Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
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We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bestimmung der Membranproteinstruktur durch biophysikalische Techniken wie vor eine schwierige Organismus für viele medizinisch signifikante Transporter, Rezeptoren und Kanälen 11. Hier haben wir detaillierte Know - how für die Strukturbestimmung des menschlichen Serotonintransporter zu S -Citalopram gebunden entwickelt teilen. Wir gehen davon aus, dass diese Methoden nützlich sein werden Strukturen von SERT in anderen Konformationen sowie Strukturen anderer schwer Membranproteine ​​zu bestimmen. Darüber hinaus hier beschriebenen biochemischen Techniken können auch in Wasch- und einer nahezu nativen Lipidumgebung zu studieren Funktion von gereinigtem SERT verwendet werden. SERT Kristallisation angelenkt auf der Entwicklung verschiedener Werkzeuge und Techniken. Erste Verbesserungen der Transporter thermische Stabilität erzeugt SERT - Varianten , die in verschiedenen Detergensmicellen nach der Extraktion des Transporters aus Membranen 6 gut erzogene wurden. Zweitens ist die Verwendungdes hochaffinen Liganden S -Citalopram gesamten Reinigung und Kristallisation weiter verbesserte Stabilität und verringerte Konformationsheterogenität. Drittens, die Entwicklung des BacMam Expressionssystem 7 für die Produktion von großen Mengen an SERT in einem kurzen Zeitraum von 2 Wochen erlaubt, sowohl die Immunisierung und die Kristallisation zu erleichtern. Schließlich wählen die Entwicklung von Strategien für die hochaffine Antikörper, die für die Entdeckung des 8B6-Antikörpers erlaubt 3D-Epitope erkennen, die gut geordnete Packung von SERT-Antikörper-Komplexe in Kristalle fördert. Es gibt eine Reihe von kritischen Schritte und Reagenzien sowie gemeinsame Probleme, die häufig während des gesamten Protokolls auftreten. Erstens kann die Erzeugung hoher Titer SERT P2 Virus problematisch sein. Zugabe von niedrigen Konzentrationen von P1 P2 Virus Virus zu erzeugen, wie in diesem Protokoll beschrieben mildert dieses Problem normalerweise, und in Fällen, in denen der P2 Virustiter niedrig ist, kann P3 Virus usin gemacht werdeng-Virus bei einer MOI von 0,0001. Viren mit einem Titer von weniger als 1 x 10 8 Viruspartikel / ml verwendet werden soll und in geringen Proteinausbeuten fast immer führen wird. Für die Expression HEK293s GnTI- - wurden die Zellen , da sie N -Acetylglucosaminyltransferaseaktivität I - Aktivität fehlt gewählt und somit nicht komplexe N - Glycane synthetisieren kann, statt nur eine hohe Mannose N - Glycane produzieren. EndoH spaltet N -verknüpftem Glykosylierung von hoher Mannose Glykane an zwei Standorten in extrazellulären Schleife 2 (EL2), ein N Acetylglucosamin an Asparagin gebunden zu verlassen. Die Verdauung von N -verknüpftem Zucker Oberfläche Entropie von EL2 reduziert , die für die Kristallisation wahrscheinlich wichtig ist. Für die Erzeugung von Antikörpern sollte die SERT IC für die Immunisierung verwendet werden. GFP ist in hohem Maße immunogen 12 und sollte nicht als Fusions - Tag verwendet werden , um Antikörper zu erzeugen , da es schwierig ist, vollständig durch SEC entfernen. Die flexible N- und C-Terminus von SERT waren auch nichtin dem Konstrukt enthalten, um Antikörper gegen diese Regionen zu vermeiden. Mäuse mit 30 ug rekonstituierten Protein immunisiert werden; weiterhin Mäuse bis hohe Serumkonzentrationen von Antikörpern erkannt