Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

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The authors have nothing to disclose.

Determinazione della struttura delle proteine di membrana con tecniche biofisiche rimane un&#39;impresa scoraggiante per molti trasportatori clinicamente significativi, recettori e canali 11. Qui condividiamo esperienza dettagliata sviluppato per la determinazione della struttura del trasportatore della serotonina umano legato a S -citalopram. Prevediamo che questi metodi saranno utili per determinare strutture di SERT in altri stati conformazionale, nonché strutture di altre proteine ​​di membrana difficili. Inoltre, le tecniche biochimiche descritte qui possono essere utilizzati anche per la funzione di SERT purificata detersivo e un ambiente lipidico quasi native studiare. SERT cristallizzazione incernierato sullo sviluppo di diversi strumenti e tecniche. In primo luogo, i miglioramenti nel trasportatore stabilità termica prodotte varianti SERT che sono stati ben educati in varie micelle detergenti Dopo l&#39;estrazione del trasportatore dalle membrane 6. In secondo luogo, l&#39;usodel -citalopram ad alta affinità ligando S in tutta la purificazione e cristallizzazione ulteriormente migliorato la stabilità e ridurre l&#39;eterogeneità conformazionale. In terzo luogo, lo sviluppo del sistema di espressione BacMam 7 consentito per la produzione di grandi quantità di SERT in un breve periodo di 2 settimane, facilitando sia l&#39;immunizzazione e cristallizzazione. Infine, lo sviluppo di strategie per selezionare gli anticorpi ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D consentiti per la scoperta di anticorpi 8B6 che promuove imballaggio ben ordinata di complessi SERT-anticorpo in cristalli. Ci sono un certo numero di passaggi critici e reagenti nonché problemi comuni che spesso si verificano durante il protocollo. In primo luogo, la generazione di alta titolo virale SERT P2 può essere problematico. Aggiunta di basse concentrazioni di virus P1 per generare virus P2 come descritto in questo protocollo solito attenua questo problema, e nei casi in cui il titolo del virus P2 è bassa, virus P3 può essere fatta usinvirus g ad una MOI di 0,0001. I virus con un titolo inferiore a 1 x 10 8 particelle virali / ml non devono essere utilizzati e quasi sempre luogo a basse rese di proteine. Per l&#39;espressione, HEK293S GnTI - le cellule sono stati scelti in quanto mancano N -acetylglucosaminyltransferase I attività e, quindi, non può sintetizzare complessi -glycans N, invece produrre solo alta mannosio N -glycans. Unirà Endoh N linked glicosilazione di alte glicani mannosio in due siti a ciclo extracellulare 2 (EL2), lasciando un -acetylglucosamine N attaccato al asparagina. Digestione di N -linked zuccheri riduce l&#39;entropia superficie EL2 che rischia importante per la cristallizzazione. Per la generazione di anticorpi, il SERT IC deve essere utilizzato per l&#39;immunizzazione. GFP è altamente immunogenica 12 e non deve essere utilizzato come tag di fusione per generare anticorpi poiché è difficile da rimuovere completamente SEC. La N- flessibile e C-terminale di SERT anche non eranoincluso nel costrutto per evitare anticorpi contro queste regioni. I topi possono essere immunizzati con 30 mcg di proteine ​​ricostituita; continuare topi immunizzanti fino elevate concentrazioni sieriche di anticorpi possono essere rilevati e produrre cellule ibridomi come descritto 13. Un costrutto termostabilizzato è di solito la scelta migliore per l&#39;immunizzazione; se il trasportatore è ben educati e mantiene l&#39;attività biologica dopo la purificazione, questo è spesso sufficiente a sollevare gli anticorpi. L&#39;anticorpo 8B6 è stata sollevata contro WT SERT. Per cristallizzazione, solo le frazioni di picco da SEC contenenti complesso monodisperse come giudicato da FSEC dovrebbero essere combinati e concentrati. cristalli SERT-8B6 crescono in una ristretta gamma di condizioni e ci sono una serie di passaggi che dovrebbero essere adottate per risolvere i problemi specificamente legati alla crescita dei cristalli SERT. Tris base regolato con HCl non deve essere usato nella soluzione serbatoio, poiché questo buffer non supporta la crescita di cristalli; è quindi critico utilizzare al posto di Tris regolato con NaOH. cristalli SERT crescere in un intervallo di concentrazione