This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV-Stämme und Handhabung Hinweis: Recombinant kein Ausbreiten HSV-1 (KOS) gL86 und HSV-2 (KOS) 333gJ - mit beta-Galactosidase - Reporteraktivität verwendet wurden von V. Twiari 36,37 zur Verfügung gestellt. <ol><li> Verwenden Sie Virus aus einem Los und bei -80 ° C bei einer 1: 1-Verhältnis von Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 20% fötalem Rinderserum (FBS) und Magermilch bis zur Verwendung. Vor viral Menge Lagerung, Viruskonzentration von o - Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid (ONPG) und 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid (X-Gal) Assay bestimmen. </li><li> Bestimmen die Lebensfähigkeit des Virus und Multiplizität der Infektion (MOI) von X-Gal - Färbung für jeden experimentellen Testlauf unter Verwendung von Reporter - Virus Eintrag Assay, wie vorstehend beschrieben (Figur 1) 14. </li><li> Verdünnte-Virus (Opt-MEM), um die gewünschten MOI. Fix Monolayern (Paraformaldehyd, 0,5 ml / Vertiefung) vor der Färbung. Platzieren Sie die Lebensfähigkeit des Virus Kontrollen in einem separaten microtiter Platte parallel zu polymikrobiellen Testplatten. </li></ol> 2. HeLa 299 Cell Handling <ol><li> Wachsen bei 37 ° C, 5% CO 2 in DMEM mit 4,5 g / L Glucose, 10% hitzeinaktiviertes fötales Rinderserum (FBS), Gentamicin (50 ug / ml) und L-Glutamin. Passage-Zellen bei 80% Konfluenz mit Trypsin-Lösung (Ethylendiamintetraessigsäure, 0,53 M EDTA; 0,05% Trypsin; 5 ml / Kolben). </li></ol> 3. C. albicans Handhabung Hinweis: C. albicans aus einem klinischen Labor Quelle erhalten wird bei -80 ° C in Remmel Magermilch 2x Medium gespeichert. <ol><li> Kultur gefroren Lager auf Sabouraud-Dextrose-Medium (37 ° C). Nach 24 Stunden Subkultur der C. albicans auf Fungisel Medium (37 ° C; 48 h) zur Verwendung. </li><li> Generieren Keimschlauch (GT) Formen (Pick repräsentative Kolonien; 3 ml FBS; 3 h; 37 ° C; Abs 600, 0,3). Nach der Inkubation waschen GT (HBSS; 2x; 4000 · g). In gewaschen GT erwärmt HBSS (37 &amp;# 176; C; 0,32 Abs 600). GT Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt. </li><li> Machen Sie Hefeform (YF) Stoffsuspensionen durch Picken Vertreter Fungisel Kolonien (HBSS, 3 ml; 0,32 Abs 600). Zählen Sie die Anzahl von YF Formen / ml unter Verwendung von mikroskopisch einer Zählkammer. YF Formulare sollten 99% der Zellen beobachtet, wie er durch Haemocytometerzählung bestimmt. </li><li> Machen Sie arbeiten Pilz-Lager (250 ul GT oder YF Lager in 25 ml HBSS; 37 ° C; 10 5 KBE / ml) </li></ol> 4. S. aureus Handhabung <ol><li> Shop S. aureus ATCC 25923 (-80 ° C; Remmel Milch 2x abschöpfen). Kultur auf Schafblut-Agar (5%; 37 ° C; 24 h). Wählen repräsentative Kolonien und übertragen Salze Mannit Medium innerhalb von 2 Tagen für Lager (37 ° C; 18 h). </li><li> Machen Sie S. aureus Stoffsuspension (3 ml HBSS; 1.32 Abs 600; 10 8 KBE / ml) <ol><li> Machen Sie S. Arbeits aureus Lager (100 &amp; mgr; lder Lager in 25 ml HBSS; 10 5 CFU / ml). </li></ol></li></ol> 5. Candida und S. aureus Suspensions <ol><li> Machen Sie Misch C. albicans und S. aureus - Suspension (250 ul YF oder GT Lager und 100 &amp; mgr; l S. aureus Lager in 25 ml HBSS). </li></ol> 6. polymikrobiellen Biofilm-Assay <ol><li> Seed Platten mit 96 Vertiefungen mit 200 ul 2 x 10 5 HeLa - Zellen / ml (85% Konfluenz Ebene). Gesteinsplatten (30 - 45 min; 37 ° C) vor der Inkubation (37 ° C; 5% CO 2 -Inkubator; 18 h). Wash Monolayern (1x; Opt-MEM) dann Samen mit HSV (HSV-1 (KOS) gL86 oder HSV-2 (KOS) 33 gJ - in 100 ul Opt-MEM; MOI 50 und 10). Inkubieren Platten (3 h; 37 ° C; 5% CO 2). Verwenden Sie nur einen Virusstamm pro Tag. </li><li> Waschen infizierten Monoschichten (1x; phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit Mg +2 und Ca +2; 100 &amp; mgr; l). Ersetzen PBS mit warmem HBSS verlassen 25 &amp; #181; l in jeder Vertiefung. <ol><li> In YF, GT und / oder S. aureus Arbeits Suspensionen (100 &amp; mgr; l, Ziel zu Zellenverhältnis = 5: 1; n = 