The authors have no Acknowledgements.

1. خلية التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نمو الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو د. خلايا discoideum في المتوسط AX في 23 درجة مئوية تحت الضوء في لوحات زراعة الأنسجة. تجنب الاحتفاظ الخلايا بكثافات عالية فوق 75٪ confluency. ملاحظة: للحصول على استجابة المثلى للإجهاد الحراري، والخلايا يجب أن تكون في مرحلة النمو الأسي وألا يكون قد بلغ مرحلة ثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم قبل التصوير، والخلايا تنقسم إلى متوسطة مضان منخفضة (LFM) إلى 1 × 10 4 خلية / مل. ملاحظة: هذه الخطوة غير ضرورية للحد من مضان الخلفية التي تسببها على المدى المتوسط ​​AX. ويمكن تخفيض فترة حضانة لمدة لا تقل عن 2 ساعة. ومع ذلك، يمكن الحويصلات تناولها في المتوسط ​​AX لا تزال تولد بعض الإشارات الخلفية بعد 2 ساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا للفحص المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل التصوير، وخلايا الحصاد من لوحة الأنسجة في LFM ونقل عدد كاف من الخلايا في أطباق زجاجية أسفل. ملاحظة: عادة،1 × 10 5 خلية / مل غير كاف. ومع ذلك، إذا كان الإعداد التجريبية يتطلب فترات التصوير الطويلة (أطول من 8 ساعات)، تحتاج أعداد الخلايا إلى تعديل بعناية، ود. وخلايا discoideum الانتقال إلى دورة التنموية والبدء في تيار ومجموع المباراتين إذا أعداد الخلايا مرتفعة بينما المواد الغذائية منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح للخلايا ليستقر لمدة 20 دقيقة. إزالة الخلايا غير مسددة عن طريق استبدال بعناية الوسيلة المستخدمة مع المتوسط ​​الطازجة. </li></ol></li></ol> 2. التصوير ملاحظة: بروتوكول يمكن استخدامها في أنظمة واسعة المجال وكذلك في الاجهزة المجهر مبائر. استخدام مربع حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر مفيد، ولكن ليس من الضروري التحكم في درجة حرارة. يتم تعيين درجة حرارة مربع الحضانة إلى أعلى درجة حرارة المستخدمة في التجربة، على سبيل المثال، إلى 40 درجة مئوية إذا يتم تنفيذ الإجهاد الحراري. وإلا، يتم ضبط درجة الحرارة إلى 256؛ C. وينبغي بذل التغيرات في درجات الحرارة في وقت مبكر يسمح النظام للتكيف، والتغيرات في درجات الحرارة أثناء التصوير يمكن أن تؤثر على التركيز. ملاحظة: أثناء التصوير، ويتم التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد. درجة الحرارة الافتراضية لتصوير الخلايا غير المجهدة هي 23 درجة مئوية. لظروف الإجهاد الحراري، وزيادة درجة الحرارة وفقا لذلك إلى المستوى المطلوب. العنصر بيزو في غرفة التبريد يمكن أن تستجيب بسرعة جدا من التحول درجة الحرارة. ومع ذلك، فإن التركيز على الصور تتغير قليلا (يمكن أن تحيد لتصل إلى 20 ميكرون تبعا لتغير درجة الحرارة). وبالتالي مطلوب إعادة التركيز اليدوي في الدقائق الأولى من الحصول على الصور، إلا إذا تم تجهيز الاداة المستخدمة مع التركيز التلقائي الأجهزة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور في ظل ظروف غير وشدد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا صورة في ظل ظروف غير أكدت في 23 درجة مئوية، والحصول على ما لا يقل عن 6 مجالات عرض (FOVs). ملاحظة: حالة عدم الإجهاد يمكن أن يكون visualizإد إما عن طريق تسجيل قصيرة الوقت الفاصل بين (5-30 دقيقة) أو الحصول على اللقطات التمثيلية. لكل حالة أو خلية خط امتلاك حد أدنى من 6 مجالات عرض (FOVs). ملاحظة: في حالة الخلايا الفردية هي من مصلحة أو مركز الخلايا منها في منتصف مجال الرؤية وتسجيل سلسلة بلاط 3 × 3 مع فوف التي تحتوي على خلايا الفائدة في منتصف د. خلايا discoideum هي متحركة وقد تهاجر من فوف. ومع ذلك، فإن سلسلة بلاط 3 × 3 يزيد من مساحة يحتمل أن تستكشف من قبل خلية من الاهتمام وأنها لا تزال يمكن عزوها لفترات زمنية الفاصل بين ~ 6 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على مداخن Z من أقصى 7 ميكرون في 1-،25 ميكرون خطوات للقبض على وحدة التخزين بالكامل من الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة مرجع حقل مشرق لتقييم العدد الكلي للخلايا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور عن الإجهاد الحراري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة حرارة غرفة التبريد إلى 30 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. &lt;/ لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد عرض درجة الحرارة وصلت القيمة المطلوبة، إعادة تركيز يدويا في قناة الحقل مشرق وتحقق من كل FOVs سجلت قبل البدء في الوقت الفاصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء الوقت الفاصل عن 4 ساعات من الإجهاد الحراري مع فاصل زمني من 5-10 دقيقة بين نقاط الوقت. تحقق من التركيز الصحيح خلال الاستحواذ على النقطتين الأولى الساعة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور أثناء الانتعاش <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الإجهاد الحراري، والحد من درجة الحرارة إلى 23 درجة مئوية، والانتظار لعرض درجة الحرارة لضبط وإعادة التركيز يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل الوقت الفاصل بين الأفلام في مرحلة الانتعاش لمدة 8-10 ساعة في 10-20 فترات زمنية دقيقة. تحقق من التركيز الصحيح خلال الاستحواذ على نقطة لأول مرة. </li></ol></li></ol> تحليل 3. صورة ملاحظة: لتحديد عدد الخلايا إيواء بؤر عصاري خلوي، تقييم العدد الكلي للخلايا وعدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي في كل مرةهيكل. ويرجع ذلك إلى صعوبة تقسيم الخلايا من الصور الحقل مشرق، يحتاج الكمي الذي يتعين القيام به يدويا. في ما يلي، يتم وصف وتحليل البيانات لحزمة معالجة الصور مجانية ((http://fiji.sc/Fiji). ويتطلب البرنامج المساعد &quot;خلية مكافحة&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم العدد الكلي للخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل مشرق صورة حقل كومة (XYT) بالنقر على &quot;ملف&quot; و &quot;فتح&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;خلية مكافحة&quot; المساعد ( &quot;الإضافات&quot; - &quot;خلية مكافحة&quot;). تحميل كومة الصورة عن طريق النقر على &quot;تهيئة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار النوع المناسب من العدادات وذلك بوضع علامة في الخانة المناسبة. ملاحظة: استخدام نوع (1)، مضادة للعدد الكلي للخلايا والنوع 2 كما مضادة للخلايا مع بؤر عصاري خلوي. عدد جميع الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ علامات بالنقر على &quot;حفظ علامات&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم عدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;لى&gt; تحميل hyperstack صورة مضان (XZYT) ( &quot;ملف&quot; - &quot;فتح&quot;)، وجعل الحد الأقصى لإسقاط كثافة استخدام &quot;Z-العارض&quot; (صورة / الأكوام). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح &quot;خلية مكافحة&quot; المساعد. تحميل الصورة الناتجة كومة (XYT) بالنقر على &quot;تهيئة&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل علامات بالنقر على &quot;علامات الحمل&quot;. تحذير: أسماء ملف الصورة المرجعية وكومة مضان يجب أن تكون متطابقة. إذا لزم الأمر، إعادة تسمية وفقا لذلك قبل تهيئة كومة الصورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر نوع علامة المناسب (انظر 3.1.3) وعدد الخلايا مع بؤر عصاري خلوي. علامات القائمة يمكن أن تستخدم كدليل إرشادي لمنصب الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرداد عدد من التهم لكل شريحة من خلال النقر على &quot;نتائج&quot; وحفظ التهم في أماكن أخرى لمزيد من العمليات الحسابية. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Zoology%22%5BJournal%5D)">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+of+a+model+organism%3A+progress+with+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li>
<li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+finds+new+roles+to+model%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li>
<li>Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+system+-+substantial+share%3A+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li>
<li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q%2FN-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li>
<li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding+in+Dictyostelium%3A+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li>
<li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+and+misfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+spinning+disk+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Techniques%22%5BJournal%5D)">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li>
<li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li>
<li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li>
<li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+response+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