werden können und erzeugen Hybridomzellen , wie 13 immunisieren. Ein thermostabilized Konstrukt ist in der Regel die beste Wahl für die Immunisierung; wenn der Transport gut erzogene und behält die biologische Aktivität nach der Reinigung, das ist oft ausreichend, um Antikörper zu erzeugen. Die 8B6-Antikörper wurde gegen WT SERT erhöht. Zur Kristallisation monodisperse Komplex nur die Spitzenfraktionen von SEC enthält, wie durch FSEC beurteilt sollte vereinigt und eingeengt werden. SERT-8B6 Kristalle wachsen in einem engen Bereich von Bedingungen und es gibt eine Reihe von Schritten, die ergriffen werden sollten, Probleme speziell auf SERT Kristallwachstum im Zusammenhang zu beheben. Tris-Base mit HCl eingestellt, sollte nicht in der Reservoirlösung verwendet werden, da dieser Puffer nicht das Kristallwachstum nicht unterstützt; es ist somit critischen anstelle Tris mit NaOH verwenden. SERT Kristalle wachsen in einem engen Konzentrationsbereich von PEG 400, so dass, wenn Kristalle wachsen nicht, oder wenn viele kleine Kristalle beobachtet werden, sogar eine kleine Zunahme oder Abnahme in der PEG 400-Konzentration würde beraten. Weiterhin wurde die additive 6-Aminohexansäure auch im optimierten Bildschirm verwendet Nukleation zu verbessern. Die Drop-Verhältnis von Protein: gut Lösung ist auch ein wichtiger Faktor für das Kristallwachstum zu bestimmen. Drop-Verhältnisse von 1,5 bis 2: 1 empfohlen, mit Drop-Verhältnisse näher an 2: 1 normalerweise das Wachstum größerer 3-dimensional Kristalle unterstützen. Schließlich ist die Verwendung von Low-Profile-24-Well-Platten auch entscheidend zu Kristallwachstum, was vermutlich auf Modifizierung der Rate der Dampfdiffusion. Ein alternativer Ansatz für die SPA - Verfahren wurde für Mutanten Bildschirm entwickelt , die die Ratten - Serotonin - Transporter in einer Kokain-gebundene Konformation unter Verwendung eines Filterbindungstest 5 stabilisieren. Dagegen sind die SPA baSed Assay ermöglicht sequenziellen Schritte Erhitzen durch Bestimmung des Anteils an SERT folgenden die an Liganden gebunden bleibt. Somit ermöglicht dies für die schnelle Bestimmung der Schmelztemperatur von einer kleinen Anzahl von Proben. Das SPA-Verfahren beruht auf der Verfügbarkeit eines radioaktiv markierten hochaffinen Liganden und wenn keine Liganden bekannt sind, die mit submikromolare Affinität binden dann ein alternativer Ansatz notwendig sein wird. Viele andere Methoden werden häufig zur Messung der Proteinstabilität wie Bindung von Fluoreszenzfarbstoffen und Kalorimetrie 14 , sondern sind mit niedrigem Durchsatz und sind entweder nicht in der Lage, direkt zu messen Funktion oder benötigen große Mengen an Protein eingesetzt. Wenn der SPA - Verfahren nicht verwendet werden kann, eine alternative Hochdurchsatz - Ansatz ist ein FSEC basierte Thermostabilität Assay 15 (FSEC-TS), wobei die Probe durch Abtrennen der Fraktion , gefolgt erhitzt wird transporter verbleibt. FSEC-TS ist ein nützlicher Ansatz für den Zugriff auf chromatographische Verhalten und oligomere Zustand und ist apowerful ergänzendes Instrument, das neben dem SPA-Verfahren verwendet werden können. Ein Vergleich der verschiedenen gemeinsamen Proteinexpressionssysteme wurde auch begünstigt die Verwendung von Säugetierzellen für SERT Ausdruck 16 und wenig überraschend ist dies wahrscheinlich der Fall für viele Proteine von Säugetieren gefunden. Die Methoden, die wir für die Expression verwendet wurden, für SERT zugeschnitten sind aber