Name: determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi
Uploaded: 2016-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
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This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

1. HSV株及び取扱い注：組換え非拡散HSV-1（KOS）gL86およびHSV-2（KOS）333gJを- V. Twiari 36,37によって提供された使用β-ガラクトシダーゼレポーター活性を有します。 <ol><li> 1で-80℃での単一のロットとストアからウイルスを使用してください：20％ウシ胎児血清（FBS）とダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の1の比率、使用するまでスキムミルク。ウイルスロット保存前、 入出力 -nitrophenyl-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG）および5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-GAL）アッセイによりウイルス濃度を決定します。 </li><li>前述のように、レポーターウイルス侵入アッセイを使用して各実験アッセイの実行のためのX-Gal染色により、感染のウイルス生存率および多重度（MOI）を決定する（ 図1）14。 </li><li>希望のMOIに（オプトMEM）のウイルスを希釈します。染色の前に、単層（/ウェル0.5ミリリットルパラホルムアルデヒド）を修正しました。別々のmicroti中のウイルスの生存能力のコントロールを配置複数菌アッセイプレートと平行にタープレート。 </li></ol> 2.のHeLa 299細胞の取扱い<ol><li> 4.5g / Lグルコース、10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）、ゲンタマイシン（50μg/ ml）およびL-グルタミンを含むDMEM中で37℃、5％CO 2で成長します。トリプシン溶液で80％コンフルエンスで継代細胞（エチレンジアミン四酢酸、0.53 M EDTA、0.05％トリプシン; 5ミリリットル/フラスコ）。 </li></ol> 3. C.取り扱いアルビカンス 注：C.臨床検査源から得アルビカンス媒体約2倍のスキムミルクRemmelに-80℃で保存します。 <ol><li>文化はサブローデキストロース培地（37℃）に株式を凍結しました。 24時間のサブカルチャーC.後Fungisel媒体へアルビカンス （37°C、48時間）の使用のため。 </li><li>発芽管（GT）の形を生成（; 3ミリリットルFBSを、代表的なコロニーを選ぶ3時間、37℃、腹筋600、0.3）。インキュベーション後、GT洗浄（HBSSを、2倍、4,000×gでの）。 （37＆温めHBSSに洗浄GTを追加します。＃176; C; 0.32のAbs 600）。 GT形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。 </li><li>代表Fungiselコロニーピッキングによって酵母形（YF）株式懸濁液を作る（HBSS、3ミリリットルを、0.32のAbs 600）。 /微視的に血球計数器を使用して、mlのYFのフォームの数をカウントします。 YF形態は、血球計数によって決定されるように観察された細胞の99％であるべきです。 </li><li>作業の真菌株（; 37℃; 10 5 CFU / mlの25ミリリットルHBSS中のGTまたはYF株式の250μl）を作ります</li></ol> 4. S.球菌取り扱い<ol><li>ストアS.黄色ブドウ球菌 ATCC 25923（-80°C; Remmelは牛乳の2倍を脱脂）。ヒツジ血液寒天培地（; 37℃、24時間、5％）上に培養。代表的なコロニーを選択し、株式のために2日以内に培地塩をマンニトールへの転送（37℃、18時間）。 </li><li> S.を作ります黄色ブドウ球菌ストック懸濁液（3ミリリットルHBSS; 1.32腹筋600; 10 8 CFU / ml）を<ol><li> S.作業してください黄色ブドウ球菌株（100μlの25ミリリットルのHBSSの株式の。 10 5 CFU / mlで）。 </li></ol></li></ol> 5. カンジダとS.球菌懸濁液<ol><li>メイク混合C.アルビカンスおよびS.黄色ブドウ球菌懸濁液（250μlのYFまたはGTの株式と25ミリリットルHBSS中の100μlの黄色ブドウ球菌株 ）。 </li></ol> 6.複数菌バイオフィルムアッセイ<ol><li> 2×10 5 HeLa細胞/ mlの200μlの（85％のコンフルエンスのレベル）でシード96ウェルプレート。