بروتوكول الموصوفة هنا يمكن أن تستخدم لدراسة سلوك بروتين معين من الفائدة استجابة للإجهاد الناجم عن الحرارة. تم الإبلاغ عن زيادة درجة الحرارة إلى 30 درجة مئوية لتحريك استجابة الإجهاد الحراري وفي ظل هذه الظروف جدوى د. يتم تقليل discoideum بشكل ملحوظ. التعديلات بروتوكول يمكن تعديلها لمقارنة سلوك البروتينات المختلفة تحت ظروف الإجهاد نفسها. لهذا، يتم نقل الخلايا معربا عن بروتينات مختلفة مع نفس العلامة الفلورسنت في أطباق متعددة أيضا، مثل أربعة أطباق غرفة (القسم 1.3.1). ويمكن أيضا أن تطبق البروتوكول على خلايا المشترك، معربا عن البروتينات مع علامات مختلفة، مثل GFP أو طلب تقديم العروض. هذا يمكن أن يكون على سبيل المثال تستخدم لمراقبة سلوك مختلف مكونات نظام لمراقبة الجودة من البروتين (PQC). الخلايا معربا عن GFP الموسومة علامة التجميع ومختلف مكونات PCQ الموسومة طلب تقديم العروض ويمكن ملاحظة استخدام متعددة جيدازعته للتصوير. وهذا يضمن ظروف الإجهاد نفس (سرعة ارتفاع درجة الحرارة / نقصان، مدة درجة الحرارة زيادة / نقصان) ويسمح للدراسات المقارنة. وعلاوة على ذلك، فإن بروتوكول يمكن استخدامها لدراسة تأثير النظام PQC على استجابة الإجهاد الحراري. نشاط المكونات يمكن التضمين عن طريق تغيير مستويات التعبير باستخدام أدوات الوراثية مثل الضربة القاضية، أو overexpression أو باستخدام مثبطات معينة المتاحة تجاريا 6. وproteasome ويمكن تثبيط بإضافة MG132 (100 ميكرومتر) أو lactacystin (10 ميكرومتر) إلى وسط النمو. كوصي Hsp90 يمكن تحول دون استخدام geldanamycin (6 ميكرومتر) أو radicicol (10 ميكرومتر). كوصي HSP70 يمكن تثبيط مع VER-155088، على الرغم من أننا لا يمكن تأكيد فعالية تثبيط في إعدادات التجريبية لدينا حتى الآن. يجب إضافة مثبطات يوم واحد قبل التصوير ويتم تحضين الخلايا لمدة 14 ساعة. Criti<html> خطوات كال في إطار بروتوكول في خطوة حاسمة لتقييم الاضطراب الناجم عن الحرارة وحالة الخلايا السابقة للتجربة التصوير. وأظهرت دراسات في الخميرة أن الخلايا تكتسب مقاومة لمجموعة متنوعة من الضغوط البيئية خلال مرحلة ثابتة 13. نحن أيضا لاحظ الحد الأدنى من القدرة على الاستجابة للإجهاد الحراري المطبق إذا د. قد خلايا discoideum بلغت مرحلة ثابتة قبل التصوير. لذلك، والحفاظ على عدد الخلايا المستمر &lt;5 × 10 5 خلية / مل أمر بالغ الأهمية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن أعداد الخلايا عالية لحث على الانتقال من دورة الخضري من د. discoideum لدورة التنموية، مما اثار مسارات الموت جوعا، والتي قد تؤدي إلى استجابة مختلفة للإجهاد الحراري. إذا تم التوصل إلى أرقام الهواتف المحمولة عالية في مرحلة الانتعاش بعد الإجهاد الحراري، تدفق وخلايا تجميع يمكن أن تتداخل مع تحليل البيانات وتتحرك الخلايا من التركيز (انظر الشكل 4). محتوى &quot;&gt; الحد من تقنية فقدان التركيز هي عنق الزجاجة للبروتوكول. خلال التغيرات في درجات الحرارة، ويمكن للطائرة الوصل تحول جذري، الأمر الذي يتطلب إعادة تركيز اليدوي في فترة زمنية فورا بعد تغيير درجة الحرارة. القفزة في التركيز يمكن أن يكون أحيانا شديد جدا بحيث لا يمكن التغلب عليها عن طريق ضبط تلقائي للصورة البرنامج، وخاصة إذا كان