Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يبقى تحديد بنية البروتين الغشاء من خلال تقنيات فيزيائية حيوية مهمة شاقة بالنسبة للعديد من شركات النقل الهامة طبيا، المستقبلات، وقنوات 11. نحن هنا تبادل الخبرات مفصلة وضعت لتحديد هيكل نقل السيروتونين الإنسان ملزمة لS -citalopram. ونحن نتوقع أن هذه الطرق ستكون مفيدة لتحديد هياكل سرت في الدول بتكوين الأخرى، فضلا عن هياكل للبروتينات غشاء الصعبة الأخرى. وعلاوة على ذلك، التقنيات الحيوية الموصوفة هنا يمكن أيضا أن تستخدم لدراسة وظيفة من سرت النقاء في صناعة المنظفات والبيئة الدهون شبه مواطن. سرت بلورة يتوقف على تطوير العديد من الأدوات والتقنيات. أولا، أنتجت تحسينات في صمود للحرارة نقل المتغيرات سرت التي كانت تصرف بشكل جيد في مختلف المذيلات المنظفات التالية استخراج نقل من الأغشية 6. الثاني، واستخداممن -citalopram يجند S عالية تقارب في جميع أنحاء تنقية وبلورة مزيد من تحسين الاستقرار والحد من عدم التجانس بتكوين. ثالثا، تطوير نظام التعبير BacMam 7 سمح لإنتاج كميات كبيرة من سرت في فترة قصيرة من 2 أسابيع، مما يسهل على حد سواء التحصين والتبلور. وأخيرا، وضع استراتيجيات لتحديد الأجسام المضادة عالية تقارب التي تعترف 3D الحواتم يسمح لاكتشاف الأجسام المضادة 8B6 الذي يعزز التعبئة امر جيد للمجمعات للسرت الأجسام المضادة إلى بلورات. وهناك عدد من الخطوات والكواشف الحيوية فضلا عن المشاكل الشائعة التي غالبا ما تحدث في جميع أنحاء البروتوكول. أولا، جيل من ارتفاع عيار سرت P2 الفيروس يمكن أن يكون مشكلة. مضيفا تركيزات منخفضة من الفيروس P1 لتوليد فيروس P2 كما هو موضح في هذا البروتوكول عادة ما يخفف من هذه المشكلة، وفي الحالات التي يكون فيها عيار الفيروس P2 منخفضة، P3 الفيروس يمكن أن تدلي النقيبز الفيروس في وزارة الداخلية من 0.0001. الفيروسات مع عيار أقل من 1 × 10 8 جزيئات الفيروس / مل لا ينبغي ان تستخدم وسوف تؤدي دائما تقريبا في غلة البروتين منخفضة. للتعبير، HEK293S GnTI - تم اختيار الخلايا لأنها تفتقر إلى N -acetylglucosaminyltransferase أنا النشاط، وبالتالي لا يمكن توليف -glycans N مجمع، بدلا تنتج فقط عالية المانوز N -glycans. يشق EndoH N -linked بالغليكوزيل من glycans المانوز عالية في موقعين في حلقة خارج الخلية 2 (EL2)، مما أسفر عن -acetylglucosamine N تعلق على الهليونين. هضم N -linked السكريات تقلل الكون سطح EL2 التي من المرجح مهمة لبلورة. لتوليد الأجسام المضادة، وسرت IC ينبغي أن تستخدم للتحصين. GFP هو مناعة عالية 12، وينبغي ألا تستخدم كعلامة الانصهار لتوليد الأجسام المضادة لأنه من الصعب تماما لإزالة من قبل المجلس الأعلى للتعليم. كانت N- مرنة وC-محطة من سرت أيضا لاالمدرجة في بناء من أجل تجنب الأجسام المضادة ضد هذه المناطق. الفئران يمكن تحصين مع 30 ميكروغرام من البروتين أعيد تشكيلها. تواصل الفئران تحصين حتى يمكن الكشف عن تركيزات عالية من المصل من الأجسام المضادة وخلايا إنتاج هجين كما هو موضح 13. وبناء thermostabilized عادة ما يكون الخيار الأفضل للتحصين. إذا كان الناقل هو حسن تصرف ويحتفظ النشاط البيولوجي التالية تنقية، وهذا غالبا ما يكون كافيا لرفع الأجسام المضادة. تم رفع الأجسام المضادة 8B6 ضد WT سرت. لتبلور، إلا أن الكسور الذروة من المجلس الأعلى للتعليم التي تحتوي على مجمع monodisperse كما تقرره FSEC ينبغي الجمع بين والمركزة. تنمو بلورات سرت-8B6 في نطاق ضيق من الظروف، وهناك عدد من الخطوات التي ينبغي اتخاذها لاستكشاف مشكلات تتعلق على وجه التحديد نمو سرت وضوح الشمس. تريس قاعدة تعديلها مع حمض الهيدروكلوريك لا ينبغي أن تستخدم في خزان حل، لأن هذا المخزن لا يدعم نمو البلورات. بالتالي فمن صرخةtical بدلا من ذلك استخدام تريس تعديلها مع هيدروكسيد الصوديوم. تنمو بلورات