The authors have no Acknowledgements.

1.細胞の調製<ol><li> 成長する細胞 <ol><li> D.を育てます組織培養プレート中の光下に23℃でAX培地中discoideumの細胞。 75％の密集度以上の高い密度で細胞を維持することは避けてください。 注：最適な応答はストレスを加熱するために、細胞が指数増殖期にあることが必要と定常期に達していてはいけません。 </li><li>撮影前日、1×10 4細胞/ mlに低い蛍光媒体（LFM）に分割細胞。 注：このステップは、AX媒体に起因するバックグラウンド蛍光を低減する必要があります。インキュベーション時間は、2時間を最小限に抑えることができます。しかし、AX媒体に取り小胞は、依然として2時間後にいくつかのバックグラウンドシグナルを生成することができます。 </li></ol></li><li> 顕微鏡用細胞を準備 <ol><li>撮影前に、LFMにおける組織プレートから収穫細胞とは、ガラス底皿に細胞の十分な数を転送します。 注：通常、1×10 5細胞/ mlで十分です。実験は、（8時間以上）、長い撮像期間を必要とする場合は、細胞数を慎重D.として、調整する必要がありますdiscoideumの細胞が発達サイクルに移行し、栄養素が低い一方で細胞数が高い場合にストリーミングと集計を開始します。 </li><li>細胞は、20分間沈降することを可能にします。慎重に新鮮な培地で使用した培地を交換することにより、非定住細胞を除去します。 </li></ol></li></ol> 2.イメージング注意：このプロトコルは広視野システムに同様に共焦点顕微鏡のセットアップに使用することができます。目的をカバーする温度制御インキュベーションボックスと顕微鏡ステージの使用は人、まだ温度制御のために必須ではありません。熱応力が行われた場合、インキュベーションボックスの温度を40℃に、 例えば 、実験に使用される最高温度に設定されます。そうでなければ、温度は25に設定されています6; C。温度変化は、撮像時の温度の変化が焦点に影響を与えることができるように、システムが適応できるようにするために事前になされるべきです。 注記：画像化の間、温度は冷却室を使用して制御されます。非ストレス細胞を画像化するための初期温度は23℃です。熱ストレス条件下では、温度を所望のレベルに応じて増加します。冷却室でピエゾ素子は、温度変化に非常に迅速に対応することができます。しかし、画像の焦点は、（それが温度変化に応じて、最大で20μmであることが逸脱する可能性が）わずかに変化します。使用顕微鏡は、ハードウェアのオートフォーカスが装備されていない限り、このようにマニュアルリフォーカスは、画像取得の最初の数分以内に必要とされます。 <ol><li> 非ストレス条件下での画像取得 <ol><li> 23℃での非ストレス条件下での画像セルは、ビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。 注：非ストレス条件はvisualizすることができます短い時間経過（5月30日分）又は代表静止画の取得を記録することにより、いずれかのエド。各条件または細胞株の場合はビューの6分野（のFOV）の最小値を取得します。 注：個々の細胞が関心がある場合には、FOVの中央に各セルを配置し、中央に目的の細胞を含むFOVと3×3のタイルのシリーズを記録D.。 discoideumの細胞は運動性であり、FOVの外に移動することがあります。しかし、3×3のタイルシリーズは、潜在的に、目的の細胞によって探求面積を増加させ、それは〜6時間の時間経過期間の追跡可能のまま。 </li><li>セルの全体積をキャプチャするために1から0.25ミクロンのステップで最大7ミクロンのzスタックを取得します。 </li><li>細胞の総数を評価するための基準明視野像を取得します。 </li></ol></li><li> 熱ストレスのための画像取得 <ol><li>製造者の指示に従って30℃まで冷却室の温度を調整します。&lt;/李&gt; <li>温度表示が所望の値に達した後、明視野チャンネルに手動で再集束し、時間経過を開始する前に、すべての記録のFOVをご確認ください。 </li><li>時点間の5〜10分の時間間隔で熱ストレスの4時間の時間経過を開始します。最初の2つの時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。 </li></ol></li><li> 回復中の画像取得 <ol><li>熱ストレスの後、戻って23℃まで温度を下げ、調整して、手動で再び焦点を合わせるために温度表示を待ちます。 </li><li> 10-20分の時間間隔で8-10時間の回復期に記録しタイムラプスムービー。最初の時点の取得中に焦点を当て、正しいかどうかを確認します。 </li></ol></li></ol> 3.画像解析注：細胞質の病巣を保有する細胞の数を定量化するためには、各時間における細胞の総数および細胞質病巣を有する細胞の数を評価しますフレーム。明視野画像から細胞を分割することの難しさを、定量化を手動で実行する必要があります。以下では、データ分析は、フリーの画像処理パッケージ（（http://fiji.sc/Fiji）について記載されている。それは、「セルカウンター」（http://fiji.sc/Cell_Counter）プラグインが必要です。 <ol><li> 細胞の総数を評価 <ol><li> 「ファイル」と「開く」をクリックすることにより、明視野画像スタック（XYT）をロードします。 </li><li> 「セルカウンター」プラグイン（ - &quot;セルカウンター」「プラグイン」）を開きます。 「初期化」をクリックすることで、画像スタックをロードします。 </li><li>適切なボックスを刻むことにより、カウンタの適切なタイプを選択します。 注：全細胞の数および細胞質病巣を有する細胞のためのカウンタとしてタイプ2用のカウンタとして使用するタイプ1。すべてのセルを数えます。 </li><li> 「保存マーカー」をクリックしてマーカーを保存します。 </li></ol></li><li> 細胞質の病巣を有する細胞の数を評価します <ol> &lt;LI&gt;蛍光画像hyperstack（XZYT）（「ファイル」 - 「開く」）をロードし、「Z-プロジェクター」（画像/スタック）を使用して、最大値投影を行います。 </li><li> 「セルカウンター」プラグインを開きます。 「初期化」をクリックすることにより、得られた画像スタック（XYT）をロードします。 </li><li> 「ロード・マーカー」をクリックしてマーカーをロードします。 注意：参照画像と蛍光スタックのファイル名が同一である必要があります。必要に応じて、画像スタックを初期化する前にそれに応じて変更します。 </li><li>適切なマーカーの種類を選択します（3.1.3を参照）および細胞質病巣で細胞を数えます。既存のマーカーは個々の細胞の位置のためのガイダンスとして使用することができます。 </li><li> 「結果」をクリックすることで、スライスあたりのカウント数を取得し、さらに計算のために他の場所でカウントを保存します。 </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここで説明するプロトコルは、熱誘発ストレスに応答して、目的の特定のタンパク質の挙動を研究するために使用することができます。 30°DのCは、熱ストレス応答を誘発することが報告されており、これらの条件下で生存能力の温度上昇discoideumのが著しく低減されます。 修正 プロトコルは、同じストレス条件下で異なるタンパク質の挙動を比較するために修飾することができます。このため、同一の蛍光タグを有する異なるタンパク質を発現する細胞は、四室皿（セクション1.3.1）のように、マルチウェルディッシュに移します。プロトコルはまた、GFPまたはRFPなどの異なるマーカーを有するタンパク質を同時発現する細胞に適用することができます。これは、タンパク質の品質管理（PQC）システムのさまざまなコンポーネントの動作を監視するために使用される例であることができます。 GFPタグ付き凝集マーカーおよび異なるRFPタグPCQ成分を発現する細胞は、マルチウエルを用いて観察することができイメージングのために皿。これは、同じストレス条件（温度上昇/低下の速度、温度上昇/低下の持続時間）を保証し、比較研究が可能になります。 また、プロトコルは、熱ストレス応答のPQCシステムの影響を研究するために使用することができます。成分の活性は、ノックアウトまたは過剰発現などの遺伝子ツールを使用して、発現レベルを変化させることによって、または市販の特異的阻害剤6を使用することによって調節することができます。プロテアソームは、増殖培地にMG132（100μM）またはラクタシスチン（10μM）を添加することにより抑制することができます。