Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
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We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

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The authors have nothing to disclose.

Determinação de estrutura de proteína de membrana por técnicas biofísicas permanece uma tarefa difícil para muitos transportadores clinicamente significativos, receptores e canais 11. Aqui temos conhecimentos partilhar detalhada desenvolvido para a determinação da estrutura do transportador de serotonina humano ligado a S -citalopram. Prevemos que estes métodos irão ser úteis para determinar estruturas de SERT em outros estados conformacionais, bem como estruturas de outras proteínas de membrana difíceis. Além disso, as técnicas bioquímicas descritos aqui também podem ser usadas para estudar a função de SERT purificada em detergente e um ambiente quase nativo lípido. SERT cristalização articulada sobre o desenvolvimento de várias técnicas e ferramentas. Em primeiro lugar, as melhorias na estabilidade térmica transportador produzidos variantes SERT que foram bem-comportado em várias micelas de detergentes seguintes extração do transportador a partir de membranas 6. Em segundo lugar, o uso-citalopram do ligando de afinidade elevada ao longo S purificação e cristalização adicional estabilidade melhorada e reduzida heterogeneidade conformacional. Em terceiro lugar, o desenvolvimento do sistema de expressão BacMam 7 permitido para a produção de grandes quantidades de SERT em um curto período de 2 semanas, o que facilita tanto a imunização e cristalização. Finalmente, o desenvolvimento de estratégias para seleccionar anticorpos de afinidade elevada que reconhecem epitopos 3D permitiu a descoberta de que o anticorpo 8B6 que promove a embalagem bem ordenada de complexos anticorpo-SERT em cristais. Há uma série de passos e reagentes críticos, bem como problemas comuns que ocorrem frequentemente ao longo do protocolo. Em primeiro lugar, a geração de elevado título de vírus SERT P2 pode ser problemático. A adição de concentrações baixas de vírus P1 para gerar vírus P2, como descrito neste protocolo normalmente mitiga este problema, e nos casos em que o título do vírus P2 é baixo, vírus P3 podem ser feitos Utilizang vírus a uma MOI de 0,0001. Os vírus com um título inferior a 1 x 10 8 partículas de vírus / ml não devem ser utilizados e quase sempre resultar em rendimentos baixos da proteína. Para a expressão, HEK293S GnTI - células foram escolhidos uma vez que falta N -acetylglucosaminyltransferase eu actividade e, assim, não pode sintetizar-glicanos complexos n, em vez produzindo apenas N-glicanos de manose elevada. Cliva EndoH N -ligada glicosilação de altas glicanos de manose em dois locais na alça extracelular 2 (EL2), deixando uma acetilglicosamina N ligado a asparagina. A digestão de N -linked açúcares reduz entropia superfície de EL2 que é provável importante para a cristalização. Para a geração de anticorpos, o SERT IC deve ser utilizada para a imunização. GFP é altamente imunogénica e 12 não deve ser usada como uma etiqueta de fusão para gerar anticorpos uma vez que é difícil de remover completamente por SEC. A N- flexível e C-terminal da SERT também não eramincluída na construção, a fim de evitar os anticorpos contra estas regiões. Os ratos podem ser imunizados com 30 ug de proteína reconstituída; continuar ratinhos imunizantes até concentrações elevadas no soro de anticorpos pode ser detectada e produzir células de hibridoma, tal como descrito 13. Uma construção thermostabilized é geralmente a melhor escolha para a imunização; se o transportador é bem comportado e mantém a actividade biológica após purificação, esta é muitas vezes suficiente para produzir anticorpos. O anticorpo 8B6 foi levantada contra WT SERT. Para a cristalização, apenas as fracções de pico contendo de Sec complexo monodisperso como julgado por FSEC devem ser combinadas e concentradas. cristais SERT-8B6 crescer em uma estreita faixa de condições e há uma série de passos que devem ser tomadas para solucionar problemas especificamente relacionados ao crescimento SERT cristal. Tris base ajustado com HCl, não deve ser usado na solução de reservatório, uma vez que este tampão não suporta o crescimento de cristais; é, assim, CRIticos em vez disso, use Tris ajustado com NaOH. cristais SERT crescer numa estreita faixa de concentrações de PEG 400, de modo que se cristais não crescem ou se se observarem cristais muitos pequenos, mesmo um pequeno aumento ou diminuição da concentração de PEG 400 seria aconselhável. Além disso, o aditivo de ácido 6-amino-hexanóico também foi utilizado no ecrã optimizado para melhorar a nucleação. A proporção gota de proteína: solução bem é também uma chave determinante para o crescimento de cristais. Gota rácios de 1,5-2: 1 são recomendados, com proporções mais estreitas gota a 2: 1, tipicamente de suporte do crescimento de cristais de 3-dimensionais maiores. Finalmente, o uso de baixo perfil placas de 24 poços também é crucial para o crescimento de cristais, presumivelmente devido à alteração da taxa de difusão de vapor. Uma abordagem alternativa para o método SPA foi desenvolvido para o rastreio de mutantes que estabilizam o transportador de serotonina rato numa conformação ligado a cocaína utilizando um filtro de ensaio de ligação 5. Em contrapartida, o ba SPAensaio sed permite passos de aquecimento sequenciais seguintes por determinação da fração de SERT, que permanece ligada ao ligando. Assim, isto permite a determinação rápida da temperatura de fusão a partir de um pequeno número de amostras. O método SPA baseia-se na disponibilidade de um ligando de alta afinidade marcado radioactivamente e, se não se conhecem os ligandos que se ligam com afinidade submicromolar, em seguida, uma abordagem alternativa será necessário. Muitos outros métodos são geralmente usados para medir a estabilidade da proteína tais como a ligação de corantes fluorescentes e de calorimetria 14 mas são de baixo rendimento e são incapazes de medir directamente a função ou requerem grandes quantidades de proteína. Se o método SPA não pode ser utilizado, uma abordagem alternativa de elevado rendimento é uma termoestabilidade Ensaio Baseado em FSEC 15 (FSEC-TS), em que a amostra é aquecida seguido pela separação da fracção de permanecer transportador. FSEC-TS é uma abordagem útil para aceder comportamento cromatográfica e estado oligomérico e é apferramenta complementar owerful que pode ser usado juntamente com o método SPA. Uma comparação de vários sistemas de expressão de proteína comum, também foi encontrada para favorecer a utilização de células de mamífero para expressão e sem surpresa SERT 16 esta é provavelmente o caso para muitas proteínas de origem mamífera. Os métodos que usamos para a expressão foram adaptados para SERT, mas é provável facilmente adaptável. As condições que favorecem elevados níveis de expressão deve ser cuidadosamente identificados através da variação do tempo de expressão, temperatura, concentração de vírus, e a presença de inibidores de histona-desacetilase, tais como o butirato de sódio. Em geral, favorecem a purificação por afinidade de um detergente de cadeia longa, tais como C12M leve juntamente com CHS antes da reconstituição para manter o ligando de alta afinidade de ligação. Reconstituição utilizando absorção hidrofóbica é uma técnica suave que se descobriram ser eficaz para vários outros transportadores e receptores. Se estenão é bem sucedida, a remoção de detergentes com altas concentrações de micelas críticas por diálise, de diluição, ou SEC pode ser empregue 17, desde que o antigénio seja suficientemente estável em tais detergentes. Nos casos em que não há anticorpos adequados são encontrados, nós quase sempre encontrar o problema é devido à perda de função ou desnaturação do antígeno e, nesses casos, foi realizada com sucesso novas imunizações prestando especial atenção à bioquímica de proteínas. Finalmente, os ligandos e anticorpos que se ligam com afinidade elevada deve formar a base para um experimento de cristalização racionalmente planeada, e tirando partido de uma variante termoestável, pode-se o despiste de uma gama mais ampla de condições, fazendo variar as propriedades de diferentes detergentes. Além disso, a cristalização de uma mesofase lipídica 18 ou usando bicelles 19 deve ser sempre considerada como uma alternativa à cristalização em micelas. Estes princípios e métodos podem ser usados ​​com algum modificação para muitas outras proteínas transmembranares que são difíceis de expressar e purificar a partir de outros hospedeiros de expressão, e será particularmente útil para a determinação da estrutura de alvos de drogas de alta afinidade.