سرت في نطاق التركيز الضيق من PEG 400، حتى إذا بلورات لا تنمو أو إذا لوحظ العديد من بلورات صغيرة، وحتى زيادة طفيفة أو نقصان في تركيز PEG 400 سيتم نصح. وعلاوة على ذلك، تم استخدام حمض مضافة 6 aminohexanoic أيضا في الشاشة الأمثل لتحسين التنوي. نسبة انخفاض البروتين: حل جيد هو أيضا مفتاح تحديد عامل للنمو وضوح الشمس. إسقاط نسب 1،5-2: 1 ينصح، مع نسب انخفاض أقرب إلى 2: 1 دعم عادة نمو أكبر بلورات 3-الأبعاد. وأخيرا، واستخدام الانظار 24 لوحات جيدا أيضا حاسما نحو النمو وضوح الشمس، ويفترض بسبب تعديل معدل انتشار البخار. وقد تم تطوير نهج بديل لطريقة SPA للكشف عن المسوخ التي استقرار نقل الفئران السيروتونين في التشكل محددة الكوكايين باستخدام فلتر فحص 5 ملزمة. على النقيض من ذلك، وبا SPAفحص سد يسمح لاتخاذ خطوات متتابعة التدفئة التالية تحديد جزء من سرت التي لا تزال ملزمة ليجند. وهكذا، وهذا أتاح الفرصة للتعرف السريع لدرجة حرارة انصهار من عدد قليل من العينات. يعتمد أسلوب SPA على توافر رديولبلد يجند عالية تقارب وإذا لم يعرف بروابط التي تربط مع تقارب submicromolar ثم سوف نهج بديل يكون ضروريا. وتستخدم العديد من الطرق الأخرى الشائعة لقياس استقرار البروتين مثل ملزم من الأصباغ الفلورية والكالوري 14 ولكنها منخفضة الإنتاجية وإما أن تكون غير قادر على قياس وظيفة مباشرة أو تتطلب كميات كبيرة من البروتين. إذا لا يمكن استخدام أسلوب SPA، النهج الإنتاجية العالية بديل واحد هو صمود للحرارة الفحص القائمة على FSEC 15 (FSEC-TS)، حيث يتم تسخين تليها العينة انفصال جزء من ما تبقى نقل. FSEC-TS هو نهج مفيد للوصول إلى السلوك الكروماتوغرافي والدولة بلازميدة قليلة القسيمات وغير ا ف بأداة مكملة owerful التي يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع طريقة SPA. تم العثور على المقارنة بين مختلف النظم بروتين تعبير شائع أيضا إلى تفضيل استخدام خلايا الثدييات لسرت التعبير 16 و لا غرابة في هذا هو الحال بالنسبة للعديد من البروتينات من أصل الثدييات احتمالا. وقد جرى تصميم طرق التي لدينا وتستخدم للتعبير عن سرت ولكن هم على الأرجح أكثر قابلية للتكيف. الظروف التي تشجع على مستويات عالية من التعبير يجب أن توضع بعناية من خلال تغيير الوقت من التعبير، ودرجة الحرارة، وتركيز الفيروس، وجود مثبطات هيستون deacetylase مثل الزبدات الصوديوم. ونحن نفضل عموما تنقية تقارب في المنظفات سلسلة طويلة خفيفة مثل C12M جنبا إلى جنب مع كلية العلوم الصحية قبل إعادة للاحتفاظ عالية تقارب يجند ملزمة. إعادة استخدام امتصاص مسعور هي تقنية خفيفة والتي وجدنا أن تكون فعالة لعدة شركات النقل ومستقبلات أخرى. اذا هذاغير ناجح، وإزالة المنظفات مع تركيزات عالية مذيلة الحرجة من غسيل الكلى، والتخفيف، أو المجلس الأعلى للتعليم ويمكن استخدام 17 المقدمة للمستضد مستقرة بما فيه الكفاية في مثل هذه المنظفات. في الحالات التي لم يتم العثور على أجسام مضادة مناسبة، ونحن دائما تقريبا تجد من المقرر أن فقدان وظيفة أو تمسخ للمستضد هذه القضية، وفي مثل هذه الحالات أجرينا بنجاح التطعيمات الجديدة مع إيلاء اهتمام خاص إلى الكيمياء الحيوية البروتين. وأخيرا، ينبغي بروابط والأجسام المضادة التي تربط مع عالية تقارب تشكل الأساس لتجربة بلورة المخطط لها بعقلانية ومن خلال الاستفادة من البديل بالحرارة، يمكن للمرء أن فحص مجموعة واسعة من الظروف من خلال تغيير خصائص المنظفات المختلفة. وعلاوة على ذلك، ينبغي النظر في التبلور في mesophase شحمي 18 أو باستخدام bicelles 19 دائما كبديل للتبلور في المذيلات. هذه المبادئ والأساليب التي يمكن استخدامها مع بعض modifiالموجبة للعديد من البروتينات عبر الغشاء الأخرى التي يصعب التعبير وتنقية من المضيفين التعبير الأخرى، وسوف تكون مفيدة بشكل خاص لتحديد هيكل أهداف الأدوية عالية تقارب.

