The authors have no Acknowledgements.

1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי גידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול ד תאים discoideum במדיום AX ב 23 ° C תחת אור בצלחות בתרבית רקמה. אל תשאיר את התאים בצפיפויות גבוהות מעל 75% confluency. הערה: לקבלת מענה מיטבי לחום מתח, תאים צריך להיות בשלב הצמיחה המעריכית וצריך לא הגיעו בשלב נייח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני ההדמיה, תאים התפצלו בינוני קרינה נמוך (LFM) 1 x 10 4 תאים / מיליליטר. הערה: שלב זה הוא הכרחי כדי להפחית קרינת רקע הנגרם על ידי מדיום AX. זמן הדגירה יכול להיות מופחת למינימום של 2 שעות. עם זאת, שלפוחית ​​נלקחה במדיום AX עדיין יכולה ליצור כמה אות רקע לאחר 2 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי הכנות לקראת מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, תאי קציר מהצלחת רקמות LFM ולהעביר מספר מספיק של תאים לתוך מנות תחתיות זכוכית. הערה: בדרך כלל,1 x 10 5 תאים / המ&quot;ל מספיק; עם זאת, אם הגדרת הניסוי דורשת תקופות הדמיה ארוכות (יותר מ -8 שעות), מספרים סלולריים צריכים להיות מותאמים בקפידה, כמו ד תאי discoideum יעברו לעבוד מעגל ההתפתחות ולהתחיל להזרים המצרפי אם מספרים סלולריים הם גבוהים בעוד מזינים נמוכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים להסתפק 20 דקות. הסרת תאים שאינם התיישבו בזהירות על ידי החלפה הבינונית בשימוש עם מדיום חדש. </li></ol></li></ol> הדמיה 2. הערה: הפרוטוקול יכול לשמש במערכות רחב בתחום כמו גם setups מיקרוסקופיה confocal. שימוש תיבת דגירת בקרת טמפרטורה מכסה את היעדים ואת במת מיקרוסקופ הוא מועיל, עדיין לא חיוני בקרת טמפרטורה. הטמפרטורה של תיבת הדגירה מוגדרת הטמפרטורה הגבוהה ביותר השתמשה בניסוי, למשל, ל -40 מעלות צלזיוס אם עומס חום מתבצע. אחרת, את הטמפרטורה מוגדרת 256; C. שינויי טמפרטורה צריכות להתבצע מראש על מנת לאפשר למערכת להסתגל, כמו שינויי הטמפרטורה במהלך ההדמיה יכולים להשפיע על המוקד. הערה: במהלך הדמיה, הטמפרטורה נשלטת באמצעות תא קירור. טמפרטורת ברירת המחדל עבור הדמית תאים שאינם הדגיש היא 23 מעלות צלזיוס. תנאי עומס חום, הטמפרטורה גדלה בהתאם לרמה הרצויה. אלמנט פייזו בתא הקירור יכול להגיב מהר מאוד אל משמרת הטמפרטורה. עם זאת, ההתמקדות של התמונות תשתנה במקצת (זה יכול לסטות עד 20 מיקרומטר בהתאם במשמרת הטמפרטורה). לפיכך refocusing הידנית נדרשת בתוך הדקות הראשונות של רכישת תמונה, אלא אם מיקרוסקופ המשמש מצויד עם דגש אוטומטי חומרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת רכישה בתנאים שאינם הדגישו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי תמונה בתנאים שאינם הדגיש ב 23 ° C, לרכוש מינימום של 6 שדות מבט (FOVs). הערה: מצב ללא מתח יכול להיות visualizאד או על ידי הקלטת זמן לשגות קצר (5-30 דקות) או רכישת סטילס נציג. עבור כל קו תנאי או תא לרכוש מינימום של 6 שדות מבט (FOVs). הערה: במקרה תאים בודדים הם בעלי עניין, למקם את התאים המתאימים באמצע FOV ולהקליט סדרת אריח 3 x 3 עם FOV המכיל את התאים של עניין באמצע ד. תאי discoideum הם ניע ועלולים להעביר מתוך FOV. עם זאת, סדרת האריח 3 x 3 מגדילה את השטח בחן באופן פוטנציאלי על ידי התא של עניין והוא נשאר למעקב לתקופות זמן לשגות של ~ 6 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת Z- ערימות של 7 מיקרומטר מקסימלית 1-0.25 מיקרומטר צעדים כדי ללכוד את כל נפח התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונה בשדה בהיר התייחסות להעריך את המספר הכולל של תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת רכישה עבור עומס חום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את הטמפרטורה של חדר הקירור עד 30 מעלות צלזיוס על פי הוראות היצרן. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תצוגת הטמפרטורה הגיעה לערך הרצוי, ולמקד ידני בערוץ השדה הבהיר ולבדוק כל FOVs שנרשם לפני תחילת הזמן לשגות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל זמן לשגות עבור 4 שעות של עומס חום עם מרווח זמן של 5-10 דקות בין נקודות זמן. בדוק אם נכונה התמקדות במהלך רכישת שתי נקודות בפעם הראשונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת רכישה במהלך התאוששות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר עומס החום, להפחית את הטמפרטורה בחזרה ל -23 מעלות צלזיוס, ולחכות תצוגת טמפרטורה להתאים ולמקד באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיא זמן לשגות סרטים ב שלב ההחלמה במשך 8-10 שעות ב 10-20 במרווחים דקות זמן. בדקו אם נכונו התמקדות במהלך הרכישה של הנקודה לראשונה. </li></ol></li></ol> ניתוח תמונה 3. הערה: כדי לכמת את מספר תאי מחסה מוקדי cytosolic, להעריך את המספר הכולל של תאים ואת מספר התאים עם מוקדי cytosolic בכל זמןמִסגֶרֶת. בשל הקושי של פילוח תאים מתמונות שדה בהירים, כימות צריכות להתבצע באופן ידני. בחלק הבא, ניתוח נתונים מתואר עבור חבילת עיבוד תמונה חינם ((http://fiji.sc/Fiji). זה דורש את הפלאגין &quot;מונה תא&quot; (http://fiji.sc/Cell_Counter). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת מספר כולל של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ערימת תמונה בשדה הבהירה (XYT) על ידי לחיצה על &quot;קובץ&quot; ו &quot;פתח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוסף &quot;תא מונה&quot; ( &quot;תוספים&quot; - &quot;מונה תא&quot;). טען את ערימת תמונה על ידי לחיצה על &quot;אתחול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הסוג המתאים של מונים על ידי סימון התיבה המתאימה. הערה: שימוש מסוג 1 כמו דלפק עבור מספר כולל של תאים מסוג 2 כמו דלפק עבור תאים עם מוקדי cytosolic. לספור את כל התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסמנים על ידי לחיצה על &quot;שמור סמנים&quot;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת מספר התאים עם מוקדי cytosolic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; טען את hyperstack תמונה הקרינה (XZYT) ( &quot;קובץ&quot; - &quot;פתח&quot;) ולעשות הקרנת העוצמה המקסימלית באמצעות &quot;Z-מקרן&quot; (תמונה / ערימות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התוסף &quot;תא המונה&quot;. טען את ערימת התמונה המתקבלת (XYT) על ידי לחיצה על &quot;אתחול&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הסמנים על ידי לחיצה על &quot;מרקרים טען&quot;. זהירות: שמות הקבצים של תמונת התייחסות ערימת הקרינה חייבים להיות זהים. במידת הצורך, לשנות בהתאם לפני אתחול מחסנית התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג הסמן המתאים (ראה 3.1.3) ולספור תאים עם מוקדי cytosolic. הסמנים קיימים יכולים לשמש הדרכה לתפקיד של תאים בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחזר את מספר ספירות לכל פרוסה על ידי לחיצה על &quot;תוצאות&quot; ולשמור את הספירה במקום אחרת לחישובים נוספים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+Formation+of+Cell+Aggregates+by+Chemotaxis+in+the+Development+of+the+Slime+Mold+Dictyostelium+Discoideum.">Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum.</a> Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).</li><li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+during+development+of+Dictyostelium.">Cell signaling during development of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).</li><li>Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+a+model+organism:+progress+with+Dictyostelium.">Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium.</a> Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).</li><li>Williams, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+finds+new+roles+to+model.">Dictyostelium finds new roles to model.</a> Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).</li><li>M&#252;ller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+system+-+substantial+share:+The+use+of+Dictyostelium+in+cell+biology+and+molecular+medicine.">Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine.</a> European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).</li><li>Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dictyostelium+discoideum+has+a+highly+Q/N-rich+proteome+and+shows+an+unusual+resilience+to+protein+aggregation.">Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).</li><li>Malinovska, L., Alberti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+misfolding+in+Dictyostelium:+Using+a+freak+of+nature+to+gain+insight+into+a+universal+problem.">Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem.</a> Prion. 9 (5), 339-346 (2015).</li><li>Schneider, K., Bertolotti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surviving+protein+quality+control+catastrophes+-+from+cells+to+organisms.">Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms.</a> Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).</li><li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+misfolding.">Protein folding and misfolding.</a> Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).</li><li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-overlay+immunofluorescence:+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis.">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).</li><li>Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+spinning+disk+microscopy.">Live cell spinning disk microscopy.</a> Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).</li><li>Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Cell-Imaging+Techniques+for+Analyses+of+Microtubules+in+Dictyostelium.">Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium.</a> Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).</li><li>Herman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+phase+in+yeast.">Stationary phase in yeast.</a> Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).</li><li>Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+response+of+Dictyostelium.">Heat shock response of Dictyostelium.