16) dar . Wie in Tabelle 1 angegeben inkubieren Platten (static; 30 min; 37 ° C; 5% CO 2). </li></ol></li><li> Nach der Inkubation aspirate eine Spalte zu einer Zeit sofort mit 300 &amp; mgr; l PBS mit Mg +2 und Ca +2 Nachfüllen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal fügen Sie dann Radio-Immunopräzipitation Lysepuffer (RIPA; Filter sterilisiert; 200 ul einer Verdünnung von 1:50). </li><li> Verreiben schnell die HeLa Zelllysat anschießend auf 50 &amp; mgr; l Mannit Salze (MS) und / oder Fungisel (F) Medien (Abbildung 2). Verbreiten Sie das Lysat mit einem Glasstab gebogen in einem 90 ° Winkel mit. Inkubiere die Platten (18 h bei 37 ° C). zählen manuell die Anzahl der Kolonien pro Platte. Kontrollen bestehen aus S. aureus und / oder C. albicans Einhaltung der HSV-nicht infizierten HeLa - Zellen. </li></ol> 7. Imaging Studies &lt;/ P&gt; <ol><li> Waschen Sie jede Runde Deckglas (12 mm; 50 ml Aceton in 100-ml-Becher). Trockene und sterilisieren Deck (Kimwipes; Petrischalen aus Glas). Legen Sie trockene sterile Deckgläschen in die Vertiefungen von sterilen 24-Well-Platten mit Alkohol Flamme sterilisierten Pinzette. </li><li> Hinzufügen HeLa-Zellen (1 ml; 5x Volumen für 96-Well-Platten verwendet werden) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten die gewaschenen sterilen Rundglasplättchen enthält. Fügen Sie die Viren, Bakterien und Pilze nach der Vorlage (Tabelle 2) bei 5x das Volumen der 96 - Well - Platten verwendet, dann brüten und Verfahren , wie 6.2.1 bis 6.4 oben in den Schritten beschrieben. </li><li> Nach dem letzten Waschen, Fixieren der Zellen für die Mikroskopie durch die Folie mit Methanol überschwemmen und ermöglicht es zu verdampfen. Lagern Sie die Platten bei RT bis zur Färbung. </li><li> Für Hellfeldmikroskopie (1,000x letzte Originalvergrößerung) füllen die Vertiefungen mit Methanol fixierten Deck mit entsalztem Wasser enthält. Ab sofort absaugen Wasser. Cover jede Deckglas mit Grams Kristallviolett. Wash Deckgläser frei von nicht gebundenen Fleck (VE-Wasser). Dry Deck in situ haften sie dann mit harten Satz Eindeckmediums zu einem markierten Schieber (Abbildung 3). </li><li> Für Fluoreszenzmikroskopie (100x Objektiv; 1,000x letzte Originalvergrößerung) waschen Deckgläser frei im wesentlichen aus Methanol, wie in Schritt 7.4 beschrieben. Trocknen Sie die Deckgläser in den Vertiefungen. <ol><li> die Deckgläser Nach dem Trocknen entfernen und sie auf markierten Folien. Dann fügen Sie eine ausreichende Menge an 1:20 Verdünnung von Fluorescein (FITC) -konjugierte Herpes Simplex Virus Typ 1 + 2 gD-Antikörper das Deckglas zu bedecken (1 - 5 ul). </li><li> Inkubieren der Objektträger in einer feuchten Kammer bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in vier Änderungen von PBS. </li><li> Nach dem letzten Waschen, bringen Sie das Deckglas an die markierte Folie. Fleck mit 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI; Feuchtigkeitskammer; 37 ° C für 30 min). Nach der Inkubation waschen Sie die Deckgläser in 4 changes von PBS, dann zu dem markierten Schlitten mit harten Satz Eindeckmediums befestigen. </li><li> Ermöglichen die Befestigungsmittel für 24 h bei RT im Dunkeln zu heilen. Untersuchen Sie die Deckgläser unter Öl-Objektiv entweder auf einem Hellfeld-Mikroskop oder Fluoreszenzmikroskop mit FITC und DAPI Cutoff-Filter. Untersuchen Sie Bilder von mindestens 50 Felder (100 Zellen pro Organismus Minimum) für die Co-Lokalisierung (Abbildung 4). </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Derzeit liegen keine Informationen über komplexe Wechselwirkungen zwischen permanent zu semi-permanenten Mitglieder des Host microbiome , die mehrere taxonomische Domänen kreuzen, dh prokaryotischen, eukaryotischen und viral. Deshalb entwickelten wir ein neuartiges in System - vitro - Modell Biofilm Einleitung von S. zu studieren aureus und C. albicans auf HSV-1 oder HSV-2 infizierten HeLa 229 (HeLa - Zellen) 38. Die HeLa-Zellen Modellsystem stellt einen...