ونقل السيروتونين (سرت) هو بروتين الغشاء لا يتجزأ التي تسهل نقل السيروتونين عبر الأغشية الخلوية 1. سرت ينتمي إلى عائلة العصبي الصوديوم Symporters (NSSs) التي تضم أيضا الدوبامين والنورادرينالين النقل 2. سرت هو الهدف الجزيئي للاكتئاب والمضادة للقلق الأدوية التي توصف على نطاق واسع والتي تعمل على كبح تنافسية نقل السيروتونين 3. سرت يستغل من cotransport مواتية بقوة من الصوديوم لإزالة العصبي من الشق متشابك. وقد أظهرت توصيف واسع النطاق للنظام هرمون السيروتونين أن التغيرات في عملية الأيض السيروتونين يبدو أن التأثير تقريبا كل العمليات العصبية بما في ذلك المزاج، والنوم، والألم، والإدراك، والعدوان السلوكيات 4. وظيفة سرت يمكن تعديلها من خلال استخدام مضادات الاكتئاب وامتصاص السيروتونين الانتقائية مثبطات (اس اس اراي) مثل S -citalopram، فضلا عن psychostimulaاليلة وعقاقير الإدمان مثل الأمفيتامين و3،4-methylenedioxy- N -methylamphetamine أو &quot;النشوة&quot; 1،2. اس اس اراي هي مهمة جدا لعلاج اضطرابات المزاج، ولكن الأساس الهيكلي الدقيق لعملها ليست مفهومة جيدا. WT سرت غير مستقر في المذيلات المنظفات، مما يعوق التقدم نحو (3D) ثلاثي الأبعاد هيكل من سرت 5،6. مؤخرا، قمنا بتطوير أنواع من سرت التي هي بقوة مستقرة في مجموعة واسعة من المنظفات والاحتفاظ SSRI النشاط 6 ملزمة. وقد تم اختيار هذه المتغيرات سرت بالحرارة باستخدام فحص للحرارة على أساس القرب-التلألؤ. نحن هنا وصف الإجراء لتوليد الأجسام المضادة عالية تقارب التي يمكن أن تربط سرت، وتنقية وبلورة سرت بالحرارة، في مجمع مع الأجسام المضادة وS -citalopram. يفترض هذا البروتوكول أن سرت و8B6 الجينات كانت ناجحاالمستنسخة ذ في ناقلات BacMam 7 و الحشرات التعبير، على التوالي. لتوليد الأجسام المضادة، كدنا] بقايا ترميز 73-616 من WT سرت تم استنساخ في ناقلات BacMam مع C-محطة بكتيريا الثاني العلامة (سرت IC). للعرض على الشاشة للحرارة، وبقايا سرت 73-616 مع GFP C-المحطة، بكتيريا الثاني، و 10 صاحب العلامات (سرت TC) تم استخدام. تم إنشاء الطفرات نقطة الفردية في الخلفية سرت TC. لبروتوكول التبلور، تم استخدام البروتين الانصهار سرت-GFP مع التوأم بكتيريا [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] و 10 صاحب العلامات، تحمل طفرات بالحرارة، Y110A، I291A، وT439S والطفرات من cysteines سطح C554A، C580A وC622A (CC سرت). تم إدراج تسلسل الثرومبين الانقسام (LVPRGS) أيضا في CC سرت بعد Q76 وT618 للسماح إزالة N- وC-ترميني. تم هندستها البلازميد ترميز 8B6 فاب للتعبير عن كل من الثقيلة والخفيفةسلاسل من الأجسام المضادة مع تسلسل إفراز GP67 تحت سيطرة اثنين من المروجين polyhedrin منفصل. تم وضع علامة على C-محطة من سلسلة كبيرة من الأجسام المضادة 8B6 مع 8-صاحب العلامة وتم إدراج موقع الثرومبين الانقسام بين السلسلة الثقيلة والعلامة.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Cation exchanger used for Fab purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-well VDXm plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm coverslips</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virus counter</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-well scintillation counter</td></tr><tr><td>HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