</a> Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות של חלבון מסוים של ריבית בתגובה ללחץ חום נגרם. העלאת הטמפרטורה ל -30 מעלות צלזיוס דווחה כדי לעורר תגובה חום מתח בתנאים אלה את הכדאיות של ד discoideum מצטמצם במידה ניכרת. שינויים הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להשוות את ההתנהגות של חלבונים שונים באותם תנאי המתח. לשם כך, תאי מבטאי חלבונים שונים עם התג פלורסנט באותו מועברים לתוך מנות רבות גם, כגון ארבע מנות קאמריות (סעיף 1.3.1). הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על תאי שיתוף לבטא חלבונים עם סמנים שונים, כגון GFP או RFP. זה יכול להיות למשל להשתמש כדי לפקח על התנהגותם של מרכיבים שונים של בקרת איכות חלבון (PQC) המערכת. תאים להביע את סמן צבירה מתויג GFP ורכיבי PCQ RFP-tagged שונים ניתן לצפות באמצעות היטב רביםהשביע הדמיה. הדבר מבטיח אותם תנאי המתח (מהירות העלאת טמפרטורה / ירידה, משכו זמן ירידת טמפרטורת גידול /) ומאפשר מחקרים השוואתיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מערכת PQC על תגובת עומס חום. הפעילות של הרכיבים יכולה להיות מווסתת על ידי שינוי רמות ביטוי באמצעות כלים גנטיים כגון נוק-אאוט או ביטוי יתר או באמצעות מעכבים ספציפיים זמינים מסחרי 6. הפרוטאזום יכול להיות מעוכב על ידי הוספת MG132 (100 מיקרומטר) או lactacystin (10 מיקרומטר) אל מדיום הגידול. המלווה Hsp90 יכול להיות מעוכבים באמצעות geldanamycin (6 מיקרומטר) או radicicol (10 מיקרומטר). המלווה Hsp70 יכול להיות מעוכב עם VER-155,088, למרות שאנחנו לא יכולים לאשר את היעילות של העיכוב במסגרות הניסיוניות שלנו עד כה. מעכבים יש להוסיף יום אחד לפני הדמית התאים וטופחו במשך 14 שעות. Criti<html> צעדי cal בתוך הפרוטוקול השלב הקריטי להערכת הפרעות החומות נגרם הוא המדינה של התאים לפני ניסוי ההדמיה. מחקרים הראו כי תאי שמרים לרכוש עמידות מגוון של לחצים סביבתיים בשלב נייח 13. אנו הבחנו גם היענות מינימלית עומס החום מיושם אם ד תאי discoideum הגיעו שלב נייח לפני ההדמיה. לכן, שמירה על מספר תא קבוע &lt;5 x 10 5 תאים / מיליליטר הוא קריטי. יתר על כן, מספרים סלולריים גבוהים יכולים לגרום מעבר מהמעגל וגטטיבי של ד Discoideum למעגל התפתחותית, ובכך מפעיל מסלולים רעבים, אשר עלול להוביל לתגובה שונה לחום מתח. אם מספרים סלולריים גבוהים מתקבלים שלב ההחלמה לאחר עומס חום, הזרמה ותאי צבירה יכולים להפריע ניתוח נתונים שעליהם בנויי התאים לנוע מחוץ לפוקוס (ראה איור 4). תוכן &quot;&gt; הגבלת הטכניקה ההפסד של המוקד הוא צוואר הבקבוק של הפרוטוקול. במהלך שינויי טמפרטורה, במישור המוקד יכול להעביר באופן דרסטי, המחייב refocusing ידני פרק זמן מיד לאחר לשינוי הטמפרטורה. הקפצתי את הפוקוס לפעמים יכול להיות קיצוני מדי בכדי להתגבר עליהם על ידי פוקוס אוטומטי תוכנה, במיוחד אם הזמן בין נקודות הזמן הוא גבוה. עם זאת, אם מיקרוסקופ המשמש מצויד פוקוס אוטומטי חומרה, צוואר הבקבוק הזה ניתן לעקוף. משמעות של הטכניקה ביחס שיטות קיימות לשם השוואה עם setups קיים כגון השימוש של חדרים ממוזגים, תיבות דגירת בקרת טמפרטורה מכסות את היעדים ואת הבמה מיקרוסקופ או בשלבי בקרת טמפרטורה וצווארוני מטרה, השימוש בתא קירור מספק שליטה מדויקת יותר של הסביבה טֶמפֶּרָטוּרָה. פלטייה האלמנט בתא הקירור יכול לשמור על TEM קבוע והאחידperature ברחבי ההתקנה הניסיונית. ב setups הקלסית, הבדלי טמפרטורה מקומיים עשויים להוביל לתוצאות תצפית שונות. יתר על כן, הוא יכול להגיב במהירות במהירות לשינויים מושרים הטמפרטורה, בעוד setups הקלסית להסתגל לאט מאוד לשינויי טמפרטורה מושרות, במיוחד הורדת הטמפרטורה. פלטייה אלמנט בתא הקירור יכול גם לכסות טווח טמפרטורה רחב יותר (15-40 מעלות צלזיוס) מ setups הקלאסית, שבה הטמפרטורות להגיע כמו 15 מעלות צלזיוס או 40 ° C הוא מאוד קשה. Discoideum Dictyostelium הוא רגיש במיוחד רעילות צילום. מחקרים קודמים השתמשו ascorbate כמו נבלות להפחית רעילות צילום. עם זאת, תקופות הדמיה ארוכות דורשות תוספת נוספת. יתר על כן, השימוש ascorbate מוגבל ללימודים בהן מנגנון הריבית אינו מושפע תוסף נוגד חמצון. אנו מציעים כי הדמיה שבשליטת הטמפרטורה יכולה לשמש חלופה apprאוח למזער רעילות תמונה וניתן לשלבו עם תוספת של ascorbate להפחית רעילות נוספת. תופעות phototoxic ניתן למזער על ידי מתן טמפרטורה קבועה ואחידה של 23 ° C באמצעות תא קירור. תאים הדמיה באמצעות בקרת טמפרטורה להראות פחות סימנים של רעילות צילום, עיגול תא כזה, במשך פרק זמן ארוך יותר. זה גם מאפשר הדמיה עם עוצמות גבוהות, מרווחי זמן קטנים יותר או יותר שדות נוף (FOVs). יישום כללי עומס חום בטמפרטורות גבוהות הוכח לעורר תגובת לחץ חום שונה 14. לכן, הגדלת הטמפרטורה ל 34 מעלות צלזיוס או 37 ° C עלולה לגרום תגובה שונה. בנוסף לחץ הטמפרטורה מיושם, משך מצב מתח מסוים יכול להיות שונה כדי לחקור את התגובה המיידית או הסתגלות לטווח ארוך לחום מתח. באופן כללי, הפרוטוקול המתואר יכול להיותהתרחב מערך רחב של יישומים. מאחר בקרת הטמפרטורה המדויקת מפחיתה באופן משמעותי אפקטים לתמונה רעילה, הפרוטוקול ניתן להשתמש במסגרות הדורשות זמני חשיפה גבוהים ו / או עוצמות אור עירור גבוהות, למשל, המאפשרים הדמית חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה, או בשילוב עם מרווחי זמן קצרים בין הדמיה, למשל, במהלך ההדמיה זמן לשגות. זה גם יכול להיות יתרון עבור הדמיה חפצה פורש התא כולו, למשל, microtubules, כמו הגדרות אלה דורשים מספר גבוה של z-חלקים אופטיים.