الوقت بين نقاط الوقت مرتفع. ومع ذلك، إذا تم تجهيز المجهر استخدامها مع ضبط تلقائي للصورة الأجهزة، وهذا الاختناق يمكن التحايل عليها. أهمية تقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية بالمقارنة مع الاجهزة الموجودة مثل استخدام غرف مكيفة الهواء، وصناديق حضانة التحكم في درجة حرارته تغطي الأهداف والمسرح المجهر أو التحكم في درجة حرارته مراحل والياقات موضوعية، واستخدام غرفة التبريد يوفر تحكم أكثر دقة من المحيط درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن الحفاظ على تيم ثابت وموحدperature في جميع أنحاء الإعداد التجريبية. في الاجهزة الكلاسيكية، قد تؤدي الاختلافات في درجة الحرارة المحلية إلى نتائج المراقبة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن أن تستجيب بسرعة وبسرعة مع التغيرات التي يسببها في درجة الحرارة، في حين التكيف مع الاجهزة الكلاسيكية ببطء شديد لتغيرات درجة الحرارة التي يسببها، وخصوصا خفض درجة الحرارة. وبلتيير عنصر في غرفة التبريد يمكن أن تشمل أيضا مجموعة واسعة درجة حرارة (15-40 درجة مئوية) من الاجهزة الكلاسيكية، والتي تصل درجات الحرارة مثل 15 درجة مئوية أو 40 درجة مئوية أمر صعب للغاية. Dictyostelium discoideum حساسة بشكل خاص للصور سمية. الدراسات السابقة استخدمت أسكوربات كما زبال للحد من صور سمية. ومع ذلك، وفترات التصوير الطويلة تتطلب مكملات إضافية. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام أسكوربات يقتصر على الدراسات التي آلية الفائدة لا يتأثر الملحق المضادة للأكسدة. نقترح أن التصوير التي تسيطر عليها درجة الحرارة يمكن أن تستخدم بمثابة appr البديلoach للحد من صور سمية، ويمكن دمجه مع إضافة أسكوربات إلى مزيد من الانخفاض سمية. التأثيرات الضوئية يمكن التقليل من خلال توفير درجة حرارة ثابتة وموحدة من 23 درجة مئوية باستخدام غرفة التبريد. خلايا تصويرها باستخدام التحكم في درجة الحرارة تظهر علامات أقل من الصور سمية، هذا التقريب الخلية، لفترة زمنية أطول. هذا كما يسمح التصوير مع كثافة أعلى، فترات زمنية أصغر أو أكثر من حقول نظر (FOVs). التطبيق العام وقد تبين الإجهاد الحراري في ارتفاع درجات الحرارة ان تثير رد فعل الإجهاد الحراري المختلفة (14). لذلك، وزيادة درجة الحرارة إلى 34 درجة مئوية أو 37 درجة مئوية قد تحفز استجابة مختلفة. بالإضافة إلى الإجهاد الحراري المطبق، ومدة حالة الإجهاد معين يمكن تعديلها لدراسة الاستجابة الفورية أو التكيف على المدى الطويل للإجهاد الحراري. بشكل عام، لا يمكن للبروتوكول وصفها يكونوسعت إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. لأن التحكم في درجة الحرارة دقيقة يقلل إلى حد كبير الآثار الصورة السامة، وبروتوكول يمكن استخدامها في الأماكن التي تتطلب الأوقات عالية التعرض و / أو ارتفاع شدة الضوء الإثارة، على سبيل المثال، لتصور البروتينات مع مستوى التعبير منخفضة، أو بالاشتراك مع فترات زمنية قصيرة بين التصوير، على سبيل المثال، خلال الوقت الفاصل بين التصوير. كما يمكن أن يكون مفيدا لتصوير الأجسام التي تغطي الخلية بأكملها، على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة، كما تتطلب هذه الإعدادات على عدد كبير من البصرية ض أقسام.

