The authors have no Acknowledgements.

1. Zellpräparation <ol><li> Wachsende Zellen <ol><li> Wachsen D. discoideum Zellen in AX - Medium bei 23 ° C unter Licht in Gewebekulturplatten. Vermeiden Sie Zellen in hoher Dichte über 75% Konfluenz zu halten. Hinweis: Für eine optimale Reaktion auf Hitzestress, müssen Zellen in der exponentiellen Wachstumsphase zu sein und nicht die stationäre Phase erreicht haben sollte. </li><li> Am Tag vor der Bildgebung, aufgeteilt Zellen in niedrige Fluoreszenzmedium (LFM) bis 1 x 10 4 Zellen / ml. HINWEIS: Dieser Schritt ist notwendig, durch die AX Medium verursachte Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Die Inkubationszeit kann auf ein Minimum von 2 Stunden reduziert werden. Doch in AX-Medium aufgenommen Bläschen können noch einige Hintergrundsignal nach 2 h erzeugen. </li></ol></li><li> Vorbereitung Zellen für die Mikroskopie <ol><li> Vor Bildgebung, Ernten der Zellen aus dem Gewebeplatte in LFM und übertragen eine ausreichende Anzahl von Zellen in Glasbodenschalen. HINWEIS: In der Regel,1 x 10 5 Zellen / ml reicht; Wenn jedoch die Versuchsaufbau lange Abbildungsperioden (mehr als 8 h) erfordert, müssen die Zellzahlen sorgfältig eingestellt werden, wie D. discoideum Zellen werden dem Entwicklungszyklus übergehen und beginnen zu streamen und zu aggregieren , wenn die Zellzahlen hoch sind , während Nährstoffe niedrig sind. </li><li> Lassen Sie die Zellen für 20 min absetzen. Entfernen Sie nicht abgesetzten Zellen durch vorsichtiges das verwendete Medium durch frisches Medium ersetzt. </li></ol></li></ol> 2. Imaging HINWEIS: sowie in der konfokalen Mikroskopie-Setups Das Protokoll kann auf Weitfeld-Systemen verwendet werden. Die Verwendung eines temperaturgesteuerten Inkubation Box in denen die Ziele und den Mikroskoptisch ist hilfreich, aber nicht unbedingt notwendig für die Temperaturregelung. Die Temperatur der Inkubation Kasten wird auf die höchste Temperatur in dem Experiment verwendet gesetzt, beispielsweise auf 40 ° C , wenn Wärmespannung durchgeführt wird. Andernfalls wird die Temperatur auf 25 eingestellt6; C. Temperaturänderungen sollten im Voraus erfolgen, damit das System anzupassen, wie Veränderungen in der Temperatur während der Abbildung des Fokus beeinflussen können. HINWEIS: Während der Bilderzeugung wird die Temperatur gesteuert, um eine Kühlkammer verwendet wird. Die Standardtemperatur für die Bildgebung nicht gestressten Zellen beträgt 23 ° C. Für die Wärmebelastungsbedingungen wird die Temperatur entsprechend auf das gewünschte Niveau erhöht. Das Piezoelement in der Kühlkammer kann sehr schnell auf die Temperaturverschiebung reagieren. Allerdings wird der Fokus der Bilder leicht ändern (es auf bis zu 20 &amp; mgr; m in Abhängigkeit von der Temperaturverschiebung kann abweichen). Somit manuelle Refokussierung wird innerhalb der ersten Minuten der Bildaufnahme erforderlich ist, es sei denn, das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist. <ol><li> Bildaufnahme unter unbelasteten Bedingungen <ol><li> Bildzellen unter unbelasteten Bedingungen bei 23 ° C, mindestens 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben. HINWEIS: Nicht-Spannungszustand kann visualized entweder durch eine kurze Time-Lapse (5-30 min) oder dem Erwerb von repräsentativen Standbilder aufnehmen. Für jede Bedingung oder Zelllinie ein Minimum von 6 Sichtfelder (FOVs) erwerben. HINWEIS: Sollten einzelne Zellen von Interesse sind, positionieren Sie die entsprechenden Zellen in der Mitte des FOV und eine 3 x 3 Fliesenserie mit dem FOV notieren Sie die Zellen von Interesse