Discoideum Dictyostelium הם אמבות בודדות חיים בקרקע הניזונים חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים, אשר נתפסים על ידי phagocytosis. יש לה מחזור חיים ייחודי מדהים כי כבר שטח גדול של מחקר מאז גילויו 1. הריבית בשלב המוקדמת של התפתחות רבה-תאית 2 ואת הבסיס המולקולרי של chemotaxis 3 הושלמה בקרוב על ידי מחקרי התמקדות תנועתיות תא, קוטביות בתא, חסינות מולדת. בנוסף, ד discoideum הוצג כמערכת מודל 4,5 המחקר הביו-רפואי. לאחרונה, הקמנו ד discoideum כמערכת חדשה ללמוד את בקרת איכות חלבון (PQC) 6,7 המערכת. Proteome שלה הוא מועשר בחלבוני צבירה נוטה כמו-פריון, אשר מציב אתגר בפני בקרת איכות חלבון 8. כדי לחקור האם ד discoideum פתחה מנגנונים מולקולריים מיוחדים לשלוט AG ביותר שלהgregation נוטה proteome חקרנו את ההתנהגות של חלבוני סמן נוטה צבירה הוא בתנאי צמיחה נורמלים במהלך מתח. בתנאי עקה, כגון עומס החום, שניתן להשתמש בהם כדי להגביר את קצב חלבון misfolding 9. לכן, חיפשנו מערכת שבה נוכל לגרום שינויי טמפרטורה ובמקביל לעקוב אחר ההתנהגות של חלבונים סמן. לשם כך, אנו בשילוב הדמית תא חי עם חימום מבוקר פלטייה באמצעות כנס במה תרמי (תא קירור). שיטה זו אפשרה לנו לשמור על טמפרטורה קבועה ואחידה וכן לגרום לשינוי טמפרטורה מהיר, עדיין מדויק. הדמית תא חי משמשת ללמוד מגוון של תהליכים ביולוגיים ד discoideum. עם זאת, גישה זו עומדת בפני שתי מגבלות עיקריות. ראשית, התאים להציג תנועתיות גבוהה נוטים להגר אל מחוץ לשדה הראייה, ובכך המעקב של תאים בודדים לעתים קרובות דורש הדמיה של שטח גדול. ניידות התא יכוללהיות מופחת על ידי כיסוי 10 אגרו, עם זאת, תנאים אלה אינם מתאימים הדמיה לטווח ארוכה בשל ירידה כדאיות. שנית, ד תאי discoideum להראות רגישות גבוהה במיוחד רעילות צילום, שתוצאתה עיגול תא מעצר mitotic 11. פרוטוקולים קודמים לטפל בבעיה זו על ידי תוספת של ascorbate כמחסל רדיקלי וצמצום חשיפה פעמים 12. האחרון יכול להיות קריטי אם החלבון של העניין מתבטא ברמות נמוכות ומראה אות קרינה חלשה. המחברים גם מציעים לספק טמפרטורה קבועה של 21 מעלות צלזיוס או על ידי הדמיה בחדר ממוזג או באמצעות תיבות דגירת בקרת טמפרטורה, אשר מכסות את הבמה האובייקטיבית מיקרוסקופ 12. כאן, אנו מתארים שיטה עם בקרת טמפרטורה משופרת באמצעות תא קירור נקבע על 23 מעלות צלזיוס. במהלך הדמית ההגדרה שלנו משפר באופן משמעותי את ההתנגדות רעילה צילום. זהמאפשר את השימוש של פעמי חשיפה גבוהות ועוצמות אור עירור גבוהות. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת במהלך ההדמיה זמן לשגות, כפי מרווחי הזמן צריך להיות מאוזן בקפידה מול מספר המשרות צילמו את זמן החשיפה לשמש. האפשרות להגדיל את מספר משרות צלמו גם מאפשרת כיסוי של אזור הדמיה רחב יותר ומקל מעקב של תאים בודדים על פני תקופה ארוכה של זמן.