Dictyostelium discoideum هم الانفرادي الاميبات المعيشة التربة التي تتغذى على البكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى، والتي يتم تناولها عن طريق البلعمة. لها دورة حياة فريدة ورائعة التي كانت مجالا رئيسيا للبحث منذ اكتشافه 1. الفائدة الأولى في التنمية متعددة الخلايا 2 و الأساس الجزيئي الكيميائي 3 استكمل قريبا من الدراسات التي تركز على الحركة الخلية القطبية خلية، مناعة فطرية. وبالإضافة إلى ذلك، D. وقدم discoideum كنظام نموذج ل4،5 البحوث الطبية الحيوية. في الآونة الأخيرة، أنشأنا د. discoideum كنظام جديد لدراسة نظام مراقبة الجودة 6،7 بروتين (PQC). وأثرى بروتيوم في مثل بريون البروتينات المعرضة للتجميع، الأمر الذي يشكل تحديا للبروتين مراقبة الجودة 8. للتحقيق في ما إذا كان د. وقد وضعت discoideum الآليات الجزيئية خاصة للسيطرة على درجة عالية AGالمعرضة للgregation بروتيوم، درسنا سلوك البروتينات علامة المعرضة للتجميع على حد سواء في ظل ظروف النمو الطبيعي وأثناء الإجهاد. ظروف الإجهاد، مثل الإجهاد الحراري، ويمكن استخدامها لزيادة نسبة البروتين misfolding 9. ولذلك، فإننا سعى نظام حيث أننا يمكن أن تحفز التغيرات في درجات الحرارة في وقت واحد اتباع سلوك البروتينات علامة. لهذا الغرض، ونحن الجمع بين التصوير الخلية الحية مع التدفئة تسيطر بلتيير-استخدام (غرفة التبريد) مرحلة الحراري إدراج. يسمح هذا الأسلوب لنا للحفاظ على درجة حرارة ثابتة وموحدة، وكذلك للحث على التغير في درجة الحرارة السريع، وبعد دقيقة و. يستخدم التصوير الخلية الحية لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية في د. discoideum. ومع ذلك، يواجه هذا النهج اثنين من القيود الرئيسية. أولا، تعرض الخلايا لحركية عالية وتميل إلى الهجرة خارج مجال الرؤية، وبالتالي تتبع الخلايا الفردية غالبا ما يتطلب التصوير في منطقة واسعة. تنقل الخلية يمكنيمكن خفضها من خلال تراكب آجار 10، ولكن هذه الظروف ليست مناسبة للتصوير على المدى الطويل بسبب انخفاض في قدرتها على البقاء. ثانيا، D. تظهر خلايا discoideum حساسية عالية بشكل خاص للصور سمية، مما يؤدي إلى التقريب الخلية واعتقال الإنقسامية 11. وتناولت البروتوكولات السابقة هذه المشكلة عن طريق إضافة أسكوربات على القضاء على الجذور والحد من التعرض مرة 12. هذا الأخير يمكن أن يكون حاسما إذا ما أعرب عن البروتين من الفائدة عند مستويات منخفضة ويظهر إشارة مضان ضعيفة. ويشير الكتاب أيضا إلى توفير درجة حرارة ثابتة من 21 درجة مئوية إما عن طريق التصوير في غرفة مكيفة الهواء أو باستخدام صناديق حضانة التحكم في درجة حرارته، والتي تغطي الهدف والمجهر المرحلة 12. هنا، نحن تصف طريقة مع تحسين التحكم في درجة الحرارة باستخدام غرفة التبريد وضعت في 23 درجة مئوية. أثناء التصوير لدينا مجموعة المتابعة تعزز بشكل كبير من المقاومة إلى الصورة سمية. هذايسمح استخدام التعرض مرات أعلى وأعلى كثافة الضوء الإثارة. هذا الأمر أهمية خاصة خلال الوقت الفاصل بين التصوير، كما تحتاج إلى فترات زمنية لتكون متوازنة بعناية ضد عدد من مواقع تصوير ووقت التعرض المستخدمة. إمكانية زيادة أعداد مواقف تصوير أيضا يسمح للتغطية منطقة التصوير أوسع ويسهل تتبع الخلايا الفردية على مدى فترة أطول من الزمن.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