ristretta di PEG 400, quindi se i cristalli non crescono o in presenza di tanti piccoli cristalli, sarebbe consigliato anche un piccolo aumento o una diminuzione della concentrazione di PEG 400. Inoltre, l&#39;acido additivo 6-amminoesanoico è stato utilizzato anche nella schermata ottimizzata per migliorare nucleazione. Il rapporto goccia di proteine: soluzione bene è anche un fattore determinante per la crescita dei cristalli. Goccia rapporti di 1,5 - 2: 1 sono raccomandati, con rapporti goccia più vicino a 2: 1 tipicamente sostenere la crescita di cristalli più grandi 3-dimensionale. Infine, l&#39;uso di basso profilo piastre da 24 pozzetti è anche fondamentale verso la crescita dei cristalli, presumibilmente a causa di modifiche del tasso di diffusione del vapore. Un approccio alternativo al metodo SPA è stato sviluppato per schermo per i mutanti che stabilizzano il trasportatore della serotonina topo in una conformazione di cocaina-bound utilizzando un filtro saggio di 5 vincolante. Per contro, il ba SPAsaggio SED consente di passi sequenziali di riscaldamento seguito da determinazione della frazione di SERT, che rimane legato al ligando. Così, questo consente la rapida determinazione della temperatura di fusione da un piccolo numero di campioni. Il metodo SPA si basa sulla disponibilità di un radiomarcato ligando ad alta affinità e se non sono noti ligandi che legano con affinità submicromolari allora sarà necessario un approccio alternativo. Molti altri metodi sono comunemente usati per misurare la stabilità della proteina come legame di coloranti fluorescenti e calorimetria 14, ma sono a basso throughput e sono sia in grado di misurare direttamente la funzione o richiedono grandi quantità di proteine. Se non è possibile utilizzare il metodo SPA, un approccio alternativo ad alta produttività è un FSEC basato termostabilità Assay 15 (FSEC-TS), dove il campione viene riscaldato seguita dalla separazione della frazione del trasportatore rimanente. FSEC-TS è un approccio utile per accedere comportamento cromatografico e lo stato oligomerico ed è apstrumento complementare owerful che può essere utilizzato insieme al metodo di SPA. Un confronto tra i vari sistemi di espressione della proteina comune è stato anche trovato per favorire l&#39;uso di cellule di mammifero per l&#39;espressione del SERT 16 e non sorprende questo è probabile che il caso di molte proteine di origine mammifera. I metodi che abbiamo usato per l&#39;espressione sono stati adattati per il SERT, ma è probabile facilmente adattabile. Condizioni che favoriscono alti livelli di espressione devono essere attentamente identificati variando il tempo di espressione, temperatura, concentrazione di virus, e la presenza di inibitori delle istone deacetilasi quali butirrato di sodio. In genere privilegiamo purificazione di affinità in un detergente a catena lunga come C12M insieme con CHS prima della ricostituzione di mantenere alta affinità di legame ligando. Ricostituzione mediante assorbimento idrofoba è una tecnica mite che abbiamo trovato per essere efficace per molti altri trasportatori e recettori. Se questonon ha esito positivo, la rimozione di detergenti con elevate concentrazioni micellari critiche per dialisi, diluizione o SEC può essere impiegato 17 purché l&#39;antigene è sufficientemente stabile in tali detergenti. Nei casi in cui non vengono rilevati anticorpi adeguati, abbiamo quasi sempre il problema è dovuto alla perdita di funzione o denaturazione dell&#39;antigene e in tali casi ci eseguita con successo nuove vaccinazioni con particolare attenzione alla biochimica delle proteine. Infine, leganti e anticorpi che si legano con alta affinità dovrebbero costituire la base per un esperimento di cristallizzazione razionalmente pianificata e sfruttando una variante termostabile, si può programmare una più ampia gamma di condizioni variando le proprietà dei diversi detergenti. Inoltre, la cristallizzazione in un mesofase lipidico 18 o utilizzando bicelle 19 dovrebbero sempre essere considerati come alternativa alla cristallizzazione in micelle. Questi principi e metodi possono essere utilizzati con una certa modificationi per molte altre proteine ​​transmembrana che sono difficili da esprimere e purificare da altri host di espressione, e sarà particolarmente utile per la determinazione della struttura dei bersagli di farmaci ad alta affinità.