ロックプレート（30から45分、37℃）インキュベーション前（37℃、5％CO 2インキュベーター; 18時間）。ウォッシュ単層（1×;オプトMEM）をHSVにシード（HSV-1（KOS）gL86またはHSV-2（KOS）33 GJ - 100μl中のOpt-MEM; MOI 50及び10）。プレートをインキュベート（3時間、37℃、5％CO 2）。 1日に1回だけウイルス株を使用してください。 </li><li>感染した単層（; Mgの2及びCa 2を含むリン酸緩衝生理食塩水（PBS）;100μlの1×）で洗浄します。 25＆＃残し暖かいHBSSでPBSを交換してください181;各ウェルのリットル。 <ol><li> YF、GTおよび/ ​​またはSを追加します。 表1に示されるように平板培養する（静的に、30分間、37°C、5％CO 2） 黄色ブドウ球菌ワーキング懸濁液（N = 16; 1、100μlの細胞比の目標= 5）。 </li></ol></li><li>インキュベーション後、一度に吸引1列には、すぐにマグネシウム2およびCa +2で300μlのPBSで再充填します。ラジオ免疫沈降アッセイ溶解バッファー（;濾過滅菌; 1:50希釈の200μlのRIPA）を追加し二回、この手順を繰り返します。 </li><li>急速にHeLa細胞溶解物は、次いでマンニトール塩（MS）及び/又はFungisel（F）培地（ 図2）の上に50μlのを配置し粉砕します。 90°の角度でガラス棒を曲げを使用して溶解液を広げます。 （37℃で18時間）培養します。手動でプレートあたりのコロニー数をカウントします。コントロールは、Sから成り黄色ブドウ球菌および/ ​​またはC. HSV-非感染HeLa細胞へアルビカンス付着 。 </li></ol> 7.イメージング研究&lt;/ P&gt; <ol><li>各ラウンドガラスカバースリップを洗ってください（12ミリメートル、50ミリリットルのアセトンミリリットルビーカー100中）。乾燥及び滅菌カバースリップ（キムワイプ;ガラスシャーレ）。アルコール火炎滅菌鉗子で滅菌24ウェルプレートのウェルに、乾燥、滅菌カバースリップを置きます。 </li><li>洗浄滅菌ラウンドガラスカバースリップを含む24ウェルプレートのウェルに、HeLa細胞（96ウェルプレートに使用される5倍の体積1ミリリットル）を追加します。上記の手順6.4に6.2.1で説明したように、その後インキュベートし、プロセス、5×96ウェルプレートに使用する音量でテンプレート（表2）によれば、ウイルス、細菌および真菌を追加します。 </li><li>最終洗浄後、メタノールでスライドをフラッディングし、それを蒸発させることにより、顕微鏡検査のために細胞を固定します。染色まで室温でプレートを保管してください。 </li><li>明視野顕微鏡（1,000倍、最終的な元の倍率）のために脱イオン水でメタノール固定カバースリップを含むウェルを埋めます。すぐに水を吸引。グラムクリスタルバイオレットで各カバースリップをカバー。ウォッシュは、非結合染色（脱イオン水）の自由カバースリップ。 その場で乾燥したカバースリップは、その後、標識されたスライドにメディアをマウントハードセット（図3）とそれらを接着します。 </li><li>蛍光顕微鏡（100倍の対物; 1,000倍、最終的な元の倍率）のためにステップ7.4で説明したように、洗浄は、基本的にメタノールの自由カバースリップ。ウェル中のカバースリップを乾燥させます。 <ol><li>乾燥させた後、カバースリップを削除し、ラベルされたスライド上に置きます。 （ - 5μL1）次に、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合単純ヘルペスウイルスのタイプの1：20希釈のカバースリップをカバーするために1 + 2のgD抗体を十分な量を追加します。 </li><li> 30分間、37℃で湿気チャンバー内でスライドをインキュベートします。インキュベーション後、PBSの4変化​​でカバースリップを洗います。 </li><li>最終洗浄後、標識されたスライドにカバースリップを返します。 4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（;湿度室、30分間、37°C​​ DAPI）で染色。インキュベーション後4ちゃんにカバースリップを洗いますPBSのGESは、その後、メディアをマウントハードセットで標識されたスライドに貼り付けます。 </li><li>マウンティング培地は暗所で室温で24時間硬化させます。 FITCおよびDAPIカットオフフィルターで明視野顕微鏡や蛍光顕微鏡のいずれかで油浸対物レンズの下にカバースリップを調べます。共局在（ 図4）のために少なくとも50フィールド（生物ごとに最低100個の細胞）の写真を調べます。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