wahrscheinlich leicht anpassbar. Bedingungen, die hohe Expressionsniveaus begünstigen sollte sorgfältig durch Variieren der Zeit des Ausdrucks, der Temperatur, Viruskonzentration und das Vorhandensein von Histon-Deacetylase-Inhibitoren wie Natriumbutyrat identifiziert werden. Wir bevorzugen im Allgemeinen Affinitätsreinigung in einer milden Reinigungs langkettigen wie C12M zusammen mit CHS vor der Zubereitung Bindung hochaffinen Liganden zu binden. Die Rekonstitution hydrophobe Absorption unter Verwendung ist eine milde Technik, die wir gefunden haben, wirksam für mehrere andere Transporter und Rezeptoren zu sein. Ob dasnicht erfolgreich ist, kann die Entfernung von Detergenzien mit einer hohen kritischen Micellbildungskonzentrationen durch Dialyse, Verdünnung, oder SEC 17 das Antigen in solchen Waschmitteln eingesetzt ausreichend stabil bereitgestellt werden soll. In den Fällen, in denen keine geeigneten Antikörper gefunden werden, finden wir fast immer die Frage zu einem Verlust der Funktion oder Denaturierung des Antigens ist und in solchen Fällen führten wir erfolgreich neue Immunisierungen mit besonderem Augenmerk auf die Proteinbiochemie. Schließlich Liganden und Antikörper, die mit hoher Affinität binden sollte für eine rational geplante Kristallisationsexperiment bilden die Basis und durch die Ausnutzung einer thermostabilen Variante nehmen, kann man ein breiteres Spektrum von Bedingungen Bildschirm durch die Eigenschaften der verschiedenen Reinigungsmittel variiert. Weiterhin Kristallisation in einem lipiden Mesophasen 18 oder Verwendung Bicellen 19 sollte stets als Alternative zur Kristallisation in Mizellen betrachtet werden. Diese Prinzipien und Methoden können mit einigen modifi verwendet werdenKation für viele andere Transmembranproteine, die nur schwer von anderen Ausdruck Wirten zu exprimieren und zu reinigen, und besonders nützlich für die Strukturbestimmung von Zielen von hochaffinen Drogen sein.

Der Serotonintransporter (SERT) ist ein integrales Membranprotein, das den Transport von Serotonin durch Zellmembranen 1 erleichtert. SERT gehört zu einer Familie von Neurotransmitter Sodium Symporter (NSS) , die auch die 2 Dopamin und Noradrenalin - Transporter umfasst. SERT ist das molekulare Ziel von häufig verschriebenen Antidepressiva und Anti-Angst - Medikamente , die kompetitiv wirken , um Serotonin - Transport 3 hemmen. SERT nutzt die energetisch günstige cotransport Natrium Neurotransmitter aus dem synaptischen Spalt zu entfernen. Umfangreiche Charakterisierung des serotonergen Systems hat gezeigt , dass Veränderungen in der Serotonin - Stoffwechsel praktisch alle neurologischen Prozesse einschließlich Stimmung zu beeinflussen scheinen, Schlaf, Schmerz, Kognition und Aggression Verhaltensweisen 4. SERT - Funktion kann durch den Einsatz von Antidepressiva und selektive Serotonin - Wiederaufnahmehemmer (SSRI) wie S -Citalopram modifiziert werden, sowie durch psychostimulants und Drogen Sucht wie Amphetamin und 3,4-methylenedioxy- N -methylamphetamine oder &quot;Ecstasy&quot; 1,2. SSRIs sind für die Behandlung von Stimmungsstörungen enorm wichtig, doch die genaue strukturelle Basis für ihre Tätigkeit ist nicht gut verstanden. WT SERT ist in Detergens - Mizellen instabil, wodurch Fortschritt behindert zu einer dreidimensionalen (3D) Struktur SERT 5,6. Kürzlich entwickelten wir Varianten von SERT , die in einer breiten Palette von Detergentien robust stabil sind und zu halten SSRI Bindungsaktivität 6. Diese thermo SERT-Varianten wurden unter Verwendung eines Scintillation-Proximity-basierten Thermo Assay ausgewählt. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Erzeugung von hochaffinen Antikörpern , die SERT binden kann, und die Reinigung und Kristallisation von thermo SERT, im Komplex mit Antikörper und S -Citalopram. Dieses Protokoll geht davon aus, dass die SERT und 8B6 Gene erfolgreich geweseny geklont in die BacMam 7 und Insekten - Expressionsvektoren sind. Antikörper, cDNA kodierend Reste 73-616 von WT SERT erzeugt wurde mit einem C-terminalen Strep - Tag II (SERT IC) in den BacMam Vektor kloniert. Für die thermische Stabilität Bildschirm SERT Reste 73-616 mit C-terminalen GFP, Strep II und 10-His - Tags (SERT TC) verwendet. Einzelpunktmutationen wurden in der SERT TC Hintergrund erzeugt. Für die Kristallisation Protokoll wurde das SERT-GFP - Fusionsprotein mit Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] und 10-His - Tags verwendet, die thermo Mutanten Y110A, I291A und T439S und Mutationen der Oberflächen Cysteine C554A, C580A Trage und C622A (SERT CC). Thrombin - Spaltsequenzen (LVPRGS) wurden ebenfalls in den SERT CC nach Q76 und T618 zu ermöglichen Entfernung der N- und C-Termini eingesetzt. Das Plasmid, das das 8B6 Fab kodiert, wurde entwickelt, sowohl die schwere und leichte auszudrückenKetten des Antikörpers mit GP67 Sekretion Sequenzen unter der Kontrolle von zwei getrennten Polyhedrin-Promotoren. Der C-Terminus der schweren Kette des 8B6-Antikörper wurde mit einem 8-His-Tag und eine Thrombin-Spaltstelle wurde zwischen der schweren Kette und der Tag eingefügt markiert.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Cation exchanger used for Fab purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-well VDXm plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm coverslips</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virus counter</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-well scintillation counter</td></tr><tr><td>HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Der Serotonintransporter ist ein Natrium und Chlorid-gekoppelten Transporter dass &quot;pumpt&quot; extrazelluläre Serotonin in die Zellen. S -Citalopram ein Medikament verwendet , Depression und Angst zu behandeln , indem auf den Serotonin - Transporter mit hoher Affinität bindet, Serotonin - Wiederaufnahme blockiert. Hier berichten wir über ein effizientes Verfahren und eine Reihe von Werkzeugen zur Stabilisierung, Express, zu reinigen und Serotonin - Transporter-Antikörper - Komplexe zu S -Citalopram und anderen Antidepressiva gebunden kristallisieren. Mutationen , die den Serotonin - Transporter wurden stabilisieren identifiziert einen S -Citalopram Bindungsassay unter Verwendung. Serotonin - Transporter in Baculovirus-transduzierten HEK293s GnTI- - Zellen exprimiert, wurde in Proteo wiederhergestellt und verwendet hochaffinen Antikörpern zu erhöhen. Wir haben eine Strategie entwickelt, Antikörper zu entdecken, die für strukturelle Untersuchungen nützlich sind. Ein einfacher Ansatz für die Expression von Antikörperfragmenten in Sf9 Zellen wurde ebenfalls festgestellt.Transporter-Antikörper - Komplexe mit diesem Verfahren gereinigt sind gut erzogene und leicht kristallisieren, Komplexe mit S -Citalopram produzieren , die Röntgenstrahlen auf 3-4 Å Auflösung beugen. Die Strategien entwickelt hier können die Struktur anderer anspruchsMembranProteine ​​zu bestimmen, verwendet werden.