Il trasportatore della serotonina (SERT) è una proteina di membrana integrale che facilita il trasporto della serotonina attraverso le membrane cellulari 1. SERT appartiene ad una famiglia di neurotrasmettitori sodio Symporters (SSN), che comprende anche la dopamina e noradrenalina trasportatori 2. SERT è il bersaglio molecolare di antidepressivi e anti-ansia farmaci ampiamente prescritti che agiscono per inibire in modo competitivo il trasporto della serotonina 3. SERT sfrutta il cotrasporto energeticamente favorevole di sodio per rimuovere neurotrasmettitore dalla fessura sinaptica. Caratterizzazione estesa del sistema serotoninergico ha dimostrato che i cambiamenti nel metabolismo della serotonina sembrano influenzare praticamente tutti i processi neurologici, tra cui umore, il sonno, il dolore, la cognizione, e l&#39;aggressione comportamenti 4. Funzione SERT può essere modificato attraverso l&#39;uso di antidepressivi e selettivo della ricaptazione della serotonina (SSRI), come S -citalopram, nonché da psychostimulanti e farmaci di dipendenza come l&#39;anfetamina e -methylamphetamine N 3,4-methylenedioxy- o &quot;ecstasy&quot; 1,2. SSRI sono estremamente importanti per il trattamento di disturbi dell&#39;umore, ma la base strutturale preciso per la loro azione non è ben compreso. WT SERT è instabile in micelle detergenti, impedendo in tal modo il progresso verso una (3D) struttura tridimensionale del SERT 5,6. Recentemente, abbiamo sviluppato varianti di SERT, che sono robusta stabile in una vasta gamma di detergenti e mantenere l&#39;attività SSRI 6 vincolante. Queste varianti SERT termostabili sono stati selezionati usando un test stabilità termica a base di prossimità scintillazione. Qui si descrive un procedimento per la generazione di anticorpi ad alta affinità che possono legarsi SERT e la purificazione e cristallizzazione di SERT termostabile, in complesso con l&#39;anticorpo e S -citalopram. Questo protocollo presuppone che il SERT e 8B6 geni sono stati successoy clonato in vettori BacMam 7 e insetti di espressione, rispettivamente. Per generare anticorpi, cDNA codificante residui 73-616 di WT SERT è stato clonato in vettore BacMam con un Strep II tag C-terminale (SERT IC). Per la schermata termostabilità, residui SERT 73-616 con GFP C-terminale, Strep II, e 10-His tag (SERT TC) è stato utilizzato. Mutazioni puntiformi individuali sono stati generati in background SERT TC. Per il protocollo di cristallizzazione, la proteina di fusione SERT-GFP è stato utilizzato con TWIN-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] e 10-Le sue etichette, portando i mutanti termostabili, Y110A, I291A, e T439S e le mutazioni di cisteine superficie C554A, C580A e C622A (SERT CC). Sequenze trombina scissione (LVPRGS) sono stati anche inseriti nel SERT CC dopo Q76 e T618 per consentire la rimozione della N- e C-termini. Il plasmide codificante la 8B6 Fab è stato progettato per esprimere sia il pesante e leggeracatene dell&#39;anticorpo con GP67 sequenze secrezione sotto il controllo di due promotori poliedrina separati. Il C-terminale della catena pesante dell&#39;anticorpo 8B6 è stato etichettato con un 8-His tag e un sito di trombina scissione è stato inserito tra la catena pesante e il tag.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Cation exchanger used for Fab purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-well VDXm plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm coverslips</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virus counter</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-well scintillation counter</td></tr><tr><td>HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Il trasportatore della serotonina è un trasportatore di sodio e cloruro-coupled che &quot;pompe&quot; serotonina extracellulare in cellule. S -citalopram è un farmaco usato per trattare la depressione e l&#39;ansia legandosi al trasportatore della serotonina con alta affinità, il blocco della ricaptazione della serotonina. Qui riportiamo una procedura efficace e una serie di strumenti per stabilizzare, espresso, purificare, e cristallizzare serotonina complessi trasportatore-anticorpo legato a S -citalopram e altri antidepressivi. Le mutazioni che stabilizzano il trasportatore della serotonina sono stati identificati usando un saggio di legame -citalopram S. Trasportatore della serotonina espressa in baculovirus-trasdotte HEK293S GnTI - cellule, è stata ricostituita in proteoliposomi e utilizzato per aumentare gli anticorpi ad alta affinità. Abbiamo sviluppato una strategia per scoprire anticorpi che sono utili per studi strutturali. è stato anche istituito un approccio diretto per l&#39;espressione di frammenti di anticorpi nelle cellule Sf9.Complessi Transporter-anticorpo purificato mediante questa procedura sono ben educati e facilmente cristallizzano, la produzione di complessi con S -citalopram che diffract raggi X per 3-4 risoluzione A. Le strategie sviluppate qui possono essere utilizzati per determinare la struttura di altre proteine ​​di membrana impegnativi.