<html> Der menschliche microbiome umfasst unterschiedliche Organismen aus verschiedenen taxonomischen Königreiche, die im Körper geografischen Regionen teilen. Die Einhaltung der Zelloberflächen ist ein wichtiger erster Schritt in die Biofilmbildung, die Teil des microbiome Kolonisierung ist. Eingeschlossen in die microbiome können Viren sein, die chronische und persistente Infektionen verursachen. Die chronische Zellinfektion durch diese Viren kann eine Veränderung in mutmaßlichen Rezeptor Verfügbarkeit führen. 1,2 Zusätzlich Zelleintritt durch intrazelluläre Erreger auch Wirts Membranfluidität / Hydrophobizität, die wiederum verändern können Anbringung weiterer microbiome Mitglieder, einschließlich Bakterien und Pilzen beeinflussen könnten . Um die Wechselwirkungen zu verstehen, die zwischen diesen mehrere Krankheitserreger, die Co-Lokalisierung in den gleichen Regionen des menschlichen Wirts auftreten können, müssen wir die Wechselwirkung von Krankheitserregern zu studieren können, die das Spektrum von taxonomischen Königreiche, die an der Schleimhautoberfläche darstellen. t &quot;&gt; Die Herpesviridae sind eine Familie von Mikroben in 100% der Menschen als ständige Mitglieder des microbiome 3,4. Darüber hinaus können sie auch beide beharrlich vergossen werden in Gegenwart und in Abwesenheit von Symptomen. Insbesondere Herpes - simplex - Virus-1 und Herpes-simplex-Virus-2 (HSV-1 und HSV-2, jeweils) sind permanent Mitglieder der microbiome im oronasopharynx und Genitaltrakt. in immunkompetenten Individuen sowohl HSV-1 und HSV-2 verursachen Gingivostomatitis, sowie Genital - Herpes 5-8. an diesen Stellen verursacht HSV eine latente durch chronische persistente asymptomatischen Virus gekennzeichnet Infektion zu vergießen 9. Eintritt von HSV in Zellen führt zu Veränderungen in der Oberflächenexpression von nectins, Heparansulfat, Lipid Rafts und Herpes - Virus Eintrag Mediator / Tumor - Nekrose Faktor - Rezeptor (HVEM / TNFr) 25.10. Diese potenziell gemeinsamen Rezeptoren für einige Bakterien und Pilze darstellen, zB S. aureus und C. albicans, die während opportunistische Erreger,können auch als Mitglieder der Schleimhaut microbiome des oronasopharynx 26,27 befinden. Innerhalb des oronasopharynx S. aureus und C. albicans belegen zwei verschiedene Stellen der Besiedlung. In Hosts mit natürlichen Zähnen wird die Mundschleimhaut durch HSV-1 geteilt und C. albicans, während die vorderen Nasen nares werden von S. besetzt aureus 28. Doch trotz in - vitro - Ergebnisse , dass S. aureus hält sich an den Mund Epithelzellen, 29,30 S. aureus ist selten von oralen Proben isoliert , wenn die normale Gewebe vorhanden 29,30 ist. Es ist wenig bekannt , Genitaltrakt über Co-Kolonisation Nischen jenseits der klinischen Befunde , dass S. aureus ist mit aerober Vaginitis verbunden sind , gekennzeichnet durch Genital - Entzündung, Entladung und Dyspareunie, während C. albicans erzeugt Schleimhautläsionen ähnlich der in der Mundhöhle beobachtet 31-35. Obwohl also diese Mitglieder der Mund- und Genital microbiome Quer taxonomischen Reiche wenig bekannt ist , ihre Interaktion , wie sie Auswirkungen ihrer Fähigkeit , die Bildung von Biofilmen durch die Einhaltung der Wirtszelloberfläche 5 über einzuleiten. Dieses Protokoll wurde effektiv die funktionellen Folgen der Co-Kolonisation / Infektion zu bestimmen, angewandt.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