in der Mitte enthält , D.. discoideum Zellen sind frei beweglich und kann aus dem FOV migrieren. Jedoch erhöht die 3 x 3 Fliesenserie den Bereich möglicherweise durch die Zelle von Interesse untersucht und es bleibt nachvollziehbar für Zeitraffer-Perioden von ~ 6 Stunden. </li><li> Erwerben z-Stapel von höchstens 7 &amp; mgr; m in 1 bis 0,25 &amp; mgr; m vor, um das gesamte Volumen der Zelle zu erfassen. </li><li> Erwerben Bild eines Referenzhellfeld die Gesamtzahl der Zellen zu beurteilen. </li></ol></li><li> Bildaufnahme für Hitzestress <ol><li> Die Temperatur der Kühlkammer auf 30 ° C gemäß den Anweisungen des Herstellers. &lt;/ Li&gt; <li> Nachdem die Temperaturanzeige den gewünschten Wert ein, neu auszurichten manuell im Hellfeldkanal und überprüfen Sie alle aufgezeichneten FOVs vor dem Start des Zeitraffer erreicht hat. </li><li> Starten Sie eine Zeitraffer 4 Stunden von Hitzestress mit einem Zeitintervall von 5-10 Minuten zwischen den Zeitpunkten. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung der ersten beiden Zeitpunkte zu konzentrieren. </li></ol></li><li> Bildaufnahme während der Wiederherstellung <ol><li> Nach dem Hitzestress zu reduzieren für die Temperaturanzeige auf 23 ° C, warten, bis die Temperatur wieder manuell anzupassen und neu auszurichten. </li><li> Nehmen Sie Zeitrafferfilme in der Erholungsphase für 8-10 Stunden in 10-20 Minuten Zeitintervallen. Überprüfen Sie die korrekte während der Erfassung des ersten Zeitpunkt zu konzentrieren. </li></ol></li></ol> 3. Bildanalyse ANMERKUNG: Um die Anzahl der Zellen beherbergen cytosolischen Foci, Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci in jedem Zeit quantifizierenRahmen. Aufgrund der Schwierigkeit von Zellen aus Hellfeld- Bilder Segmentieren, muss die Quantifizierung manuell durchgeführt werden. Im Folgenden wird die Datenanalyse für die freie Bildverarbeitungspaket beschrieben ((http://fiji.sc/Fiji). Es erfordert das Plugin &quot;Zellzähler&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol><li> Beurteilung der Gesamtzahl der Zellen <ol><li> Legen Sie das Hellfeld-Bildstapel (XYT), indem Sie auf &quot;Datei&quot; und &quot;Öffnen&quot;. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Zellzähler&quot; Plugin ( &quot;Plugins&quot; - &quot;Zellzähler&quot;). Laden Sie das Bild Stapel von &quot;initialisieren&quot; klicken. </li><li> Wählen Sie die geeignete Art von Zählern durch Ankreuzen des entsprechenden Kästchens. Hinweis: Verwenden Sie Typ 1 als Zähler für die Gesamtzahl der Zellen und Typ 2 als Zähler für Zellen, die mit zytosolischen Brennpunkte. Zählen Sie alle Zellen. </li><li> Speichern Sie die Markierungen, indem Sie auf &quot;Save Markers&quot;. </li></ol></li><li> Die Beurteilung der Anzahl der Zellen mit zytosolischen Brennpunkte <ol> &lt;li&gt; Legen Sie das Fluoreszenzbild Hyperstack (XZYT) ( &quot;Datei&quot; - &quot;Open&quot;) und eine maximale Intensitätsprojektion der &quot;Z-Projector&quot; (Bild / Stacks) mit machen. </li><li> Öffnen Sie die &quot;Zellzähler&quot; Plugin. Legen Sie das resultierende Bildstapel (XYT), indem Sie auf &quot;initialisieren&quot;. </li><li> Legen Sie die Markierungen, indem Sie auf &quot;Load Marker&quot;. ACHTUNG: Die Dateinamen des Referenzbildes und der Fluoreszenz-Stack müssen identisch sein. Benennen Sie gegebenenfalls entsprechend vor dem Bildstapel initialisiert. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Marker-Typ (siehe 3.1.3) und Zellen mit zytosolischen Brennpunkten zählen. Die bestehenden Marker können als Richtlinien für die Lage einzelner Zellen verwendet werden. </li><li> Rufen Sie die Anzahl der Zählungen pro Scheibe durch einen Klick auf &quot;Ergebnisse&quot; und die Zählungen an anderer Stelle für weitere Berechnungen zu speichern. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Das hier beschriebene Protokoll kann das Verhalten eines bestimmten Proteins von Interesse in Reaktion auf die wärmeinduzierten Belastungen Studie verwendet werden. Temperaturerhöhung auf 30 ° C wurde berichtet Wärmebelastungsantwort auszulösen , und unter diesen Bedingungen die Lebensfähigkeit von D. discoideum ist deutlich reduziert. Änderungen Das Protokoll kann modifiziert werden, um das Verhalten verschiedener Proteine ​​unter den gleichen Belastungsbedingungen zu vergleichen. Dazu verschiedene Proteine ​​mit dem gleichen Fluoreszenzmarker exprimierenden Zellen werden in Multi-Well-Platten transferiert, wie vier Kammerschalen (Abschnitt 1.3.1). Das Protokoll kann auch auf Zellen co-exprimierenden Proteine ​​mit verschiedenen Markern, wie GFP oder RFP angewendet werden. Dies kann beispielsweise verwendet, um das Verhalten verschiedener Komponenten der Proteinqualitätskontrolle (PQC) System überwachen. Zellen, die GFP-markierten Aggregation Marker und andere RFP-markierte PCQ Komponenten exprimieren, können unter Verwendung von Multi-Well beobachtet werdenKlöpper für die Bildgebung. Dies gewährleistet den gleichen Belastungsbedingungen (Geschwindigkeit der Temperaturzunahme / abnahme, der Dauer der Temperaturerhöhung / Verringerung) und ermöglicht eine vergleichende Studien. Darüber hinaus kann das Protokoll verwendet werden, um den Einfluss des PQC System auf der Wärmebelastungsantwort zu untersuchen. Die Aktivität der Komponenten kann durch Ändern Expressionsniveaus unter Verwendung von genetischen Werkzeugen wie knock-out oder Überexpression oder durch Verwendung von handelsüblichen spezifische Inhibitoren 6 moduliert werden. Das Proteasom kann durch Zugabe von MG132 (100 uM) oder Lactacystin (10 uM) zu dem Wachstumsmedium inhibiert werden. Das Chaperon Hsp90 kann verhindert werden, indem Geldanamycin (6 uM) oder Radicicol (10 &amp; mgr; M). Das Chaperon Hsp70 kann mit VER-155088 gehemmt werden, obwohl wir nicht die Wirksamkeit der Hemmung in unserer experimentellen Einstellungen bestätigen konnten bisher. Inhibitoren sollten 14 Stunden einen Tag vor der Bildgebung und die Zellen werden inkubiert werden. Criti<html> cal Schritte im Rahmen des Protokolls Der entscheidende Schritt für die Beurteilung der wärmeinduzierte Störung ist der Zustand der Zellen vor dem Bildgebungsexperiment. Studien in Hefe zeigten , dass Zellen Resistenz gegen eine Vielzahl von Umwelteinflüssen während der stationären Phase 13 erwerben. Wir beobachteten auch minimale Reaktion auf angelegte Wärme Stress , wenn D. discoideum Zellen hatten stationäre Phase erreicht vor der Bildgebung. Um daher eine konstante Zellzahl aufrechterhalten &lt;5 x 10 5 Zellen / ml ist kritisch. Darüber hinaus können hohe Zellzahlen Übergang vom vegetativen Zyklus von D. induzieren discoideum auf den Entwicklungszyklus, so auslösenden Verhungern Wege, die zu einer anderen Antwort führen könnte Stress zu erwärmen. Bei hohen Zellzahlen in der Erholungsphase nach der Hitzebelastung erreicht werden, Streaming und Aggregation - Zellen können mit der Datenanalyse stören , da die Zellen aus dem Fokus zu bewegen (siehe Abbildung 4). Inhalt &quot;&gt; Einschränkung der Technik Der Verlust des Fokus ist der Engpass des Protokolls. Bei Temperaturänderungen kann die Brennebene drastisch Verschiebung, die in einer Zeitperiode manuelle Refokussierung erfordert unmittelbar nach der Änderung der Temperatur. Der Sprung in der Fokus kann manchmal zu extrem sein durch Software Autofokus zu überwinden, insbesondere, wenn die Zeit zwischen den Zeitpunkten hoch ist. Wenn jedoch das verwendete Mikroskop mit einem Hardware-Autofokus ausgestattet ist, kann dieser Engpass umgangen werden. Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende Methoden Im Vergleich zu bestehenden Aufbauten wie beispielsweise die Verwendung von klimatisierten Räumen, temperaturgesteuerte Inkubation Kästen in denen die Ziele und die Mikroskoptisch oder temperaturgesteuerten Bühnen und objektive Krägen stellt die Verwendung einer Kühlkammer, die eine genauere Steuerung der Umgebungs Temperatur. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann eine konstante und gleichmäßige tem aufrechtzuerhaltenperatur während des gesamten Versuchsaufbau. In der klassischen Setups können lokale Temperaturunterschiede zu unterschiedlichen Beobachtungs Ergebnissen führen. Darüber hinaus kann es schnell und rasch auf induzierte Änderungen in der Temperatur reagieren, während klassische Setups sehr langsam induzierte Temperaturänderungen anzupassen, insbesondere um die Temperatur zu senken. Das Peltier-Element in der Kühlkammer kann auch einen breiteren Temperaturbereich (15-40 ° C) als die klassischen Konfigurationen umfassen, mit dem Erreichen Temperaturen, wie 15 ° C oder 40 ° C ist sehr schwierig. Dictyostelium discoideum ist besonders empfindlich gegenüber Phototoxizität. Frühere Studien Ascorbat als Fänger verwendet Phototoxizität zu reduzieren. Jedoch erfordern lange Bildgebungszeiten zusätzliche Ergänzung. Außerdem wird die Verwendung von Ascorbat auf Studien beschränkt, in dem der Mechanismus von Interesse nicht durch die Antioxidansergänzung beeinflusst wird. Wir schlagen vor, dass temperaturgesteuerte Bildgebung kann alternativ ca. verwendet werdenoach Phototoxizität zu minimieren und könnte unter Zugabe von Ascorbat kombiniert werden, um die Toxizität zu verringern. Phototoxische Effekte können durch die Bereitstellung einer konstanten und gleichförmigen Temperatur von 23 ° C unter Verwendung einer Kühlkammer minimiert werden. Die Zellen mit Temperaturkontrolle abgebildet zeigen weniger Anzeichen von Phototoxizität, wie Zellabrundung, für einen längeren Zeitraum. Dies ermöglicht auch Bildgebung mit höheren Intensitäten, kleinere Zeitintervalle oder mehr Sichtfelder (FOVs). Allgemeine Anwendung Hitzestress bei höheren Temperaturen wurde eine unterschiedliche Wärmestressantwort 14 auszulösen gezeigt. Daher könnte eine andere Antwort induzieren, die Temperatur auf 34 ° C oder 37 ° C erhöht. Neben der Temperaturbelastung angelegt wird, kann die Dauer eines bestimmten Belastungssituation modifiziert werden, um die unmittelbare Reaktion oder langfristige Anpassung an Stress studieren zu beheizen. In der Regel kann das beschriebene Protokoll seinauf ein breites Spektrum von Anwendungen erweitert. Da die präzise Temperaturregelung erheblich phototoxische Effekte reduziert, kann das Protokoll in den Einstellungen verwendet werden , die eine hohe Belichtungszeiten erfordern und / oder höhere Anregungslichtintensitäten, beispielsweise für Proteine mit einem niedrigen Expressionsniveau zu visualisieren, oder in Kombination mit kurzen Zeitintervallen zwischen Bildgebung, zum Beispiel während Zeitraffer-Bildgebung. Es kann auch für die Abbildung der gesamten Zelle, zB Mikrotubuli, da diese Einstellungen erfordern eine hohe Anzahl von optischen z-Abschnitte Spanning Objekte vorteilhaft sein.