現在のところ情報は、原核生物、真核生物およびウイルスの複数の分類学上のドメイン、 すなわち 、交差ホストmicrobiomeの半永久的なメンバーに永久の間の複雑な相互作用に利用できません。したがって、我々はSでバイオフィルムの開始を研究するためのインビトロモデルシステムで小説を開発しましたaureusおよびC. HSV-1またはHSV-2上アルビカンス?...

<html>人間microbiomeは、体内の地理的領域を共有する複数の分類学上の王国からの多様な生物が含まれます。細胞表面への付着はmicrobiomeの植民地化プロセスの一部であるバイオフィルム形成に不可欠な最初のステップです。 microbiomeに含まれては、慢性かつ持続的な感染症を引き起こすウイルスであることができます。これらのウイルスによる慢性細胞感染は推定受容体の可用性における変化を引き起こす可能性があります。また1,2、細胞内病原体による細胞エントリも順番に細菌や真菌などの他のmicrobiomeメンバーの添付ファイルを、変更することができるホスト膜流動性/疎水性に影響を与える可能性があります。ヒト宿主の同じ地域に共局在これらの複数の病原体との間で発生する可能性があります相互作用を理解するために、我々は、粘膜表面に存在する分類学上の王国のスペクトルを表し、病原体の相互作用を研究することができなければなりません。 tは&quot;&gt;ヘルペスウイルスはmicrobiome 3,4の永久的なメンバーとしてのヒトの100％に存在する微生物のファミリーである。加えて、それらはまた、永続的両方の症状の存在下および非存在下で流すことができる。具体的には、単純ヘルペスウイルス1および単純ヘルペスウイルス2（HSV-1およびHSV-2、それぞれ）HSV-1およびHSV-2の原因の歯肉口内炎の両方、免疫適格個体で。oronasopharynx及び生殖管におけるmicrobiomeの永久的なメンバーであるだけでなく、性器ヘルペス5-8。これらのサイトでは、HSVは、慢性持続nectins、ヘパラン硫酸、脂質ラフトとヘルペスウイルスエントリーメディエーターの表面発現の変化における細胞の結果にHSVの9。エントリを流しウイルス無症候性/腫瘍壊死によって特徴づけ潜伏感染を引き起こします因子受容体（HVEM / TNFR）10月25日 。これらは、潜在的に日和見病原体ながら、いくつかの細菌および真菌のための共有の受容体を表す例えば黄色ブドウ球菌およびカンジダ・アルビカンス、これ、またoronasopharynx 26,27の粘膜microbiomeのメンバーとして常駐することができます。 oronasopharynx S.内aureusおよびC.アルビカンスは植民地化のの2つの異なる部位を占めます。天然歯を持つホストでは、口腔粘膜は、HSV-1およびCによって共有されていますアルビカンス、前部鼻鼻孔はS.によって占有されている間黄色ブドウ球菌 28。しかし、にもかかわらず、in vitroでの知見そのS.黄色ブドウ球菌は、口腔上皮細胞に付着し、29,30 S.正常組織29,30存在する場合球菌はまれ経口標本から単離されます。リトルは、臨床所見ものを超える生殖管の共同植民地化のニッチについて知られているS.黄色ブドウ球菌は C.ながら、性器の炎症、放電および性交疼痛症によって特徴づけられる、好気性膣炎に関連していますアルビカンスは、口腔31〜35で観察されたものと同様の粘膜の病変を生成します。このように、経口および生殖器microbiのこれらのメンバーが、分類学的王国少しOMEクロスは、宿主細胞表面5への接着を介してバイオフィルムの形成を開始することが影響能力としてのそれらの相互作用について知られています。このプロトコルは、効果的に、共コロニー形成/感染の機能的結果を判定するために適用されています。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;C.albicans&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BBL Sabouraud Dextrose</td><td>BD</td><td>211584</td><td></td></tr><tr><td>Fungisel Agar</td><td>Dot Scientific</td><td>7205A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;&lt;em&gt;S.aureus&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mannitol Salt Agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>7143B</td><td></td></tr><tr><td>Sheep blood agar</td><td>Troy Biologicals</td><td>221239</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Hela cells&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x DMEM (Dubelcco&#039;s Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate</td><td>Corning</td><td>10-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma</td><td>1397</td><td>50 &amp;micro;g/ml final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53 M EDTA)Solution 1x</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>10% final concentration in the complete DMEM</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other medium and reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ONPG</td><td>Thermo Scientific</td><td>34055</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-Pure X gal</td><td>Invitrogen</td><td>15520-018</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS (Hanks&#039; Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>20-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Dot Scientific</td><td>30042-500</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Lysis</td><td>Life Technologies</td><td>89901</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Staining&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>HSV 1&amp;amp;2, specific for gD</td><td>ViroStat</td><td>196</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D8417-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gram Crystal Violet</td><td>Troy Biologicals</td><td>212527</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 100 x 15</td><td>Dot Scientific</td><td>229693&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish 150 x 15</td><td>Kord Valmark</td><td>2902</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8030-01F</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>222-8044-01F</td><td></td></tr><tr><td>Culture tubes 100 x 13</td><td>Thomas Scientific</td><td>9187L61</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip circles, 12 mm</td><td>Deckglaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of biofilm initiation on virus-infected cells by bacteria and fungi