シャペロンHsp90は、ゲルダナマイシン（6μM）またはラディシコール（10μM）を用いて阻害することができます。我々はこれまでの我々の実験設定で、阻害の有効性を確認することができませんでしたが、シャペロンHsp70が、VER-155088に抑制することができます。阻害剤は、イメージングの前に一日を追加する必要があり、細胞を14時間インキュベートします。 Criti<html>プロトコル内のCALのステップ 熱による摂動を評価するための重要なステップは、イメージング実験に先立って、細胞の状態です。酵母での研究は、細胞が定常期13の間に環境ストレスの様々な耐性を獲得することを示しました。 D.あれば我々はまた、かかる熱応力を最小限の応答性を観察しましたdiscoideumの細胞は、イメージング前に定常期に達しました。したがって、一定の細胞数&lt;5×10 5細胞/ mlを維持することが重要です。 また、高い細胞数はDの栄養サイクルからの移行を誘導することができますこのようにストレスを加熱するために異なる応答につながるかもしれない飢餓経路を、トリガ、発達サイクルにdiscoideumの 。高い細胞数は、熱ストレス、ストリーミング後の回復期に到達すると、細胞が焦点から外れるように凝集細胞は、データ分析を妨害し得る場合（ 図4参照）。 コンテンツ &quot;&gt;テクニックの制限 焦点の損失は、プロトコルのボトルネックです。温度変化の間、焦点面はすぐに温度を変更した後の時間の手動再収束を必要とする、大幅に移行することができます。焦点のジャンプは時々時点間の時間が長い場合は特に、ソフトウェアのオートフォーカスにより克服することにはあまりにも極端なことができます。使用される顕微鏡は、ハードウェアオートフォーカスが装備されている場合は、このボトルネックを回避することができます。 既存の方法に関して技術の意義 このような目標や顕微鏡ステージや温度制御ステージと客観襟をカバーするエアコン付きの客室、温度制御インキュベーションボックスの使用など、既存のセットアップと比較して、冷却室の使用は、周囲のより正確な制御を提供します温度。冷却室でのペルチェ素子は、一定かつ均一テムを維持することができます実験を通してたは温度。古典的なセットアップでは、局所的な温度差は、異なる観測成果につながる可能性があります。古典的なセットアップは、特に温度を下げ、誘導された温度変化に非常にゆっくりと適応しながら、また、それは、温度誘導性の変化に迅速かつ迅速に対応することができます。冷却室でペルチェ素子はまた、15℃または40℃のような温度に到達すると、古典的なセットアップよりも広い温度範囲（15〜40°C）を覆うことができることは非常に困難です。 細胞性粘菌は、光毒性に特に敏感です。以前の研究では、光毒性を低減するために捕捉剤としてアスコルビン酸を使用します。しかし、長い撮影期間は追加の補充を必要とします。また、アスコルビン酸の使用が関心のメカニズムは抗酸化サプリメントの影響を受けていない研究に限定されています。我々は、温度制御されたイメージング代替APPRとして使用できることを提案しますoachは、光毒性を最小限にし、さらに、毒性を減少させるために、アスコルビン酸の添加と組み合わせることができます。 光毒性効果は、冷却室を使用して23℃の一定かつ均一な温度を提供することによって最小限に抑えることができます。温度制御を使用して画像化する細胞は、より長い期間のための光毒性は、そのような細胞の丸みの少ない徴候を示します。これはまた、より高い強度、より小さな時間間隔またはビュー（FOVの）の複数のフィールドでイメージングを可能にします。 一般的適用 高温での熱応力は、異なる熱ストレス応答14を誘発することが示されています。従って、34℃又は37℃に温度を上げると、異なる応答を誘導する可能性があります。適用温度ストレスに加えて、特定のストレス状態の持続時間は、応力を加熱するため、即時応答または長期適応を研究するために修飾することができます。 一般に、記載されたプロトコルをすることができますアプリケーションの広いセットに拡大しました。正確な温度制御がかなり光毒性効果を減少するため、プロトコルは、高い露光時間および/またはより高い励起光強度を必要とする設定などで、低い発現レベルでタンパク質を可視化するために、または短い時間間隔と組み合わせて使用することができますタイムラプスイメージングの間、 例えば 、イメージングの間。これらの設定は、光のzセクションの多数を必要とすることも、セル全体にわたるイメージング・オブジェクト、 例えば 、微小管のために有利であり得ます。