Die Studie von polymikrobiellen Interaktionen über die taxonomische Königreiche, die Pilze, Bakterien und Viren sind nicht zuvor in Bezug auf, wie virale Mitglieder des microbiome beeinflussen nachfolgende Mikroben-Interaktionen mit diesen Virus infizierten Wirtszellen untersucht worden. Das Zusammenleben von Virus mit Bakterien und Pilzen besteht hauptsächlich darin, die auf den Schleimhäuten der Mundhöhle und des Genitaltrakts. Mucosal Zellen, insbesondere solche mit persistenten chronischen oder persistenten latenten Virusinfektionen, könnte einen erheblichen Einfluss auf die Mitglieder des microbiome durch Virus Veränderung in der Anzahl und Art der Rezeptoren zum Ausdruck gebracht haben. Änderung in Wirtszellmembran Architektur in veränderter Fähigkeit der nachfolgenden Mitglieder der normalen Flora und opportunistischen Erregern würde den ersten Schritt in die Biofilmbildung, das heißt, die Einhaltung zu initiieren. Diese Studie beschreibt ein Verfahren zur Quantifizierung und visuelle Untersuchung des HSV Wirkung auf die Einleitung BIOFILm - Bildung (Adhärenz) von S. aureus und C. albicans.

Der Grad der Zuverlässigkeit der Daten , die aus System in diesem Bericht beschrieben wird , in Abbildung 2 af 38 gezeigt. Durch die Verwendung dieses Systems die Modulation von Staphylokokken und Pilz Wechselwirkung mit viral infizierte Zellen und deren Wirkung auf jedes Anhaften des anderen können abgegrenzt werden. Diese Arten von Studien erfordern mikroskopische Untersuchung der Wechselwirkung , wie in den 3 und 4 gezeig...

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Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K Aufrufe.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Serie: Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