真菌、細菌やウイルスを含む分類学上の王国全体で複数菌相互作用の研究は、以前microbiomeのウイルスのメンバーは、これらのウイルスに感染した宿主細胞とそれに続く微生物相互作用をどのように影響するかに関して検討されていません。細菌および真菌とのウイルスの共居住は、主に口腔及び生殖管の粘膜表面上に存在します。粘膜細胞、持続性の慢性または持続性ウイルス潜伏感染症、特にものは、発現された受容体の数とタイプでウイルス改変を通じてmicrobiomeのメンバーに重大な影響を与える可能性があります。宿主細胞膜のアーキテクチャの変更は、バイオフィルム形成の最初のステップを開始するための正常細菌叢と日和見病原体のその後のメンバーの変更された能力、 すなわち 、密着性をもたらすであろう。この研究は、biofilの開始時にHSVの効果の定量化および目視検査のための方法を説明しS.のm個の形成（付着） aureusおよびC.アルビカンス 。

このレポートに記載されているシステムから得られるデータの堅牢性のレベルは、 図2のaf 38に示されています。このシステムを使用することによりウイルス感染細胞や互いの密着性に及ぼす影響とブドウ球菌と真菌の相互作用の変調が描写することができます。多菌相互作用が同じ細胞で発生しているかどうかを決定するために、 図3</stron...

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Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

determination-biofilm-initiation-on-virus-infected-cells-bacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K ビュー.  Midwestern University. A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

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Microtiter Dish Biofilm Formation Assay

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings. In fact, life in a biofilm probably represents the predominate mode of growth for microbes in most environments. Mature biofilms have a few distinct characteristics. Biofilm microbes are typically surrounded by an extracellular matrix that provides structure and protection to the community. Microbes growing in a biofilm also have a characteristic architecture generally comprised of macrocolonies (containing thousands of cells) surrounded by fluid-filled channels. Biofilm-grown microbes are also notorious for their resistance to a range of antimicrobial agents including clinically relevant antibiotics.
The microtiter dish assay is an important tool for the study of the early stages in biofilm formation, and has been applied primarily for the study of bacterial biofilms, although this assay has also been used to study fungal biofilm formation. Because this assay uses static, batch-growth conditions, it does not allow for the formation of the mature biofilms typically associated with flow cell systems. However, the assay has been effective at identifying many factors required for initiation of biofilm formation (i.e, flagella, pili, adhesins, enzymes involved in cyclic-di-GMP binding and metabolism) and well as genes involved in extracellular polysaccharide production. Furthermore, published work indicates that biofilms grown in microtiter dishes do develop some properties of mature biofilms, such a antibiotic tolerance and resistance to immune system effectors.
This simple microtiter dish assay allows for the formation of a biofilm on the wall and/or bottom of a microtiter dish. The high throughput nature of the assay makes it useful for genetic screens, as well as testing biofilm formation by multiple strains under various growth conditions. Variants of this assay have been used to assess early biofilm formation for a wide variety of microbes, including but not limited to, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococci, mycobacteria and fungi.
In the protocol described here, we will focus on the use of this assay to study biofilm formation by the model organism Pseudomonas aeruginosa. In this assay, the extent of biofilm formation is measured using the dye crystal violet (CV). However, a number of other colorimetric and metabolic stains have been reported for the quantification of biofilm formation using the microtiter plate assay. The ease, low cost and flexibility of the microtiter plate assay has made it a critical tool for the study of biofilms.

The assay describes a rapid means to measure early biofilm formation in bacteria and fungi. This method uses a microtiter plate as the substratum for microbial biofilm formation, and the biofilm is visualized using crystal violet strain. The assay provides either a qualitative or quantitative assay for early biofilm formation.

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

Biofilms are communities of microbes attached to surfaces, which can be found in medical, industrial and natural settings.  In fact, life in a biofilm ...

免疫・感染学

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

研究のための方法論<em&gt; B。枯草菌</em小分子バイオフィルム阻害剤を特徴付けるためのモデルとしての&gt;バイオフィルム

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

生物学

アシネトバクターのバイオフィルム形成の評価とバイオフィルムの特性評価

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

著者スポットライト:アシネトバクターバイオフィルムの定量化、評価、および視覚化のための包括的なプロトコル 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

要約

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マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオフィルム形成: 同定及び定量化の手法

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

細菌や真菌によってウイルス感染細胞上のバイオフィルムの開始の決意

要約

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この動画の章

マイクロタイター皿のバイオフィルム形成アッセイ

8ウェルチャンバースライドを用いたin vitro のバイオフィルム形成における

研究のための方法論

共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いて糸状菌コロニー上の細菌のバイオフィルムの定性的マルチスケール解析のための新しい方法

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

アシネトバクターバイオフィルムの定量化、生存率評価、可視化戦略

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオフィルム形成: 同定及び定量化の手法