Eine Bibliothek von Einzelpunktmutationen im SERT TC Hintergrund wurde für thermostabilisierende Mutationen Bildschirm erstellt. Einzelne Mutanten wurden unter Verwendung von Standard-Mutagenese erzeugt. Das Screening - Protokoll verwendet transient HEK293s Zellen und einer Scintillation - Proximity-basierten Thermo Bildschirm schnell Identität nützliche Mutationen zur Kristallisation transfiziert , wie in 1A dargestellt. Plotting Tm - Werte im Vergleich zu gebundenen [3 H] Citalopram bei RT zeigt Konstrukte mit hoher Thermostabilität und Expressionsniveaus geeignet zur Proteinreinigung (1B). Drei Mutanten (Y110A, I291A und T439S) wurden kombiniert , um eine hochstabile Konstrukt (Abbildung 1C) zu erzeugen. Thermostabilität ist auch mit einer erhöhten Stabilität in kurzkettigen Detergentien, die für die Kristallisation des SERT-Fab-Komplex korreliert. Das groß angelegte Expression von humanen SERT unter Verwendung von Baculovirus-transduced HEK293s GnTI- - Zellen können weniger als 2 Wochen dauern und Milligramm - Mengen produzieren kann, wie in 2A dargestellt. Verwendung des GFP-markiertes SERT CC Protein ermöglicht SERT bequem während der Expression und Reinigung durch Fluoreszenz (2B) folgen. Unsere Reinigungsstrategie einbezogen 1) Solubilisierung von SERT gebunden S -Citalopram aus HEK293s GnTI- - Zellen in C12M in Gegenwart von CHS als stabilisierendes Lipid; 2) Bindung von SERT an einer Streptokokken-Affinitätsmatrix; 3) Entfernung von verunreinigenden Proteinen durch ausgiebiges Waschen; und 4) Eluieren des funktionellen SERT mit Puffer , enthaltend Desthiobiotin (Abbildung 2C). Das eluierte Protein ist im Wesentlichen frei von anderen nachweisbaren Proteine durch Coomassie - Blau - Färbung und monodisperse wie durch FSEC (2D, E) beurteilt. Es wurde eine ähnliche Strategie SERT mit einem Strep-II-Tag zu reinigen genommen, die für reconstitutio verwendet wurde,n und Immunisierung (3A, B). Einbau von SERT in Proteo erhöht die Serumhalbwertszeit und Stabilität der SERT und verbessert die Wahrscheinlichkeit der Isolierung von hochaffinen Antikörpern. Weiterhin Aufnahme von Lipid A, eine Komponente der Bakterienzellwand, dient als ein potentes Adjuvans 9. Multilamellaren Liposomen wurden durch Zugabe von Puffer zu einem getrockneten Lipidmischung in Glasröhrchen und resuspendiert in Puffer hergestellt. Extrusion der Liposomen durch 200 nm Porengröße Filter erzeugt monodisperse unilamellare liposomale Suspensionen. Die Liposome werden dann mit einem Detergens durch Zugabe von gereinigtem SERT in Detergens gefolgt gesättigt. Detergensmischung: Schließlich Waschmittel wird durch Zugabe von hydrophoben Absorptionsharzes zu dem Lipid entfernt. Zusätzliche Liganden sollte die rekonstituierte Probe hinzugefügt werden, um Antikörper zu selektieren, die das Antidepressivum gebundenen Konformation erkennen. Die Anwesenheit von SERT in den Proteo sollte bestätigt werdenSolubilisieren einer kleinen Probe mit SDS-PAGE - Beladungsfarbstoff oder C12M und läuft auf SDS-PAGE und FSEC (3C, D). Hybridomzelllinien SERT Antikörper exprimieren, können für hochaffine Bindemittel abgeschirmt werden, die 3D-Epitope erkennen. Diese Eigenschaften sind entscheidend für den späteren Erfolg der Kristallisation, wie der Antikörper muss fest mit einem strukturierten Bereich gebunden bleiben Kristallpackung von homogenen, gut geordneten Domänen zu fördern. Im ersten Schritt, Antikörper, die unstrukturierte Bereiche