細胞性粘菌食作用によって取り込まれる細菌や他の微生物を餌孤独な土壌生活アメーバ、です。それは、その発見以来、1研究の主要な分野となっているユニークで顕著なライフサイクルを有します。多細胞の開発2および走化性3の分子基盤の初期の関心はすぐに細胞運動、細胞極性、先天性免疫に焦点を当てた研究によって補完されました。また、D. discoideumのは、生物医学研究の4,5のためのモデルシステムとして導入されました。 最近、我々はDを設立しましたdiscoideumのタンパク質品質管理（PQC）システム6,7を研究するための新たなシステムとして。そのプロテオームは、タンパク質品質管理8への課題となって凝集しやすいプリオン様タンパク質、に富んでいます。 D.かどうかを調べるために、 discoideumのは、その高度AGを制御するために、特別な分子機構を開発しましたgregationが発生しやすいプロテオーム、我々は通常の成長条件の下で、ストレス時の両方で凝集しやすいマーカータンパク質の挙動を研究しました。このような熱応力等の応力条件は、タンパク質ミスフォールディング9の速度を増加させるために使用することができます。したがって、我々は、温度変化を誘導し、同時にマーカータンパク質の挙動をたどることができ、システムを探していました。この目的のために、我々は、熱ステージインサート（冷却室）を用いてペルチェ制御加熱生細胞イメージングを組み合わせました。この方法では、我々は、一定で均一な温度を維持するだけでなく、迅速な、まだ正確な温度変化を誘発させました。 生細胞イメージングはDの生物学的プロセスの多様な研究するために使用されますdiscoideumの 。しかしながら、このアプローチは、2つの主要な制約に直面しています。最初に、細胞は、このように個々の細胞の追跡は、多くの場合、大面積の画像化を必要とする、高い運動性を表示し、視野の外に移動する傾向があります。セルの移動することができます寒天オーバーレイ10によって減少させることが、しかしながら、これらの条件は、生存率の減少に起因する長期的イメージングのために適していません。第二に、D. discoideumの細胞は、細胞の丸めと有糸分裂停止11その結果フォト毒性、特に高い感度を示します。前のプロトコルは、ラジカルスカベンジャーと露光時間12の減少としてアスコルビン酸を添加することによって、この問題を取り上げました。関心対象のタンパク質を低レベルで発現され、弱い蛍光信号を示している場合、後者は重要であることができます。著者らはまた、エアコン付きの部屋で撮影したり、客観的かつ顕微鏡ステージ12をカバーする温度制御インキュベーションボックスを使用してのいずれか21℃の一定温度を提供することを示唆しています。 ここでは、23℃に設定した冷却チャンバを使用することにより改善された温度制御を備えた方法を記載しています。大幅に私たちのセットアップを撮像中に光毒性に対する耐性を向上させます。それより高い露光時間およびより高い励起光強度の使用を可能にします。時間間隔は、撮像された位置の数および使用される露光時間に対して慎重にバランスをとる必要があり、これは、タイムラプス撮影中に特に重要です。画像形成された位置の数を増加させる可能性も広い撮像領域のカバレッジを可能にし、より長い期間にわたって個々の細胞の追跡を容易にします。