Assay für Adhäsion und Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

Forschung

Biologie

Invasion of Human Cells by a Bacterial Pathogen

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be applied to the study of cell invasion by virtually any culturable bacterium. The stages at which specific aspects of invasion can be studied, such as the role of actin rearrangement or caveolae, will be highlighted. Host cells are grown in flasks and when ready for use are seeded into 24-well plates containing Thermanox coverslips. Using coverslips allows subsequent removal of the cells from the wells to reduce interference from serum proteins deposited onto the sides of the wells (to which S. aureus would attach). Bacteria are grown to the required density and washed to remove any secreted proteins (e.g. toxins). Coverslips with confluent layers of endothelial cells are transferred to new 24-well plates containing fresh culture medium before the addition of bacteria. Bacteria and cells are then incubated together for the required amount of time in 5% CO2 at 37&deg;C. For S. aureus this is typically between 15-90 minutes. Thermanox coverslips are removed from each well and dip-washed in PBS to remove unattached bacteria. If total associated bacteria (adherent and internalised) are to be quantified, coverslips are then placed in a fresh well containing 0.5% Triton X-100 in PBS. Gentle pipetting leads to complete cell lysis and bacteria are enumerated by serial dilution and plating onto agar. If the number of bacteria that have invaded the cells is needed, coverslips are added to wells containing 500 &mu;l tissue culture medium supplemented with gentamicin and incubation continued for 1 h, which will kill all external bacteria. Coverslips can then be washed, cells lysed and bacteria enumerated by plating onto agar as described above. If the experiment requires direct visualisation, coverslips can be fixed and stained for light, fluorescence or confocal microscopy or prepared for electron microscopy.

A general protocol for the study of invasion of host cells by a bacterial pathogen, focusing on Staphylococcus aureus and human endothelial cells.

Invasion von menschlichen Zellen durch einen bakteriellen Erreger

Here we will describe how we study the invasion of human endothelial cells by bacterial pathogen Staphylococcus aureus . The general protocol can be ...

Immunologie und Infektion

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic matter, as well as regulation of nutrient levels. There they also find numerous opportunities to interact with a variety of other microbes such as bacteria or other fungi. Studying fungal interactions at the cellular level, however, can be challenging owing to the black box-like nature of soil. New microfluidic tools are being developed for the study of fungal interactions; two platforms designed to study bacterial-fungal and fungal-fungal interactions are highlighted. Within these microchannels, fungal-microbial interactions can be monitored in controlled physico-chemical environments at higher temporal and spatial resolution than previously possible. Application of these tools have yielded numerous novel biological insights, such as the observation of bacterial polar attachment to hyphae or revealing uncharacterised fungal-fungal antagonisms. A key feature of these methodologies regards the ease of use of this tool by non-experts, yielding highly translatable technologies for use in microbiology labs.

Owing to the opacity of soil, interactions between its constituent microbes cannot easily be visualised with cellular resolution. Here, two microfluidic tools are presented, which offer new opportunities for investigating fungal-microbial interactions. The devices are versatile and simple to use, enabling high spatiotemporal control and high-resolution imaging at the cellular level.

Mikrofluidische Werkzeuge zur Untersuchung pilzlich-mikrobieller Interaktionen auf zellulärer Ebene

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

Biotechnik

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Messung der Migration und Biofilmbildung verschiedener Bakterien

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

Messung der Migration und Biofilmbildung verschiedener Bakterien

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Candida albicans Biofilm Formation in an In Vivo Mouse Model

Source: Kuchar&#237;kov&#225;, S., et al.&#160; <a href="https://app.jove.com/v/52239">Candida albicans Biofilm Development on Medically-relevant Foreign Bodies in a Mouse Subcutaneous Model Followed by Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates the development of an in vivo mouse model to study the biofilm formation of Candida albicans in subcutaneous tissue. The experiment involves implanting Candida-infected devices in the animal&#39;s back region for biofilm development.

Candida albicans Biofilmbildung in einem in vivo Mausmodell

1. C. albicans Growth

	Twenty-four hours before the initiation of the animal experiment, prepare yeast extract peptone dextrose, YPD plates by adding 10 ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

In Vitro and In Vivo Models

A Method for Sample Preparation to Visualize Biofilm Forming Bacteria on Fungal Hyphae

Source: Guennoc, Cora Miquel, et al, <a href="https://app.jove.com/v/54771">A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2017).
This video describes a method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae using microscopy. Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and involve numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation.

Ein Verfahren zur Probenvorbereitung zur Visualisierung von Biofilm-bildenden Bakterien auf Pilzhyphen

1. Preparation of an In Vitro Biofilm of Bacteria on the Fungal Colony

	Centrifuge the bacterial culture at 5,000 x g for 3 min and suspend the pellet in ...

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

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