بروتوكول التصوير وصفه يمكن استخدامها لتحليل سلوك البروتينات مثل بريون المعرضة للتجميع في الاميبا د. يظهر discoideum أثناء الإجهاد الحراري. الشكل 1 توزيع GFP الموسومة polyglutamine البروتين Q103 في الخلايا تحت ظروف النمو الطبيعية (الشكل 1A)، 2 بعد ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية (الشكل 1B) وبعد 6 ساعات من الانتعاش التوتر و النمو في ظروف النمو الطبيعية (الشكل 1C). على ارتفاع درجة الحرارة من 23 درجة مئوية إلى 30 درجة مئوية، وعلامة-Q103 GFP coalesces من توزيع منتشر إلى منقط الهياكل. بعد الإفراج الإجهاد والنمو في درجة الحرارة العادية، وهذه الهياكل تذوب. إعادة توزيع Q103-GFP وتشكيل الحرارة التي يسببها الإجهاد عصاري خلوي بؤر يمكن كميا باستخدام تحليل الصور. ويبين الشكل 2A تحليل FOVs الفردية باستخدام فيجي والمساعد &quot;Cالذراع مكافحة &quot;. ويبين الشكل 2B الكمي لاستجابة الإجهاد الحراري، وهذا يدل على أن عصاري خلوي Q103-GFP زيادة بؤر في عدد مع استمرار الإجهاد الحراري. وخلال الإجهاد الحراري، ومراقبة الجودة البروتين (PQC) النظام هو طغت، وبالتالي aggregation- البروتينات عرضة مثل البروتين Q103 مثل بريون لا يمكن الحفاظ في دولة قابلة للذوبان وعلى نحو متزايد مجموع المباراتين في بؤر عصاري خلوي. الخلايا تظهر أيضا التقريب مميزة، كما هو مبين في الشكل 1B، والحد من بؤر عصاري خلوي بعد إزالة التوتر تشير إلى أن مجمعة تذاب البروتينات. جودة التصوير حساسة لكثافة الخلايا الأولية. ويبين الشكل 3 مثال على الخلايا بعد التعافي من الإجهاد، مقارنة الكثافة المناسبة الأولية الخلية (الشكل 3A) وعالية الكثافة الخلية الأولية (الشكل 3B). إذا كانت كثافة الخلية الأولية مرتفعة جدا، نجم خلاياتيد لتشكيل تيارات كما هو مبين في الشكل 3B. وقد انتقل هذا الذي يفرض صعوبات على القياس الكمي لاحق كما هو الخلايا من البؤري. ويمكن استخدام الطريقة الموصوفة لرصد التغيرات التي يسببها درجة الحرارة كما هو موضح أعلاه. ويمكن أن تستخدم أيضا للحد من صور سمية عند التصوير في درجة حرارة النمو الفسيولوجية الشكل 4 يوضح مقارنة بين الخلايا المصورة في 23 درجة مئوية في تبريد الغرفة (الشكل 4A) والخلايا المصورة دون التحكم في درجة الحرارة في غرفة مكيفة الهواء، تعيين إلى 25 درجة مئوية (الشكل 4B). عند التعرض المستمر للضوء الإثارة، وخلايا تعتقل عندما لا تصويرها تحت ظروف التحكم في درجة حرارته. هذا التغيير في شكل الخلية تشير إلى الإجهاد. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> شكل 1: <s<html> ترونج&gt; بروتينات تشبه بريون المعرضة للتجميع تغير توزيع الخلوي أثناء الإجهاد الحراري. وأعرب-GFP الموسومة-polyglutamine الغنية هنتنغتين اكسون 1 (Q103) جوهري في AX2-214 د. خلايا discoideum (إشارة GFP يصور في مقلوب جدول البحث على نطاق والرمادي). (A) في ظل ظروف النمو الطبيعي عند 23 درجة مئوية، Q103-GFP يتم توزيع منتشرة في السيتوبلازم. (ب) بعد 2 ساعة من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية، Q103-GFP coalesces إلى بؤر عصاري خلوي (الأسهم الحمراء). تظهر الخلايا تغيير شكل مميز وتعتقل. (C) وعند الإفراج التوتر ونمو في 23 درجة مئوية، وحل بؤر عصاري خلوي. بعد 6 ساعات، أي بؤر عصاري خلوي يمكن ملاحظتها. شريط النطاق = 10 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الصفحة = &quot;1&quot;&gt; <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig2.jpg" /> الشكل 2: الكمي لتشكيل بؤر عصاري خلوي الناجم عن الحرارة (أ) تحليل الخلايا باستخدام حزمة لمعالجة الصور المجانية فيجي والمساعد &quot;خلية مكافحة&quot;. يتم تحديد المبلغ الكلي للخلايا (نوع 1، علامات مكافحة الزرقاء) في صورة حقل مشرق. يتم تحميل علامات في قناة GFP وعدد من الخلايا التي تحتوي على بؤر عصاري خلوي (نوع 2، علامات مكافحة الحمراء) يتم تحديد. (ب) الكمي بؤر بعد 3 ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية و 3 ساعات من الانتعاش الإجهاد في 23 ° C (ن = 4 حقول للعرض، خطأ بار = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> ز&gt; الشكل 3: تأثير كثافة الخلايا على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير (A) خلايا تصويرها في كثافة الخلايا الأولية &lt;10 5 خلية / مل. بعد 3 ساعات من الإجهاد الحراري في 30 درجة مئوية و 6 ساعات من الانتعاش الإجهاد في 23 درجة مئوية، والخلايا لا تزال في دورة الخضري والانقسام. فقط عدد قليل من خلايا خروج البؤري. (ب) خلايا تصويرها في كثافة الخلايا الأولية&gt; 10 6 خلية / مل. بعد 9 ساعة من التصوير (الإعدادات كما في A)، وقد دخل خلايا دورة التنموية وبدأ تدفق وتجميع. الخلايا في المجاميع لا يمكن تمييزها بوضوح. جزء كبير من الخلايا مخارج البؤري ولا يمكن تحليلها. شريط النطاق = 10 ميكرون. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <html> .jpg و&quot;/&gt; الشكل 4: تأثير التحكم في درجة الحرارة على التأثيرات الضوئية (A) خلايا تصويرها لمدة 10 دقيقة مع التحكم في درجة الحرارة عند 23 درجة مئوية: 6 حقول نظر، ض المكدس (المباعدة بين 0.5 ميكرومتر، عينة سماكة 8 ميكرومتر)، والفاصل الزمني (المجموع الوقت 10 دقيقة، انقضاء 1 دقيقة)، قناة GFP (0.07 مللي ثانية وقت التعرض، وكثافة الليزر 10٪)، قناة طلب تقديم العروض (0.1 مللي ثانية وقت التعرض، وكثافة الليزر 10٪). تظهر خلايا أي علامات التغيرات المورفولوجية المميزة المرتبطة بالإجهاد الضوئي السمي. (ب) خلايا تصويرها لمدة 10 دقيقة دون التحكم في درجة الحرارة (نفس الظروف كما هو الحال في A). خلايا يحمل علامات سمية ضيائية الناجم عن التقريب، مشيرا إلى الإجهاد. شريط النطاق = 10 ميكرون. تم تصوير الخلايا على نظام يقوم على المجهر مع الهدف 100X / 1.4 الفتحة العددية (NA). وقد تم جمع الصور مع كاميرا CCD كما 1024 س 1024 بكسل الملفات باستخدام 1 × 1 binning.4large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging at JoVE.com