<table><tbody><tr><td>AX Medium</td><td>ForMedium</td><td>AXM0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo medium</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>MG132</td><td>Sigma</td><td>C2211</td><td></td></tr><tr><td>Lactacystin</td><td>Sigma</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Geldanamycin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200617</td><td></td></tr><tr><td>Radicicol</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-200620</td><td></td></tr><tr><td>MatTek disch 35 mm</td><td>MatTek corporation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>glass bottom imaging dish</td></tr><tr><td>CellViell cell culture dish</td><td>Greiner</td><td>627870</td><td>4-compartment glass-bottom imaging dish</td></tr><tr><td>Thermal Stage Heater/Cooler Insert</td><td>Warner Istruments</td><td>TB-3/CCD</td><td></td></tr><tr><td>Bipolar temperature controller</td><td>Warner Istruments</td><td>CL-100</td><td></td></tr><tr><td>Liquid cooling System</td><td>Warner Instruments</td><td>LCS-1</td><td></td></tr></tbody></table>

studying the protein quality control system of d. discoideum using temperature-controlled live cell imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

פרוטוקול ההדמיה המתואר יכול לשמש כדי לנתח את ההתנהגות של חלבוני צבירה נוטה כמו-פריון ב האמבה ד discoideum במהלך עומס חום. איור 1 מציג את התפלגות Q103 חלבון polyglutamine-tagged GFP בתאים בתנאי צמיחה נורמלים (איור 1 א), אחרי 2 שעות של עומס חום על 30 מעלות צלזיוס (איור 1B) ואחרי 6 שעות של התאוששות מתח צמיחה בתנאי צמיחה נורמלית (איור 1 ג). עם עליית טמפרטורה מ -23 ° C עד 30 ° C, סמן GFP-Q103 מתמזג מתוך הפצה מפוזרת כדי punctate מבנים. עם שחרורו וצמיחת לחץ בטמפרטורה רגילה, מבנים אלה לפזר. חלוקים מחדש של Q103-GFP ההיווצרות של מוקדי cytosolic חום הנגרמת מתח ניתן לכמת באמצעות ניתוח תמונה. איור 2 א מראה את ניתוח FOVs הבודד באמצעות פיג&#39;י ואת התוסף &quot;Cell לדלפק &quot;. איור 2B מראה את כימות של תגובת הלחץ החום. זה מראה כי גידול מוקדי Q103-GFP cytosolic במספרים עם עומס חום מתמשך. במהלך עקת חום, חלבון באיכות מלאה (PQC) המערכת הוא המום, ובכך aggregation- חלבונים נוטה כגון Q103 חלבון כמו-הפריון לא יכול להישמר במצב מסיס יותר ויותר המצרפי מוקדים cytosolic. התאים גם להראות עיגול מאפיין, כמתואר באיור 1B. צמצום מוקדי cytosolic לאחר הסרת הלחץ עולה כי מצטברים חלבונים הם מומסים. איכות ההדמיה רגישה צפיפות התא הראשונית. איור 3 מראה דוגמא של תאים לאחר התאוששות מתח, השוואת צפיפות תא ראשונית מתאימה (איור 3 א) ו צפיפות תא ראשונית גבוהה (איור 3). אם צפיפות התאים הראשונית היתה גבוהה מדי, כוכב תאיםטד כדי ליצור זרמי כמתואר איור 3B. זה המטיל קשיים על כימות הבאים בתור התאים עברו מן המטוס מוקד. השיטה המתוארת ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר שינויי מושרה טמפרטורה כפי שתואר לעיל. זה יכול לשמש גם כדי להפחית רעילות צילום כאשר הדמיה בטמפרטורת הצמיחה פיזיולוגי. איור 4 מציג השוואה של תא צילמו ב 23 מעלות צלזיוס (איור 4 א) תא הקירור ותאי צילמו ללא בקרת טמפרטורה בחדר ממוזג, להגדיר עד 25 ° C (איור 4B). עם חשיפה מתמדת לאור העירור, תאים לעגל כלפי מעלה כאשר לא צלמו בתנאי בקרת טמפרטורה. שינוי זה בצורת התא הוא המציין מתח. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig1.jpg" /> איור 1: <s<html> טרונג&gt; חלבונים Aggregation נוטה כמו-הפריון לשנות ההפצה הסלולרי שלהם במהלך עומס החום. מתויג GFP אקסון huntingtin polyglutamine עשירי 1 (Q103) באה לידי ביטוי constitutively ב AX2-214 ד תאי discoideum (אות ה- GFP מתוארת בטבלת בדיקה גונית אפור הפוכה). (א) בתנאי צמיחה נורמלים ב 23 ° C, Q103-GFP מופץ מתפזר ברחבי הציטופלסמה. (ב) אחרי שעה 2 של עומס החום על 30 מעלות צלזיוס, Q103-GFP מתמזגת לתוך מוקדים cytosolic (חצים אדומים). התאים להראות שינוי צורה אופייני לעגל כלפי מעלה. (ג) עם שחרורו וצמיחה מתח ב 23 ° C, מוקדי cytosolic מתמוססים. לאחר 6 שעות, ללא מוקדים cytosolic ניתן לצפות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig2.jpg" /> איור 2: כימות של היווצרות מוקדי cytosolic חום נגרמת (א) ניתוח של תאים באמצעות החבילה בעיבוד תמונות חינם פיג&#39;י ואת התוסף &quot;מונה Cell&quot;.. הסכום הכולל של תאים (סוג 1, סמני דלפק כחולים) נקבע בתמונה בשדה הבהירה. הסמנים נטענים בערוץ-GFP ואת מספר התאים עם מוקדי cytosolic (סוג 2, סמני דלפק אדומים) נקבע. (ב) כימות של מוקדים לאחר 3 שעות של עומס החום על 30 מעלות צלזיוס ו -3 שעות של התאוששות מתח ב 23 ° C (n = 4 שדות מבט, שגיאה בר = SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig2large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54730/54730fig3.jpg" /> <stron<html> g&gt; איור 3: השפעת צפיפות התאים על הדמיה לטווח ארוך זמן לשגות (א) תאים צילמו בצפיפויות התא הראשוני &lt;10 5 תאים / מ&quot;ל.. אחרי 3 שעות של עומס חום על 30 מעלות צלזיוס ו -6 שעות של התאוששות מתח ב 23 ° C, תאים עדיין להישאר במחזור וגטטיבי ומתחלק. רק כמה תאים לצאת מישור המוקד. (ב) תאים צילמו בצפיפויות התא הראשוני&gt; 10 6 תאים / מ&quot;ל. לאחר 9 שעות של הדמיה (הגדרות כמו א), תאים נכנסו מעגל ההתפתחות והחל הזרמה וצבירה. תאים של המצרפים לא ניתן להבחין בבירור. חלק גדול של תאים יוצא המטוס מוקד ולא ניתן לנתח. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54730/54730fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> .jpg &quot;/&gt; איור 4:. השפעת בקרת טמפרטורה על תופעות phototoxic (א) תאים צילמו במשך 10 דק &#39;עם בקרת טמפרטורה ב 23 ° C: 6 שדות מבט, Z- מחסנית (ריווח 0.5 מיקרומטר, מדגם עובי 8 מיקרומטר), זמן לשגות (סה&quot;כ זמן 10 דקות, לשגות 1 דק &#39;), ערוץ GFP (0.07 זמן החשיפה msec, 10% עוצמת הלייזר), ערוץ RFP (0.1 זמן חשיפה msec, עוצמת הלייזר 10%). והתא לא מראה סימנים של שינויים מורפולוגיים מאפיין הקשורים ללחץ phototoxic. (ב) תאים צילמו במשך 10 דק &#39;ללא בקרת טמפרטורה (באותם תנאים כמו A). תאי מפגיני סימנים של עיגול מושרה phototoxic, המציין מתח. בר סולם = 10 מיקרומטר. התאים היו צלמו על מערכת המבוססת על מיקרוסקופ עם מטרת 100x / 1.4 צמצם מספרי (NA). התמונות נאספו עם מצלמת CCD כמו 1,024 x 1,024 קבצים פיקסל באמצעות 1 x 1 binning.4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging at JoVE.com