erkennen, werden identifiziert. SERT denaturiert aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran; Antikörper, die denaturierte SERT binden Western-positiv sein und wahrscheinlich lineare Epitope erkennen. In 4A zeigen wir zwei Beispiele von Antikörpern , die Western-positiv sind und nützlich wahrscheinlich nicht Kristallogenese zu fördern. In 4B werden die verbleibenden western negativen Antikörper werden mit 100 nM SERT-GFP inkubiert und getrennt durchFSEC. Antikörper, die SERT binden die GFP-positiven Spitze zu einer früheren Position verschieben. Die SERT-Antikörper-Komplexe können weiter in Detergens verdünnt werden, um zu bestimmen, ob sie mit nanomolarer Affinität gefolgt von Analyse durch FSEC binden kann. Zugabe von Serotonin führt zu Konformationsänderungen in dem Transporter und somit können die Antikörper gescreent werden, um zu bestimmen, ob sie spezifisch die SSRI-gebundene Konformation erkennen kann. In 4C werden die Antikörper gezeigt SERT in Gegenwart von Serotonin zu binden, was zeigt , dass das Epitop (e) nicht von der SSRI ändern gebundenen Zustand auf das Substrat. Schließlich sind in Figur 4D Kombinationen von Antikörpern auf ihre Fähigkeit getestet verschiedene Epitope zu binden, in einer weiteren Linksverschiebung führt. Hier ist der 15B8 8A11 oder Antikörper erkennen ein Epitop, das von 8B6 unterscheidet. Die 8B6-Antikörper wurde auf Basis vorläufiger Kristall-Screening mit Papain trea für weitere Strukturanalyse ausgewähltted Fab. Die Gene der 8B6 Fab wurden in einen Insektenzellen-Expressionsvektor kloniert. Fab kann von Sf9-Zellen exprimiert und sezerniert werden, wachsen in Suspension. Die 8B6 Fab kann durch His-Tag - Affinität (5A, B) und Kationenaustausch - Chromatographie (5C, D) , die sich in Protein , das aus Sf9 - Zellüberstand gereinigt werden , die auf SDS-PAGE - Gelen frei von Verunreinigungen erscheint. In 5E wird das rekombinante 8B6 Fab gezeigt SERT zu binden und wird in anschließenden biochemischen und biophysikalischen Experimenten verwendet. Die affinitätsgereinigten SERT CC ist mit Thrombin und EndoH und mit 8B6 Fab verdaut , wobei ein Komplex in Gegenwart von S -Citalopram zu bilden. Der Transporter-Antikörper - Komplex wird dann durch SEC in C8M (6A) getrennt und die Peakfraktionen sowohl SERT und Fab enthalten , wie durch SDS-PAGE (Figur 6B) gezeigt. Die Verwendung von C8M ist von entscheidender Bedeutung für die Kristallbildung wahrscheinlich, weildie kurzkettigen Waschmittel ermöglicht zwischen den Molekülen in dem Kristallgitter bessere Verpackung. FSEC eingesetzt wird , die Fraktionen zu bestimmen , sollte zur Kristallisation (6C) vereinigt werden; Fraktionen, die kombiniert werden sollten nicht monodisperse und / oder enthalten große Mengen an freien SERT oder Fab nicht. Prismenförmigen SERT-Antikörper - Kristalle können durch hängenden Tropfen Dampfdiffusion (7A) in Gegenwart von S -Citalopram Verwendung dieses Protokoll gezüchtet werden. Die resultierenden Kristalle beugen Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von 3,15 Å 10 (7B). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Abbildung 1: Scintillation Proximity-basierten Thermostabilität Assay A.. Überblick über Protokoll zum Screenen Thermostabilität in Gegenwart von [3 H] Citalopram. B. Maximale gebunden [3 </sup&gt; H] Citalopram gegen die scheinbare Schmelztemperatur (Tm). Die gepunkteten Linien stellen Werte dar, für den WT-Transporter. Die drei am meisten thermo Mutanten sind markiert. Grauzone darstellt Mutanten, die weniger als 10% von [3 H] Citalopram an WT und damit ungenau Tm - Werte aufgrund eines niedrigen Signal-zu-Rauschen. C Bindung relativ. Thermische Stabilität Kurven für WT SERT TC und den Top - 3 - Mutanten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Abbildung 2: Übersicht der Mammalian Heterologe Proteinexpression A.. Schematisierte Übersicht über BacMam Virus Generation und die Expression von SERT in HEK293s GnTI- -. Zellen B. ERK293S GnTI- - Zellen, die SERT CC (GFP - Fluoreszenz) C.. Elutionsprofil von SERT CC auf Strep Affinitätsharz. Grüne Spur stellt die Konzentration von Desthiobiotin, 0 - 100% (0 - 5 aus mM) D.. Analyse der affinitätsgereinigten SERT CC auf einem 4-15% SDS-PAGE Gel - E.. FSEC der Affinität CC gereinigte SERT durch GFP - Fluoreszenz detektiert (Anregung: 480 nm; Emission: 510 nm). Der Peak bei 15 ml eluierenden ist SERT (#) und 18 ml ist frei GFP (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Abbildung 3: Repräsentative Affinitätsreinigung und Rekonstitution des SERT IC A.. Schematische Darstellung der Antikörper-Generierung. &lt;strong&gt; B. Elutionsprofil bei 280 nm der Affinitätsreinigung von Strep SERT IC auf Affinitätsharz beobachtet. Grüne Spur stellt die Konzentration von Desthiobiotin, 0 - 100%. (0 - 5 aus mM) C. Analyse der affinitätsgereinigten und rekonstituiert SERT auf einem 4-15% SDS-PAGE Gel - D.. FSEC von gelöstem SERT nach der Rekonstitution. Die Fluoreszenz von Tryptophanresten verwendet wurde SERT zu erkennen (Anregung: 280 nm; Emission: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Abbildung 4:. Die Analyse von repräsentativen SERT Antikörper A. Screening von Antikörpern durch Western-Blot. Ungefähr 1 ug SERT CC mit oder ohne GFP wurde aufgebracht auf einen 4-15% SDS-PAGE-Gel und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Die Bindung wurde unter Verwendung eines Ziege-Antikörper Anti-Maus, konjugiert an IR-Farbstoff. 2G4 und 10F2 sind westliche positiv. B. Bindung von Antikörpern an 100 nM GFP-markiertes SERT und Detektion von FSEC detektiert GFP - Fluoreszenz verwendet wird . C. Bindung von ausgewählten Fabs zu 100 nM GFP-markiertes SERT in Gegenwart von 1 mM Serotonin. D. Die Bindung von 8A11 oder 15B8 Fabs zu SERT-8B6 Fab. Kleinere Peaks bei 18 ml eluierenden sind frei GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Abbildung 5: Repräsentative Reinigung des 8B6 - Fab aus Sf9 Zellen A.. Elutionsprofil bei 280 nm von der Reinigung des 8B6-Fab von His-Tag Affinität chromatograp beobachtet<html> hy. Grüne Spur stellt die Konzentration von Imidazol, 0 - 50% (0-250 mM) B.. Nicht-reduzierenden und SDS-PAGE-Gel nach His-Tag-Affinitätsreinigung reduziert wird. Protein , das in der Nähe von 50 kDa läuft , ist nicht reduzierten Fab (#) und kleinere Spezies bei 25 kDa reduziert wird Fab (*). C. Elutionsprofil bei 280 nm von der Reinigung der 8B6 Fab durch Kationenaustausch beobachtet einen einzigen symmetrischen Peak anzeigt, die unter einem linearen Natriumchlorid-Gradienten eluiert. Grüne Spur stellt die Konzentration von NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Analyse der 8B6 Fab auf einem 12,5% SDS-PAGE - Gel nach der Reinigung durch Kationenaustausch. E. Die Bindung des 8B6 Fab 10 nM GFP-markierten SERT, mittels Fluoreszenz von GFP nachgewiesen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Abbildung 6: Repräsentative