ونقل السيروتونين هو الصوديوم وكلوريد جانب نقل أن &quot;مضخات&quot; السيروتونين خارج الخلية إلى داخل الخلايا. S -citalopram هو دواء يستخدم لعلاج الاكتئاب والقلق عن طريق ملزمة لنقل السيروتونين مع عالية تقارب، ومنع امتصاص السيروتونين. نحن هنا نورد إجراء فعال ومجموعة من الأدوات لتحقيق الاستقرار، صريحة، تنقية، وبلورة مجمعات للنقل الأجسام المضادة السيروتونين ملزمة لS -citalopram ومضادات الاكتئاب الأخرى. وقد تم تحديد الطفرات التي استقرار نقل السيروتونين باستخدام -citalopram S فحص ملزمة. السيروتونين الناقل أعرب في HEK293S GnTI transduced الفيروسة العصوية - الخلايا، أعيد تشكيل في proteoliposomes وتستخدم لزيادة الأجسام المضادة عالية تقارب. وضعنا استراتيجية لاكتشاف الأجسام المضادة التي هي مفيدة للدراسات الهيكلية. كما تم إنشاء نهج واضحة للتعبير عن شظايا الأجسام المضادة في خلايا Sf9.مجمعات للنقل الأجسام المضادة تنقيتها باستخدام هذا الإجراء هي تصرفت بشكل جيد وتتبلور بسهولة، وتنتج المجمعات مع S -citalopram أن حيد الضوء والأشعة السينية إلى 3-4 قرار Å. الاستراتيجيات التي وضعت هنا يمكن استخدامها لتحديد بنية البروتينات غشاء الصعبة الأخرى.