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

記載の撮像プロトコルは、アメーバD.で凝集しやすいプリオン様タンパク質の挙動を分析するために使用することができます熱ストレス中discoideumの 。 図1は、30℃（ 図1B）での熱ストレスの2時間後ストレス回復の6時間後に、通常の増殖条件（ 図1A）の下での細胞中のGFPタグ付きポリグルタミンタンパクQ103の分布を示して通常の成長条件（ 図1C）での成長。 30℃〜23℃の温度上昇時には、Q103-GFPマーカーは、点状構造に拡散分布から合体します。常温で応力解放と成長すると、これらの構造が溶解します。 Q103-GFPの再分配および熱ストレスによって誘導される細胞質ゾル病巣の形成は、画像解析を用いて定量することができる。 図2Aは、フィジー、プラグイン「Cを使用して、個々のFOVの分析を示しますエルカウンター」。 図2Bは、熱ストレス応答の定量化を示す。これは継続的な熱ストレスとの数の細胞質ゾルQ103-GFP病巣の増加が。熱ストレス時には、タンパク質の品質管理（PQC）システムは、このようにaggregation-、圧倒されていることを示していますこのようなプリオン様タンパク質Q103としてやすいタンパク質がサイトゾル病巣ますます集合溶解状態に維持することができない。細胞はまた、特徴的な丸めを示し、 図1Bに示すように、応力除去後のサイトゾル病巣の減少は、凝集していることを示唆していますタンパク質が溶解されています。 結像品質は、最初の細胞密度に敏感である。 図3は、適切な初期細胞密度（ 図3A）と高い初期細胞密度（ 図3B）を比較して、ストレス回復後の細胞の一例を示しています。初期細胞密度が高すぎる場合、細胞の星テッド図3bに示すようにストリームを形成します。細胞などのその後の定量化に困難を課しているこれは、焦点面の外に移動しました。 記載された方法は、上述したように温度による変化を監視するために使用することができます。生理的な成長温度で撮影。 図4は、空調室内の温度制御なしで撮像された冷却室（ 図4A）で、23℃で撮像された細胞の比較および細胞を示しているときにセット、光毒性を低減するためにも使用することができます25°C（ 図4B）へ。励起光に対する一定の曝露の際に、細胞は、温度制御された条件下で撮像されていないときに切り上げます。細胞の形状の変化は、ストレスを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> 図1： <strong&gt;凝集しやすいプリオン様タンパク質は、熱ストレスの間にそれらの細胞分布を変更します。GFPタグ付きポリグルタミンが豊富なハンチンチンエクソン1（Q103）が恒常AX2-214 D.で表現されていますdiscoideumの細胞（反転グレースケールルックアップテーブルに示されたGFPシグナル）。 （A）は 23℃で通常の増殖条件下で、Q103-GFPは、拡散細胞質に分布しています。 （B）30℃での熱ストレスの2時間後、Q103-GFPは細胞質ゾル病巣（赤い矢印）に合体します。細胞は特徴的な形状変化を示し、切り上げます。 23℃での応力解放及び成長時（C）は 、サイトゾル病巣が溶解します。 6時間後、何のサイトゾル病巣は観察されないことができます。スケールバー=10μmである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図2： 熱誘導サイトゾル病巣形成の定量無料の画像処理パッケージフィジーとプラグインの「セルカウンター」を使用して、細胞の（A）の分析。細胞（1型、ブルーカウンターマーカー）の合計量は、明視野画像において決定されます。マーカーは、GFPチャネルにロードされ、細胞質のフォーカス（タイプ2、赤カウンタマーカー）を有する細胞の数が決定されます。 （B）30℃での熱ストレスの3時間および23℃での応力回復の3時間（N =ビュー、エラーバー= SDの4分野）後病巣の定量。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">このの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。図。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html>グラム&gt;図3： 長期的タイムラプスイメージング上の細胞密度の影響初期細胞密度&lt;10 5細胞/ mlで撮像された（A）細胞。 30℃での熱ストレスの3時間および23℃でのストレス回復の6時間後、細胞はまだ栄養サイクルと分裂に残ります。ごく少数の細胞が焦点面を終了します。 （B）細胞は、初期細胞密度&gt; 10 6細胞/ mlで画像化しました。イメージング（Aのように設定）の9時間後、細胞は、発達サイクルに入り、ストリーミングと集約開始しました。凝集体中の細胞を明確に区別することはできません。細胞の大部分は、焦点面から出て、分析することができません。スケールバー=10μmである。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <html> .JPG &quot;/&gt; 図4： 光毒性効果に対する温度制御の効果 23℃の温度制御で10分間撮像された（A）細胞：6視野、zスタック（0.5μM間隔、試料の厚さ8μM）、時間経過（総時間10分経過し1分）、GFPチャンネル（0.07ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）、RFPチャネル（0.1ミリ秒の露光時間、10％のレーザ強度）。細胞は光毒性ストレスに関連する特徴的な形態学的変化の兆候を示しません。温度制御せずに10分間画像形成された（B）細胞（Aと同じ条件）。細胞はストレスを示す、光毒性誘発される丸めの兆候を示します。 =10μmのスケールバー。細胞は、100×/ 1.4の開口数（NA）を目的とした顕微鏡に基づいて、システム上で画像化しました。画像は、1×1ビニングを用いて1,024×1024ピクセルファイルとしてCCDカメラを用いて収集しました。4large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

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Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.9K ビュー.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

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Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

キイロタマホコリカビの選択に基づいて細胞と細菌の成長の遺伝子工学

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

遺伝学

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

免疫・感染学

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

生物学

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

のリフォールディング監視タンパク質を結合アッセイ<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

分裂酵母セクシャルライフサイクルの顕微鏡観察

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

酵母の4D顕微鏡検査

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

eGFPタグ付きタンパク質を用いた ショウジョウバエ 光受容体細胞における膜タンパク質トラフィッキングの研究

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

タンパク質の品質管理システムを学びます

要約

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キイロタマホコリカビ急性の機械的刺激に対する応答の評価

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