Gelfiltrationschromatographie des SERT-8B6 - Komplex in Gegenwart von S -Citalopram A.. Gelfiltrationseluierungsmuster Profil von gereinigtem SERT-8B6-Komplex. Hauptpeak bei 11,5 ml eluierenden ist die SERT-8B6-Komplex. Peak bei 15 - 17 ml enthält GFP und Fab B.. Analyse des gereinigten SERT-8B6-Komplex auf einem 4-15% SDS-PAGE-Gel. Die Positionen von SERT und der schweren und leichten Ketten des Fab sind durch einen Bindestrich. C gezeigt. FSEC der Größe getrennten Fraktionen. SERT-8B6-Komplexe wurden unter Verwendung von Tryptophan-Fluoreszenz detektiert. Fraktion 17 enthält eine größere Menge an SERT die mit Fab nicht komplex war. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Abbildung 7: Die Kristallisation des SERT-8B6 Komplex gebunden zu S -Citalopram A.. Lichtmikroskopie von quaderförmigen Kristalle des SERT-8B6-Komplex nach 2 Wochen Wachstum. Maßstabsbalken entspricht 200 um. B. SERT-8B6 Kristalle beugen Röntgenstrahlen bis 3,15 Å. Blauer Ring darstellt 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Tabelle 1:. Ein Kristallisations Bildschirm für die SERT-8B6 Complex S -Citalopram Bound <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Bitte hier klicken</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">diese Tabelle zu laden.</a>

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Dieses Manuskript beschreibt , wie für thermostabilisierende Mutationen zu screenen, die menschliche Serotonintransporter reinigen, Antikörper mit hoher Affinität zu erzeugen, und der Serotonin - Transporter-Antikörper - Komplex mit dem Antidepressivum S -Citalopram gebunden kristallisieren. Dieses Protokoll kann auf die Untersuchung von anderen schwierigen Membrantransportern, Rezeptoren und Kanälen angepasst werden.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound<em&gt; S</em&gt; -Citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

15.0K Aufrufe.  Oregon Health & Science University.  Dieses Manuskript beschreibt , wie für thermostabilisierende Mutationen zu screenen, die menschliche Serotonintransporter reinigen, Antikörper mit hoher Affinität zu erzeugen, und der Serotonin - Transporter-Antikörper - Komplex mit dem Antidepressivum S -Citalopram gebunden kristallisieren. Dieses Protokoll kann auf die Untersuchung von anderen schwierigen Membrantransportern, Rezeptoren und Kanälen angepasst werden. 

Serie: Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Forschung

Biochemie

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

Rekombinante Protein Expression, Kristallisation und biophysikalische Studien von a<em&gt; Bacillus</em&gt; -konservierte Nucleotid-Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR-Mutagenese, Klonierung, Expression, schnelle Proteinreinigungsprotokolle und Kristallisation des Wildtyps und der mutierten Formen der Tryptophan-Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Strategien zur Expression und Reinigung von Transportern gelöster Stoffe

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autor im Rampenlicht: Expression und Aufreinigung von humanen Trägertransportern für gelöste Stoffe unter Verwendung von Codon-optimierten Genen 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Immunologie und Infektion

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Thermostabilization, Expression, Reinigung und Kristallisation des menschlichen Serotonin-Transporter-Bound

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