تم إنشاء مكتبة من المسوخ نقطة واحدة في الخلفية سرت TC على الشاشة لthermostabilizing الطفرات. تم إنشاؤها المسوخ الفردية باستخدام الطفرات القياسية. بروتوكول فحص يستخدم transfected عابر الخلايا HEK293S وشاشة للحرارة على أساس القرب-التلألؤ لبسرعة هوية الطفرات مفيدة لبلورة كما هو مبين في الشكل 1A. القيم التآمر تيم مقابل ملزمة [3 H] سيتالوبرام في RT يكشف يبني مع صمود للحرارة العالية والتعبير مستويات مناسبة لتنقية البروتين (الشكل 1B). تم دمج ثلاث طفرات (Y110A، I291A، وT439S) لإنشاء بناء مستقر للغاية (الشكل 1C). ويرتبط صمود للحرارة أيضا مع زيادة الاستقرار في المنظفات سلسلة قصيرة اللازمة لبلورة مجمع سرت-فاب. التعبير على نطاق واسع من سرت الإنسان باستخدام الفيروسة العصوية-TRansduced HEK293S GnTI - يمكن أن الخلايا تأخذ أقل من 2 أسابيع، ويمكن أن تنتج كميات مليغرام، كما هو موضح في الشكل 2A. استخدام البروتين سرت CC-GFP الموسومة يسمح سرت الواجب اتباعها بشكل ملائم خلال التعبير وتنقية من قبل مضان (الشكل 2B). تضمنت استراتيجية تنقية لدينا 1) الإذابة من سرت متجهة إلى S -citalopram من HEK293S GnTI - الخلايا في C12M في وجود كلية العلوم الصحية كما الدهن استقرار. 2) ملزمة من سرت إلى تقارب مصفوفة بكتيريا. 3) إزالة البروتينات الملوث عن طريق الغسيل واسعة النطاق. و4) شطف من سرت وظيفية مع العازلة التي تحتوي على desthiobiotin (الشكل 2C). بروتين مزال هو حر إلى حد كبير من البروتينات التي يمكن اكتشافها أخرى Coomassie تلطيخ الأزرق وmonodisperse كما تقرره FSEC (الشكل 2D، E). أجري استراتيجية مماثلة لتنقية سرت مع علامة بكتيريا الثاني الذي كان يستخدم لreconstitutioن والتحصين (الشكل 3A، B). إدماج سرت في proteoliposomes يعزز مصل نصف الحياة والاستقرار في سرت ويحسن من احتمال عزل الأجسام المضادة عالية تقارب. وعلاوة على ذلك، إدراج الدهون A، مكون من جدار الخلية البكتيرية، بمثابة مساعد قوية 9. وبإضافة عازلة لخليط الدهن المجفف في أنابيب زجاجية أعدت الجسيمات الشحمية الصفاحات ومعلق في المخزن. قذف من الجسيمات الشحمية من خلال 200 نانومتر الفلاتر حجم المسام تنتج monodisperse تعليق liposomal unilamellar. ثم يتم المشبعة في الجسيمات الشحمية مع المنظفات تليها إضافة سرت النقاء في صناعة المنظفات. وأخيرا، يتم إزالة المنظفات بإضافة الراتنج امتصاص مسعور إلى الدهون: خليط مواد التنظيف. وينبغي أن يضاف يجند إضافي لعينة تشكيلها لتحديد الأجسام المضادة التي تعترف التشكل ملزمة المضادة للاكتئاب. وجود سرت في proteoliposomes ينبغي تأكيد من قبلالانحلال عينة صغيرة مع صبغ SDS-PAGE التحميل أو C12M وتعمل على SDS-PAGE وFSEC (الشكل 3C، D). خطوط الخلايا هجين التعبير عن الأجسام المضادة سرت ويمكن فحص لدنة عالية تقارب التي تعترف الحواتم 3D. هذه الخصائص هي حاسمة لنجاح في نهاية المطاف التبلور، حيث أن الأجسام المضادة يجب أن تبقى ملتزمة بحزم إلى منطقة منظم لتعزيز التعبئة الكريستال متجانسة، المجالات امر جيد. في الخطوة الأولى، ويتم تحديد الأجسام المضادة التي تعترف المناطق غير المنظمة. سرت هو التشويه والتحريف ونشف على غشاء النيتروسليلوز. والأجسام المضادة التي تربط سرت التشويه والتحريف تكون إيجابية الغربي، ومن المرجح يعترف الحواتم الخطية. في الشكل 4A، وتبين لنا 2 أمثلة من الأجسام المضادة التي تكون إيجابية الغربية وعلى الأرجح ليس من المفيد تشجيع crystallogenesis. في الشكل 4B، يتم تحضين ما تبقى من الأجسام المضادة غرب سلبية مع 100 نيوتن متر سرت-GFP ومفصولةFSEC. الأجسام المضادة