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

studying-protein-quality-control-system-d-discoideum-using

Research

JoVE Journal

Biology

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

6.6K Views.  Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics. The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

Video: Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other important cellular biology questions. The technologies available to genetically manipulate Dictyostelium cells are well-developed. Transfections can be performed using different selectable markers and marker re-cycling, including homologous recombination and insertional mutagenesis. This is supported by a well-annotated genome. However, these approaches are optimized for axenic cell lines growing in liquid cultures and are difficult to apply to non-axenic wild-type cells, which feed only on bacteria. The mutations that are present in axenic strains disturb Ras signaling, causing excessive macropinocytosis required for feeding, and impair cell migration, which confounds the interpretation of signal transduction and chemotaxis experiments in those strains. Earlier attempts to genetically manipulate non-axenic cells have lacked efficiency and required complex experimental procedures. We have developed a simple transfection protocol that, for the first time, overcomes these limitations. Those series of large improvements to Dictyostelium molecular genetics allow wild-type cells to be manipulated as easily as standard laboratory strains. In addition to the advantages for studying uncorrupted signaling and motility processes, mutants that disrupt macropinocytosis-based growth can now be readily isolated. Furthermore, the entire transfection workflow is greatly accelerated, with recombinant cells that can be generated in days rather than weeks. Another advantage is that molecular genetics can further be performed with freshly isolated wild-type Dictyostelium samples from the environment. This can help to extend the scope of approaches used in these research areas.

Genetic Engineering of Dictyostelium discoideum Cells Based on Selection and Growth on Bacteria

Dictyostelium discoideum is a popular model organism to study complex cellular processes such as cell migration, endocytosis, and development. The utility of the organism is dependent on the feasibility of genetic manipulation. Here, we present methods to transfect Dictyostelium discoideum cells that overcome existing limitations of culturing cells in liquid media.

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

Dictyostelium discoideum is an intriguing model organism for the study of cell differentiation processes during development, cell signaling, and other ...

Genetics

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Immunology and Infection

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium discoideum revealed that a complex signal transduction network of parallel pathways amplifies the response to chemoattractants, and leads to biased actin polymerization and protrusion of a pseudopod in the direction of a gradient. In contrast, molecular mechanisms driving other types of directed migration, for example, due to exposure to shear flow or electric fields, are not known. Many regulators of chemotaxis exhibit localization at the leading or lagging edge of a migrating cell, as well as show transient changes in localization or activation following global stimulation with a chemoattractant. To understand the molecular mechanisms of other types of directed migration we developed a method that allows examination of cellular response to acute mechanical stimulation based on brief (2 - 5 s) exposure to shear flow. This stimulation can be delivered in a channel while imaging cells expressing fluorescently-labeled biosensors to examine individual cell behavior. Additionally, cell population can be stimulated in a plate, lysed, and immunoblotted using antibodies that recognize active versions of proteins of interest. By combining both assays, one can examine a wide array of molecules activated by changes in subcellular localization and/or phosphorylation. Using this method we determined that acute mechanical stimulation triggers activation of the chemotactic signal transduction and actin cytoskeleton networks. The ability to examine cellular responses to acute mechanical stimulation is important for understanding the initiating events necessary for shear flow-induced motility. This approach also provides a tool for studying the chemotactic signal transduction network without the confounding influence of the chemoattractant receptor.

Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation

Here we describe methods for assessing cellular response to acute mechanical stimulation. In the microscopy-based assay, we examine localization of fluorescently-labeled biosensors following brief stimulation with shear flow. We also test activation of various proteins of interest in response to acute mechanical stimulation biochemically.

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

Chemotaxis, or migration up a gradient of a chemoattractant, is the best understood mode of directed migration. Studies using social amoeba Dictyostelium ...