Una libreria di mutanti puntiformi nei precedenti SERT TC è stato creato allo schermo per thermostabilizing mutazioni. mutanti individuali sono stati generati utilizzando mutagenesi standard. Il protocollo di screening utilizza trasfettate cellule HEK293S e uno schermo stabilità termica a base di vicinanza scintillazione all&#39;identità rapidamente mutazioni utili per la cristallizzazione come illustrato nella figura 1A. I valori di tracciato Tm rispetto al limite [3 H] citalopram a temperatura ambiente rivela costruzioni con elevati livelli di termostabilità e di espressione adatti per la purificazione della proteina (Figura 1B). Tre mutanti (Y110A, I291A, e T439S) sono stati combinati per generare una costruzione altamente stabile (Figura 1C). Termostabilità è anche correlata con una maggiore stabilità in brevi detergenti catena necessari per la cristallizzazione del complesso SERT-Fab. L&#39;espressione su larga scala di SERT umano per mezzo di baculovirus-TRansduced HEK293S GnTI - cellule può richiedere meno di 2 settimane e può produrre quantità milligrammo, come illustrato nella Figura 2A. Uso della proteina SERT CC GFP-tagged permette SERT essere convenientemente seguita durante espressione e purificazione mediante fluorescenza (Figura 2B). La nostra strategia di purificazione coinvolto 1) solubilizzazione del SERT legato a S -citalopram da HEK293S GnTI - cellule in C12M in presenza di CHS come un lipide di stabilizzazione; 2) legame di SERT ad una matrice di affinità Strep; 3) la rimozione delle proteine ​​contaminanti da ampi lavaggio; e 4) eluizione del SERT funzionale con tampone contenente desthiobiotin (Figura 2C). La proteina eluita è in gran parte privo di altre proteine rilevabili di Coomassie blu colorazione e monodisperse come giudicato da FSEC (Figura 2D, E). Una strategia simile è stata presa per purificare SERT con un tag Strep II che è stato utilizzato per reconstitution e l&#39;immunizzazione (Figura 3A, B). L&#39;incorporazione di SERT nel proteoliposomi aumenta la emivita plasmatica e la stabilità del SERT e migliora la probabilità di isolamento di anticorpi ad alta affinità. Inoltre, l&#39;inclusione di lipide A, un componente della parete cellulare batterica, serve come un potente adiuvante 9. liposomi multilamellari sono stati preparati con l&#39;aggiunta di tampone ad una miscela di lipidi essiccati in tubi di vetro e risospese in tampone. Estrusione dei liposomi attraverso filtri di dimensione dei pori 200 nm produce monodisperse sospensioni liposomiali unilamellari. I liposomi vengono poi saturati con detergente seguita dall&#39;aggiunta di SERT purificato detergente. Infine, il detersivo viene rimosso mediante aggiunta di resina di assorbimento idrofoba al lipide: miscela detergente. Ulteriori ligando deve essere aggiunto al campione ricostituito per selezionare gli anticorpi che riconoscono la conformazione legato antidepressivo. La presenza dei SERT nelle proteoliposomi deve essere confermata dasolubilizzare un piccolo campione con SDS-PAGE carico dye o C12M e in esecuzione su SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D). linee cellulari derivate da ibridomi che esprimono anticorpi SERT possono essere sottoposti a screening per leganti ad alta affinità che riconoscono epitopi 3D. Queste proprietà sono cruciali per il successo finale di cristallizzazione, come l&#39;anticorpo deve rimanere saldamente legato a una regione strutturato per promuovere imballaggio di cristallo di omogenei, domini ben ordinate. Nella prima fase, vengono identificati anticorpi che riconoscono regioni non strutturati. SERT è denaturato e cancellato su una membrana di nitrocellulosa; anticorpi che si fissano SERT denaturato saranno occidentale-positivi e probabilmente riconoscere epitopi lineari. Nella Figura 4A, mostriamo 2 esempi di anticorpi che sono occidentali-positivi e