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين<em&gt; D. discoideum</em&gt; عن طريق درجة الحرارة التي تسيطر التصوير الخلية الحية

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

7.0K Views.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Video: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genetics

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

تطبيق التصوير الخلوي المباشر والتصوير المقطعي بالتبريد الإلكترون لحل الميزات الزمنية للالفيلقية الهوائية Dot/Icm نظام إفراز

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Immunology and Infection

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في<em&gt; خميرة الخباز</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في ايليجانس كاينورهابديتيس

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D مجهرية الخميرة

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

دراسة الاتجار بالبروتين الغشائي في خلايا مستقبلات ذبابة الفاكهة باستخدام البروتينات الموسومة ب eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

دراسة نظام لمراقبة الجودة من البروتين

Summary

Explore More Videos

الهندسة الوراثية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "الخلايا استناداً إلى" التحديد والنمو في البكتيريا

تطبيق التصوير الخلوي المباشر والتصوير المقطعي بالتبريد الإلكترون لحل الميزات الزمنية للالفيلقية الهوائية Dot/Icm نظام إفراز

4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

فحوصات بالإضافة لرصد طوي ثانية بروتين في

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

الكشف عن "البروتين التعريب سوبسيلولار الأخضر Fluorescence علامات البروتين" و 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي تلطيخ في ايليجانس كاينورهابديتيس

4D مجهرية الخميرة

دراسة الاتجار بالبروتين الغشائي في خلايا مستقبلات ذبابة الفاكهة باستخدام البروتينات الموسومة ب eGFP