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein subcellular localization changes; in particular, a nuclear translocation under a heat stress condition. Proteins react correspondingly to external and internal signals. A common mechanism is to change its subcellular localization. This article describes a protocol to track protein localization that does not require an antibody, radioactive labeling, or a confocal microscope. In this article, GFP is used to tag the target protein EXL-1 in C. elegans, a member of the chloride intracellular channel proteins (CLICs) family, including mammalian CLIC4. An integrated translational exl-1::gfp transgenic line (with a promoter and a full gene sequence) was created by transformation and &#947;-radiation, and stably expresses the gene and gfp. Recent research showed that upon heat stress, not oxidative stress, EXL-1::GFP accumulates in the nucleus. Overlapping the GFP signal with both the nuclei structure and the DAPI signals confirms the EXL-1 subcellular localization changes under stress. This protocol presents two different fixation methods for DAPI staining: ethanol fixation and acetone fixation. The DAPI staining protocol presented in this article is fast and efficient and preserves both the GFP signal and the protein subcellular localization changes. This method only requires a fluorescence microscope with Nomarski, a FITC filter, and a DAPI filter. It is suitable for a small laboratory setting, undergraduate student research, high school student research, and biotechnology classrooms.

Detecting Protein Subcellular Localization by Green Fluorescence Protein Tagging and 4',6-Diamidino-2-phenylindole Staining in Caenorhabditis elegans

This protocol demonstrates how to track a protein nuclear translocation under heat stress by using a green fluorescence protein (GFP) fusion protein as a marker and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. The DAPI staining protocol is fast and preserves the GFP and protein subcellular localization signals.

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

In this protocol, a green fluorescence protein (GFP) fusion protein and 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining are used to track protein ...

4D Microscopy of Yeast

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments in yeast are dynamic, and a full understanding of their properties requires time-lapse imaging. Multi-color 4D confocal fluorescence microscopy is a powerful method for tracking the behavior and composition of an intracellular compartment on a time scale of 5-15 min. Rigorous analysis of compartment dynamics requires the capture of thousands of optical sections. To achieve this aim, photobleaching and phototoxicity are minimized by scanning rapidly at very low laser power, and the pixel dimensions and Z-step intervals are set to the largest values that are compatible with sampling the image at full resolution. The resulting 4D data sets are noisy but can be smoothed by deconvolution. Even with high quality data, the analysis phase is challenging because intracellular structures are often numerous, heterogeneous, and mobile. To meet this need, custom ImageJ plugins were written to array 4D data on a computer screen, identify structures of interest, edit the data to isolate individual structures, quantify the fluorescence time courses, and make movies of the projected Z-stacks. 4D movies are particularly useful for distinguishing stable compartments from transient compartments that turn over by maturation. Such movies can also be used to characterize events such as compartment fusion, and to test the effects of specific mutations or other perturbations.

This protocol describes the analysis of fluorescently labeled intracellular compartments in budding yeast using multi-color 4D (time-lapse 3D) confocal microscopy. The imaging parameters are chosen to capture adequate signals while limiting photodamage. Custom ImageJ plugins allow labeled structures to be tracked and quantitatively analyzed.

4D מיקרוסקופ של שמרים

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally important for cell function and cell integrity of neurons. Drosophila photoreceptor cells have become a model for studying membrane protein trafficking. Besides rhodopsin, which upon illumination becomes internalized from the photoreceptor membrane and is degraded, the transient receptor potential-like (TRPL) ion channel in Drosophila exhibits a light-dependent translocation between the rhabdomeral photoreceptor membrane (where it is located in the dark) and the photoreceptor cell body (to which it is transported upon illumination). This intracellular transport of TRPL can be studied in a simple and non-invasive way by expressing eGFP-tagged TRPL in photoreceptor cells. The eGFP fluorescence can then be observed either in the deep pseudopupil or by water immersion microscopy. These methods allow detection of fluorescence in the intact eye and are therefore useful for high-throughput assays and genetic screens for Drosophila mutants defective in TRPL translocation. Here, the preparation of flies, the microscopic techniques, as well as quantification methods used to study this light-triggered translocation of TRPL are explained in detail. These methods can be applied also for trafficking studies on other Drosophila photoreceptor proteins, for example, rhodopsin. In addition, by using eGFP-tagged rhabdomeral proteins, these methods can be used to assess the degeneration of photoreceptor cells.

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Here, non-invasive methods are described for localization of photoreceptor membrane proteins and assessment of retinal degeneration in the Drosophila compound eye using eGFP fluorescence.

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

הנדסה גנטית של Dictyostelium discoideum תאים בהתבסס על הבחירה וצמיחה על חיידקים

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

4D הדמיה של צבירת חלבון בתאים חיים

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

הערכה של Dictyostelium discoideum בתגובה חריפה גירוי מכני

גילוי חלבונים לוקליזציה Subcellular על ידי ירוק פלורסצנטיות חלבון Tagging ו 4', 6-Diamidino-2-phenylindole מכתים ב Caenorhabditis elegans

4D מיקרוסקופ של שמרים

חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי דרוזופילה פוטורצפטור באמצעות חלבונים המתויגים על ידי eGFP