Dictyostelium discoideum sind Einzelgänger Boden lebenden Amöben , die auf Bakterien und anderen Mikroorganismen ernähren, die durch Phagozytose aufgenommen werden. Es hat eine einzigartige und bemerkenswerte Lebenszyklus , die einen großen Bereich der Forschung seit seiner Entdeckung 1 gewesen ist. Das frühe Interesse an der vielzelligen Entwicklung 2 und die molekularen Grundlagen der Chemotaxis 3 wurde bald durch Studien ergänzt mit Schwerpunkt auf der Zellbeweglichkeit, Zellpolarität, angeborene Immunität. Zusätzlich D. discoideum wurde als Modellsystem für die biomedizinische Forschung 4,5 eingeführt. Vor kurzem haben wir D. discoideum als ein neues System , das Protein Qualitätskontrolle (PQC) System 6,7 zu studieren. Seine Proteom ist in aggregationsanfälligen Prion-ähnliche Proteine angereichert, die 8 eine Herausforderung für die Proteinqualitätskontrolle darstellt. Um zu untersuchen , ob D. discoideum hat spezielle molekulare Mechanismen entwickelt , seine zur Steuerung hoch aggregation anfällige Proteom, untersuchten wir das Verhalten der Aggregation neigende Proteine ​​Marker sowohl unter normalen Wachstumsbedingungen und bei Stress. Stressbedingungen, wie Wärmebeanspruchung kann die Rate der Protein misfolding 9 zu erhöhen verwendet werden. Deshalb haben wir versucht, ein System, wo wir Temperaturänderungen auslösen können und gleichzeitig das Verhalten von Markerproteinen folgen. Zu diesem Zweck kombiniert, wir Abbildung lebender Zellen mit Peltier-gesteuerte Erwärmung eine thermische Stufe Einsatz (Kühlkammer) verwendet wird. Diese Methode erlaubt uns eine konstante und gleichmäßige Temperatur sowie zur Aufrechterhaltung einer schnellen, aber dennoch präzise Temperaturänderung zu induzieren. Bildgebung lebender Zellen verwendet , um eine Vielzahl von biologischen Prozessen in D. zu studieren discoideum. Allerdings steht dieser Ansatz zwei wichtige Einschränkungen. Zunächst werden die Zellen, die eine hohe Beweglichkeit anzuzeigen und neigen aus dem Sichtfeld zu wandern, wodurch einzelne Zellen verfolgen, erfordert oft Bildgebung einer großen Fläche. Die Mobilitätszelle kannvon Agar - Overlay 10 jedoch verringert werden, sind diese Bedingungen für langfristige Bildgebung aufgrund einer Abnahme der Lebensfähigkeit nicht geeignet. Zweitens D. discoideum Zellen zeigen eine besonders hohe Empfindlichkeit gegenüber Phototoxizität, die 11 in Zellabrundung und mitotischen Arrest führt. Vorherige Protokolle adressiert dieses Problem durch Zugabe von Ascorbat als Radikalfänger und Reduzierung der Belichtungszeiten 12. Letzteres kann kritisch sein, wenn das Protein von Interesse auf einem niedrigen Niveau exprimiert wird, und zeigt ein schwaches Fluoreszenzsignal. Die Autoren schlagen auch vor, entweder durch Abbilden in einem klimatisierten Raum oder durch Verwendung von temperaturgesteuerte Inkubation Kästen, um eine konstante Temperatur von 21 ° C zu schaffen , die das Ziel und den Mikroskoptisch 12 abzudecken. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit verbesserter Temperatursteuerung durch eine Kühlkammer unter Verwendung von auf 23 ° C eingestellt. Während der Abbildung unserer Set-up eine deutliche Steigerung der Beständigkeit gegen Phototoxizität. Eserlaubt die Verwendung von höheren Belichtungszeiten und höhere Anregungslichtintensitäten. Dies ist von besonderer Bedeutung während des Zeitraffer-Bildgebung, da die Zeitintervalle sorgfältig ausgewogen gegen die Anzahl der Positionen abgebildet werden müssen und der Belichtungszeit verwendet. Die Möglichkeit, die Anzahl der abgebildeten Positionen zu erhöhen, ermöglicht auch die Abdeckung eines breiten Abbildungsbereich und erleichtert die Verfolgung einzelner Zellen über einen längeren Zeitraum.