probabilmente non utile a promuovere crystallogenesis. Nella Figura 4B, i restanti anticorpi occidentale-negativi vengono incubate con 100 nM SERT-GFP e separati daFSEC. Gli anticorpi che si legano SERT si sposterà il picco GFP-positivi ad una posizione precedente. I complessi SERT-anticorpo può essere diluito ulteriormente in un detergente per determinare se essi possono legarsi con affinità nanomolari seguita da analisi da FSEC. Aggiunta di risultati serotonina a cambiamenti conformazionali il trasportatore e quindi gli anticorpi possono essere nuovo controllo per determinare se possono riconosce specificamente la conformazione SSRI-bound. In Figura 4C, gli anticorpi sono mostrati di impegnare SERT in presenza di serotonina, dimostrando che l&#39;epitopo (s) non cambiano dal SSRI al substrato stato legato. Infine, nella Figura 4D combinazioni di anticorpi sono testati per la loro capacità di legare epitopi distinti, determinando un ulteriore spostamento verso sinistra. Qui il 15B8 o 8A11 anticorpi riconoscono un epitopo che è diverso da 8B6. L&#39;anticorpo 8B6 è stato scelto per ulteriori analisi strutturale basato sullo screening di cristallo preliminare con papaina treaTed Fab. I geni della 8B6 Fab sono stati clonati in un insetto vettore di espressione cellulare. Fab può essere espresso e secreto dalle cellule Sf9 crescono in sospensione. Il 8B6 Fab può essere purificato dal surnatante delle cellule Sf9 da His-tag affinità (Figura 5A, B) e la cromatografia a scambio cationico (Figura 5C, D) con conseguente proteina che appare privo di contaminanti su gel SDS-PAGE. Nella Figura 5E, ricombinante 8B6 Fab è mostrato di legarsi SERT e viene utilizzato in successivi esperimenti biochimici e biofisici. L&#39;affinità purificato SERT CC viene digerito con trombina e Endoh e miscelato con 8B6 Fab per formare un complesso in presenza di S -citalopram. Il complesso transporter-anticorpo viene quindi separato dalla SEC in C8M (Figura 6A) e le frazioni di picco contiene sia SERT e Fab come mostrato mediante SDS-PAGE (Figura 6B). Uso di C8M è cruciale per la formazione di cristalli probabilmente perchéil detersivo catena corta permette una migliore imballaggio tra le molecole nel reticolo cristallino. FSEC è impiegato per determinare quale frazioni devono essere aggregate per la cristallizzazione (figura 6C); frazioni che non sono monodisperse e / o contengono grandi quantità di SERT libero o Fab non dovrebbero essere combinati. Prism cristalli SERT-anticorpo forma possono essere coltivate in presenza di S -citalopram utilizzare questo protocollo per impiccagione diffusione del vapore goccia (Figura 7A). I cristalli risultanti diffrangono i raggi X per una risoluzione di 3,15 Å 10 (Figura 7B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figura 1: scintillazione di prossimità basati termostabilità Assay A.. Sommario del protocollo per lo screening termostabilità in presenza di [3 H] citalopram. B. Massima bound [3 </sup&gt; H] citalopram in funzione della temperatura di fusione apparente (Tm). Le linee tratteggiate rappresentano i valori per il trasportatore WT. I 3 mutanti più termostabili sono etichettati. Zona grigia rappresenta mutanti che hanno meno del 10% di [3 H] citalopram rispetto al WT e valori Tm così imprecise vincolante causa di un basso. C segnale-rumore. Curve termostabilità per WT SERT TC e le prime 3 mutanti. Barre di errore rappresentano la deviazione standard (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figura 2: Panoramica dei mammiferi eterologa espressione della proteina A.. Panoramica schematizzato della generazione di virus BacMam ed espressione di SERT in HEK293S GnTI -. Le cellule B. HEK293S GnTI - cellule che esprimono il SERT CC (fluorescenza GFP) C.. Profilo di eluizione del SERT CC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 mm) D.. Analisi di affinità purificato