The NPs were readily internalized by HeLa cells and localized in late endosomes/lysosomes. Salmonella infection induced rearrangement of the vesicles and accumulation of NPs in Salmonella-induced membrane structures. We deployed the Imaris software package for quantitative analyses of confocal microscopy images. The number of objects and their size distribution in non-infected cells were distinct from the ones in Salmonella-infected cells, indicating extremely remodeling of the endo-lysosomal system by WT Salmonella.

This article describes methods for the synthesis and fluorescent labeling of nanoparticles (NPs). The NPs were applied in pulse-chase experiments to label the endo-lysosomal system of eukaryotic cells. Manipulation of the endo-lysosomal system by activities of the intracellular pathogen Salmonella enterica were followed by live cell imaging and quantified.

تطبيق نيون النانوية لدراسة إعادة عرض لنظام إندو-الليزوزومية من البكتيريا داخل الخلايا

Fluorescent nanoparticles (NPs) with desirable chemical, optical and mechanical properties are promising tools to label intracellular organelles. Here, we ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

T خلايا التقاط البكتيريا التي كتبها Transinfection من الخلايا الجذعية

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

المظهرية والتحليل الوظيفي من المنشط خلايا تنظيم تي المعزولة من الفئران المصابة بفيروس المزمنة الليمفاوي المشيمي

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the development and persistence of many health related infections. One of the most well described and studied biofilms in human disease occurs in chronic pulmonary infection of cystic fibrosis patients. When studying biofilms in the context of the host, many factors can impact biofilm formation and development. In order to identify how host factors may affect biofilm formation and development, we used a static chambered coverglass method to grow biofilms in the presence of host-derived factors in the form of sputum supernatants. Bacteria are seeded into chambers and exposed to sputum filtrates. Following 48 hr of growth, biofilms are stained with a commercial biofilm viability kit prior to confocal microscopy and analysis. Following image acquisition, biofilm properties can be assessed using different software platforms. This method allows us to visualize key properties of biofilm growth in presence of different substances including antibiotics.

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

تصور آثار البلغم للتنمية بيوفيلم باستخدام نموذج غرف ساترة

Biofilms consist of groups of bacteria encased in a self-secreted matrix. They play an important role in industrial contamination as well as in the ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To achieve this goal, the development of diagnostic techniques to recognize bacterial presence in real-time at the point-of-care is required. Optical imaging for direct identification of bacteria within the host is an attractive approach. Several attempts at chemical probe design and validation have been investigated, however none have yet been successfully translated into the clinic. Here we describe a method for ex vivo validation of bacteria-specific probes for identification of bacteria within the distal lung, imaged by fibered confocal fluorescence microscopy (FCFM). Our model used ex vivo human lung tissue and a clinically approved confocal laser endomicroscopy (CLE) platform to screen novel bacteria-specific imaging compounds, closely mimicking imaging conditions expected to be encountered with patients. Therefore, screening compounds by this technique provides confidence of potential clinical tractability.

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

This technique describes an efficient screening process for evaluating bacteria-specific optical imaging agents within ex vivo human lung tissue, by fibered confocal fluorescence microscopy for the rapid identification of small molecule chemical probe-candidates with translatable potential.

تحقيقات الفحص البصري للرواية الخاصة بالبكتيريا في أنسجة الرئة البشرية السابقين فيفو بالليزر [كنفوكل] اندوميكروسكوبي

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...