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Das beschriebene Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden , um das Verhalten von aggregationsanfällig prion-ähnliche Proteine in der Amöbe D. Analyse discoideum während der Hitzestress. 1 zeigt die Verteilung von GFP-markiertem Polyglutamin - Protein - Q103 in Zellen , die unter normalen Wachstumsbedingungen (1A), nach 2 Stunden Wärmebelastung bei 30 ° C (1B) und nach 6 Stunden Stress Wiederherstellungs- und Wachstum bei normalen Wachstumsbedingungen (Abbildung 1C). Bei Temperaturerhöhung von 23 ° C bis 30 ° C, die Q103-GFP Marker verschmilzt aus einer diffusen Verteilung Strukturen punktiert. Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei normaler Temperatur, lösen sich diese Strukturen. Die Umverteilung von Q103-GFP und die Bildung von Hitzestress induzierten cytosolischen Herde können Bildanalyse quantifiziert werden. 2A zeigt die Analyse einzelner FOVs mit Fiji und das Plugin &quot;Cell Zähler &quot;. 2B zeigt die Quantifizierung der Wärmestressantwort. Dies zeigt , dass die cytosolische Q103-GFP Brennpunkte Erhöhung der Zahl mit fortHitzeStress. Während Hitzestress, die Proteinqualitätskontrolle (PQC) System ist überwältigt, so Aggregations- neigen Proteine wie das Prion-like protein Q103 kann nicht in einem löslichen Zustand und zunehmend Aggregat in zytosolischen Foci aufrechterhalten werden. die Zellen auch eine charakteristische Rundungs zeigen, wie in 1B. die Reduktion der cytosolischen Foci nach Stress Entfernung dargestellt legt nahe , dass die aggregierte Proteine ​​werden gelöst. Die Abbildungsqualität ist empfindlich gegenüber der anfänglichen Zelldichte, Fig . 3 zeigt ein Beispiel für Zellen nach der Belastungswiederherstellung geeigneten Anfangszelldichte (3A) und eine hohe Anfangszelldichte (3B) zu vergleichen. Wenn die anfängliche Zelldichte zu hoch war, Sternzellented Ströme zu bilden , wie in 3b dargestellt. Diese, die Schwierigkeiten bei der nachfolgenden Quantifizierung wie die Zellen auferlegt sind aus der Brennebene bewegt. Das beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um temperaturbedingte Veränderungen zu überwachen, wie oben beschrieben. Es kann auch zu reduzieren Phototoxizität verwendet werden , wenn bei einem physiologischen Wachstumstemperatur Bildgebung. Abbildung 4 zeigt einen Vergleich der Zelle bei 23 ° C in einer Kühlkammer (4A) abgebildet und ohne Temperaturregelung in einem klimatisierten Raum abgebildeten Zellen, Set auf 25 ° C (4B). Bei konstanten Kontakt mit dem Anregungslicht runden Zellen, wenn sie nicht unter temperierten Bedingungen abgebildet. Diese Änderung in der Zellform anzeigt Stress. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> Abbildung 1: <strong&gt; Aggregation neigende Prion-ähnliche Proteine verändern ihre zelluläre Verteilung während der Hitzestress. GFP-markierten polyglutamine reichen Huntingtin Exon 1 (Q103) konstitutiv in AX2-214 D. ausgedrückt discoideum Zellen (GFP - Signal in invertierten Graustufen - Nachschlagtabelle dargestellt). (A) Unter normalen Wachstumsbedingungen bei 23 ° C, Q103-GFP diffus im Cytoplasma verteilt. (B) Nach 2 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C, Q103-GFP verschmilzt in zytosolischen Brennpunkte (rote Pfeile). Die Zellen zeigen eine charakteristische Formänderung und abrunden. (C) Nach dem Stressabbau und das Wachstum bei 23 ° C werden die cytosolische Brennpunkte gelöst. Nach 6 Stunden, kann keine cytosolische Foci beobachtet werden. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 2: Quantifizierung der thermisch induzierten cytosolischen Foci - Bildung (A) Analyse von Zellen , die das freie Bildverarbeitungspaket Fiji und das Plugin &quot;Zellzähler&quot; verwendet wird .. Die Gesamtmenge an Zellen (Typ 1, blau Zähler Marker) in der Hellfeldbild bestimmt. Die Marker werden in der GFP-Kanal und die Anzahl der Zellen mit cytosolischen Foci (Typ 2, rot Zähler Marker) geladen wird bestimmt. (B) Quantifizierung der Brennpunkte nach 3 h Wärmebelastung bei 30 ° C und 3 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C (n = 4 Sichtfelder, Fehlerbalken = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version davon zu sehen Zahl.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; Abbildung 3: Einfluss der Zelldichte auf Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten &lt;10 5 Zellen / ml abgebildet Langzeit Zeitraffer-Bildgebung (A).. Nach 3 Stunden von Hitzestress bei 30 ° C und 6 Stunden von Stress Erholung bei 23 ° C, bleiben immer noch Zellen im vegetativen Zyklus und dividieren. Nur wenige Zellen, die die Brennebene verlassen. (B) Zellen , die bei anfänglichen Zelldichten&gt; 10 6 Zellen / ml abgebildet. Nach 9 h Bildgebung (Einstellungen wie in A), haben Zellen, die den Entwicklungszyklus eingegeben und gestartet Streaming und aggregiert werden. Zellen in den Aggregaten nicht eindeutig unterschieden werden kann. Ein großer Teil der Zellen tritt aus der Brennebene und nicht analysiert werden kann. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; Abb . 4: Einfluss der Temperaturregelung auf phototoxische Effekte (A) Zellen abgebildet für 10 min mit Temperaturkontrolle bei 23 ° C: 6 Sichtfelder, z-Stapel (Abstand 0,5 uM, Probendicke 8 uM), Zeitraffer (Gesamt Zeit 10 min, Ablauf 1 min), GFP-Kanal (0,07 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität), RFP-Kanal (0,1 ms Belichtungszeit, 10% Laserintensität). Die Zellen zeigen keine Anzeichen der charakteristischen morphologischen Veränderungen mit phototoxischen Stress verbunden. (B) Zellen für 10 min ohne Temperatursteuerung (gleiche Bedingungen wie in A) abgebildet. Die Zellen Anzeichen einer phototoxischen induzierten Rundung aufweisen, Stress anzeigt. Maßstabsbalken = 10 &amp; mgr; m. Die Zellen wurden auf einem System abgebildet basierend auf einem Mikroskop mit einem 100x / 1,4 numerische Apertur (NA) Ziel. Die Bilder wurden mit einer CCD-Kamera als 1.024 x 1.024 Pixel-Dateien unter Verwendung von 1 x 1 Binning gesammelt.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der<em&gt; D. discoideum</em&gt; Verwendung von Temperaturgesteuerte Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.9K Aufrufe.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Serie: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

Gentechnische Veränderung von Dictyostelium Discoideum Zellen basierend auf Auswahl und das Wachstum von Bakterien

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Forschung

Genetik

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Anwendung von Live Cell Imaging und Cryo-Electron Tomography zur Auflösung der raumzeitlichen Merkmale des Legionella pneumophila Dot/Icm Sekretionssystems

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Immunologie und Infektion

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Biologie

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D-Mikroskopie der Hefe

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Die Untersuchung der Proteinqualitätskontrolle System der

Zusammenfassung

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Gekoppelt Assays zur Überwachung Proteinrückfaltung in

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Mikroskopie von Fission Yeast Sexual Lifecycle

Bewertung von Dictyostelium Discoideum Reaktion auf akute mechanische Stimulation

Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans

4D-Mikroskopie der Hefe

Untersuchung des Membranproteintransports in Drosophila-Photorezeptorzellen unter Verwendung von eGFP-markierten Proteinen