SERT CC su 4 - gel 15% SDS-PAGE E.. FSEC di affinità purificato SERT CC rilevato da GFP fluorescenza (eccitazione: 480 nm; emissione: 510 nm). Il picco eluizione a 15 mL è SERT (#) e 18 ml è GFP gratuita (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentante affinità purificazione e Ricostituzione del SERT IC.. Schema di generazione di anticorpi. &lt;strong&gt; B. Profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione per affinità di SERT IC di resina di affinità Strep. Verde traccia rappresenta la concentrazione di desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 mm) C. Analisi di affinità purificato e ricostituito SERT su un 4 - gel 15% SDS-PAGE D.. FSEC di SERT solubilizzato dopo la ricostituzione. La fluorescenza dei residui di triptofano è stato utilizzato per rilevare SERT (Eccitazione: 280 nm; emissione: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figura 4:. Analisi dei rappresentanti SERT anticorpi A. Lo screening di anticorpi da Western Blot. Circa 1 mg di SERT CC con o senza GFP è stato applicato ad un 4 - 15% SDSgel PAGE e cancellato su una membrana di nitrocellulosa. Binding è stato rilevato utilizzando un anticorpo di capra anti-topo coniugata con IR Dye. 2G4 e 10F2 sono occidentali positivo. B. Il legame di anticorpi a 100 nM SERT GFP-tagged e l&#39;individuazione da FSEC rilevato utilizzando GFP fluorescenza. C. Il legame di Fabs selezionati e 100 nm SERT GFP-tagged in presenza di 1 mm serotonina. D. Il legame di 8A11 o 15B8 Fabs al Sert-8B6 Fab. Picchi minori eluizione a 18 mL sono GFP gratuito. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figura 5: Purificazione Rappresentante del 8B6 Fab da cellule Sf9 A.. profilo di eluizione osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab da His-tag affinità chromatograp<html> hy. Verde traccia rappresenta la concentrazione di imidazolo, 0 - 50% (0 - 250 mm) B.. Non riducente e riducendo gel SDS-PAGE dopo His-tag purificazione di affinità. Proteine che corre vicino a 50 kDa non è ridotta Fab (#) e specie minori a 25 kDa è ridotta Fab (*). C. profilo Elution osservata a 280 nm della purificazione del 8B6 Fab mediante scambio cationico visualizzando un singolo picco simmetrico che eluisce con un gradiente di cloruro di sodio lineare. Verde traccia rappresenta la concentrazione di NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mm) D. Analisi della 8B6 Fab su un gel SDS-PAGE 12,5% dopo purificazione mediante scambio cationico. E. Binding della 8B6 Fab 10 Nm SERT GFP-tagged, rilevato utilizzando la fluorescenza della GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6: Rappresentante del gel filtrazione Cromatografia del Complesso SERT-8B6 in presenza di S -citalopram A.. Gel profilo filtrazione eluizione di purificato complesso SERT-8B6. cima principale eluizione a 11,5 mL è il complesso SERT-8B6. Picco a 15 - 17 ml contiene GFP e Fab B.. Analisi del purificato complesso SERT-8B6 su un 4 - gel SDS-PAGE 15%. Le posizioni dei SERT e le catene pesanti e leggere dei Fab sono indicati da un trattino. C. FSEC delle frazioni di dimensioni separate. complessi SERT-8B6 sono stati rilevati utilizzando la fluorescenza del triptofano. Frazione 17 contiene una quantità maggiore di SERT che non ha complesso con Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7: La cristallizzazione del Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. La microscopia ottica di parallelepipedo cristalli a forma del complesso SERT-8B6 dopo 2 settimane di crescita. Barra della scala è uguale a 200 micron. B. cristalli SERT-8B6 diffrangono i raggi X per 3.15 Å. anello blu rappresenta 3.15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Tabella 1:. Una schermata di cristallizzazione per il Complesso SERT-8B6 Bound to S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Cliccate qui per scaricare questa tabella.</a>