التي تربط سوف سرت تحويل ذروة GFP إيجابية إلى الموقف السابق. قد تضعف مجمعات للسرت الضد من ذلك في المنظفات لتحديد ما إذا كانت يمكن أن تربط مع تقارب nanomolar تليها التحليل FSEC. علاوة على ذلك النتائج السيروتونين في التغييرات متعلق بتكوين في نقل وبالتالي الأجسام المضادة يمكن rescreened لتحديد ما اذا كان بامكانهم التعرف على وجه التحديد التشكل متجهة الى SSRI. في الشكل 4C، وتظهر الأجسام المضادة لربط سرت في وجود مادة السيروتونين، وتبين أن حاتمة (ق) لا تتغير من SSRI إلى الركيزة الدولة ملزمة. وأخيرا، في الشكل 4D يتم اختبار مجموعات من الأجسام المضادة لقدرتها على ربط الحواتم متميزة، مما أدى إلى التحول اليساري آخر. هنا 15B8 أو 8A11 الأجسام المضادة الاعتراف حاتمة الذي يختلف عن 8B6. وقد تم اختيار الأجسام المضادة 8B6 لمزيد من التحليل الهيكلي على أساس فحص الكريستال مبدئي مع trea غراءتيد فاب. تم استنساخ جينات 8B6 فاب إلى ناقلات التعبير خلية الحشرات. فاب يمكن التعبير عن ويفرز من خلايا Sf9 نموا في تعليق. و8B6 فاب يمكن تنقيته من Sf9 خلية طاف صاحب العلامة تقارب (الشكل 5A، B) وتبادل الأيونات الموجبة اللوني (الشكل 5C، D) مما أدى إلى البروتين الذي يبدو خاليا من الملوثات في المواد الهلامية SDS-PAGE. في الشكل 5E، يظهر فاب المؤتلف 8B6 لربط سرت، ويستخدم في التجارب الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية لاحقة. يتم هضم تقارب تنقية سرت CC مع الثرومبين وEndoH ومختلطة مع 8B6 فاب لتشكيل مجمع بحضور S -citalopram. ثم يتم فصل مجمع نقل الأجسام المضادة من قبل المجلس الأعلى للتعليم في C8M (الشكل 6A) والكسور ذروة يحتوي كلا سرت وفاب كما هو مبين من قبل SDS-PAGE (الشكل 6B). استخدام C8M هو أمر حاسم لتشكيل الكريستال ربما لالمنظفات قصيرة السلسلة يسمح التعبئة أفضل بين الجزيئات في شعرية الكريستال. يعمل FSEC لتحديد أي كسور يجب أن تكون مجمعة لبلورة (الشكل 6C)؛ الكسور التي لا monodisperse و / أو تحتوي على كميات كبيرة من سرت مجانية أو فاب لا ينبغي أن تكون مجتمعة. منشور على شكل بلورات سرت الأجسام المضادة يمكن أن تنمو في وجود S -citalopram باستخدام هذا البروتوكول شنقا نشر انخفاض بخار (7A الشكل). البلورات الناتجة حيد الضوء والأشعة السينية لقرار من 3.15 Å 10 (7B الشكل). <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> الشكل 1: التلألؤ للحرارة الفحص والقرب المستندة. نظرة عامة على بروتوكول لفحص للحرارة في وجود [3 H] سيتالوبرام. ب. أقصى ملزمة [3 </سوب&gt; H] سيتالوبرام مقابل درجة حرارة انصهار واضحة (TM). تمثل الخطوط المنقطة القيم لنقل WT. وصفت المسوخ الأكثر بالحرارة 3. وتمثل منطقة رمادية المسوخ التي لديها أقل من 10٪ من سيتالوبرام [3 H] نسبة إلى WT والقيم تيم بالتالي غير دقيقة ملزم بسبب انخفاض إشارة إلى الضوضاء. C. منحنيات للحرارة لWT سرت TC وأعلى 3 المسوخ. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> الشكل 2: نظرة عامة على الثدييات مغاير البروتين التعبير و. نظرة عامة Schematized توليد فيروس BacMam والتعبير من سرت في HEK293S GnTI - الخلايا البائية. سعادةK293S GnTI - خلايا معربا عن سرت CC (GFP مضان) C. الملف الشخصي شطف من CC سرت على راتنج تقارب بكتيريا. يمثل أثر الأخضر تركيز desthiobiotin، 0-100٪ (0-5 ملم) D. تحليل تقارب تنقية سرت CC على 4 - جل 15٪ SDS-PAGE E. FSEC من تقارب CC سرت النقاء الكشف عنها بواسطة GFP مضان (الإثارة: 480 نانومتر. الانبعاث: 510 نانومتر). ذروة يبلغ حجمه 15 مل هي سرت (#) و 18 مل هو GFP مجانا (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> الشكل (3): الممثل الانجذاب تنقية وإعادة إعماره من سرت IC و. نظرة عامة التخطيطي لتوليد الأجسام المضادة. &lt;قوي&gt; B. لاحظ التعريف شطف عند 280 نانومتر لتنقية تقارب من سرت IC على راتنج تقارب بكتيريا. يمثل أثر الأخضر تركيز desthiobiotin، 0-100٪. (0-5 ملم) C. تحليل تقارب تنقية وإعادة تشكيل سرت على 4 - جل 15٪ SDS-PAGE D. FSEC من سرت بالفاعلات التالية إعادة. تم استخدام مضان من بقايا التربتوفان للكشف سرت (الإثارة: 280 نانومتر. الانبعاث: 335 نانومتر). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> الشكل 4: تحليل الممثل سرت الأجسام المضادة A. فحص الأجسام المضادة التي كتبها لطخة غربية. تم تطبيق ما يقرب من 1 ميكروغرام من CC سرت مع أو بدون GFP إلى 4-15٪ SDS-هلام PAGE ونشف على غشاء النيتروسليلوز. تم الكشف عن ملزم باستخدام الأجسام المضادة الماعز المضادة للماوس مترافق إلى الأشعة تحت الحمراء صبغ. 2G4 و10F2 هي الغربي الإيجابي. ب. ملزمة من الأجسام المضادة إلى 100 نانومتر سرت الموسومة GFP والكشف عن طريق FSEC الكشف باستخدام GFP مضان. C. تجليد فابز المحدد إلى 100 نانومتر سرت GFP الموسومة في وجود 1 ملي السيروتونين. د. تجليد 8A11 أو 15B8 فابز إلى سرت-8B6 فاب. قمم صغيرة يبلغ حجمه في 18 مل هي GFP مجانا. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> الرقم 5: تنقية التمثيلية لل8B6 فاب من خلايا Sf9 و. لاحظ التعريف شطف عند 280 نانومتر لتنقية 8B6 فاب صاحب العلامة تقارب chromatograp<html> اتش واى. يمثل أثر الأخضر تركيز إميدازول 0-50٪ (0-250 ملم) ب. غير الحد والحد من هلام SDS-PAGE بعد تنقية تقارب صاحب العلامة. البروتين الذي يمتد نحو 50 كيلو دالتون غير قابلة للتخفيض فاب (#) والأنواع الثانوية في 25 يتم تقليل كيلو دالتون فاب (*). C. لاحظ التعريف شطف عند 280 نانومتر لتنقية 8B6 فاب عن طريق تبادل الأيونات الموجبة التي تظهر ذروة متناظرة واحدة التي elutes تحت الانحدار الخطي كلوريد الصوديوم. يمثل أثر الأخضر تركيز كلوريد الصوديوم، 0 - 100٪. (0-500 ملم) D. تحليل 8B6 فاب على 12.5٪ هلام SDS-PAGE التالية تنقية عن طريق تبادل الأيونات الموجبة. E. ملزمة لل8B6 فاب إلى 10 نانومتر سرت الموسومة GFP، الكشف عن استخدام مضان GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> ه 6 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; الشكل 6: ممثل جل الترشيح اللوني للمجمع سرت-8B6 في وجود S -citalopram و. جل الشخصي الترشيح شطف من تنقية مجمع سرت-8B6. ذروة الرئيسي يبلغ حجمه عند 11.5 مل هو مجمع سرت-8B6. الذروة في 15-17 مل تحتوي GFP وفاب B. تحليل مجمع سرت-8B6 النقي على 4-15٪ هلام SDS-PAGE. وتظهر مواقف سرت وقيوده الثقيلة والخفيفة من فاب من قبل شرطة. C. FSEC من الكسور مفصولة الحجم. تم الكشف عن المجمعات سرت-8B6 باستخدام مضان التربتوفان. جزء 17 يحتوي على كمية أكبر من سرت التي لم معقدة مع فاب. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 7"SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; الرقم 7: بلورة مجمع سرت-8B6 ملزمة لS -citalopram و. المجهر الضوئي من متوازي شكل بلورات من مجمع سرت-8B6 بعد 2 أسابيع من النمو. شريط مقياس يساوي 200 ميكرون. ب. بلورات سرت-8B6 حيد الضوء والأشعة السينية إلى 3.15 Å. وتمثل حلقة زرقاء 3.15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الجدول 1: شاشة بلورة لمجمع سرت-8B6 ملزمة لS -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