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Questo manoscritto descrive come schermo per thermostabilizing mutazioni, purificare il trasportatore della serotonina umano, generare anticorpi ad alta affinità, e cristallizzare il complesso trasportatore della serotonina-anticorpo legato alla antidepressivo della droga S -citalopram. Questo protocollo può essere adattato allo studio di altri trasportatori di membrana impegnativi, recettori e canali.

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

15.0K Views.  Oregon Health & Science University.  Questo manoscritto descrive come schermo per thermostabilizing mutazioni, purificare il trasportatore della serotonina umano, generare anticorpi ad alta affinità, e cristallizzare il complesso trasportatore della serotonina-anticorpo legato alla antidepressivo della droga S -citalopram. Questo protocollo può essere adattato allo studio di altri trasportatori di membrana impegnativi, recettori e canali. 

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Ricerca

Biochimica

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

Espressione proteica ricombinante, cristallizzazione e studi biofisici di a<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservato nucleotide pirofosforilasi, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

Mutagenesi PCR, clonazione, espressione, protocolli di purificazione rapida delle proteine e cristallizzazione del tipo selvatico e delle forme mutanti di triptofano sintasi

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Strategie per l'espressione e la purificazione dei trasportatori di soluti

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autore in primo piano: Espressione e purificazione di trasportatori di soluti umani utilizzando geni ottimizzati per i codoni 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Espressione e purificazione ad alto rendimento di vettori di soluti umani per studi strutturali e biochimici

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Immunologia e infezioni

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a

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