توضح هذه المخطوطة كيفية كشف عن thermostabilizing الطفرات، وتنقية نقل السيروتونين البشري، وتوليد الأجسام المضادة تقارب عالية، وبلورة السيروتونين نقل الأجسام المضادة مجمع منضمة إلى اكتئاب المخدرات S -citalopram. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة النقل الأخرى الصعبة الغشاء، المستقبلات، وقنوات.

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

15.0K Views.  Oregon Health & Science University.  توضح هذه المخطوطة كيفية كشف عن thermostabilizing الطفرات، وتنقية نقل السيروتونين البشري، وتوليد الأجسام المضادة تقارب عالية، وبلورة السيروتونين نقل الأجسام المضادة مجمع منضمة إلى اكتئاب المخدرات S -citalopram. ويمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة ا...

Video: Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

تعبير البروتين المؤتلف، التبلور، والدراسات البيوفيزيائية ل<em&gt; العصوية</em&gt; -conserved النيوكليوتيد بيروفوسفوريلاس، بكمازغ

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

التعبير وتنقية TRPC3 الإنسان حساسة للدهن قناة الأيونات الموجبة للتصميم الهيكلي بالفحص المجهري واحد-الجسيمات Cryo-إلكترون

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

التعبير، سولوبيليزيشن، وتنقية من الناقلين بورات حقيقية النواة

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

استراتيجيات لشفط وتنقية ناقلات المذاب الناقل

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

تسليط الضوء على المؤلف: التعبير عن ناقلات ناقلات المذاب البشرية وتنقيتها باستخدام الجينات المحسنة للكودون 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

التعبير عالي الإنتاجية وتنقية ناقلات المذاب البشري للدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Immunology and Infection

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Thermostabilization والتعبير وتنقية، وتبلور من السيروتونين الناقل الإنسان ملزمة ل

Summary

Explore More Videos

PLAYLIST