O transportador de serotonina (SERT) é uma proteína da membrana integral, que facilita o transporte de serotonina através das membranas celulares 1. SERT pertence a uma família de Neurotransmissor SIMPORTADORES sódio (NSS), que também inclui a dopamina e norepinefrina transportadores 2. SERT é o alvo molecular de medicamentos antidepressivos e anti-ansiedade amplamente prescritos que agem para inibir competitivamente o transporte da serotonina 3. SERT explora o co-transporte energeticamente favorável de sódio para remover o neurotransmissor da fenda sináptica. Caracterização extensiva do sistema serotonérgico tem mostrado que mudanças no metabolismo da serotonina parecem influenciar praticamente todos os processos neurológicos, incluindo humor, sono, dor, cognição e agressão comportamentos 4. SERT função pode ser modificado através da utilização de antidepressivos e de recaptação da serotonina (SSRIs) -citalopram como S, bem como por psychostimulants e drogas de vício tais como anfetaminas e -methylamphetamine N 3,4-metilenodioxi ou &quot;ecstasy&quot; 1,2. ISRSs são extremamente importante para o tratamento de transtornos de humor, no entanto, a base estrutural para a sua acção preciso não é bem compreendido. WT SERT é instável em micelas de detergentes, impedindo assim o progresso no sentido de uma estrutura tridimensional (3D) de SERT 5,6. Recentemente, desenvolvemos variantes de SERT que são robustamente estável em uma ampla gama de detergentes e reter SSRI actividade 6 vinculativo. Estas variantes SERT termoestáveis ​​foram seleccionados usando um ensaio de estabilidade térmica à base de proximidade de cintilação. Aqui, descrevemos um procedimento para a geração de anticorpos de elevada afinidade que se podem ligar SERT, e a purificação e cristalização de SERT termoestável, em complexo com o anticorpo e S -citalopram. Este protocolo assume que a SERT e 8B6 genes têm sido bem sucedidaY clonado nos vectores BacMam 7 e insectos de expressão, respectivamente. Para gerar anticorpos, de ADNc que codificam os resíduos 73-616 de WT SERT foi clonado no vector BacMam com um Strep II etiqueta C-terminal (SERT IC). Para a tela de estabilidade térmica, foi usado resíduos SERT 73-616 com GFP C-terminal, Strep II e 10-his (TC SERT). Mutações pontuais individuais foram gerados no fundo SERT TC. Para o protocolo de cristalização, a proteína de fusão SERT-GFP foi usado com Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys], e 10-his, transportando os mutantes termoestáveis, Y110A, I291A, e T439S e mutações de cisteínas superfície C554A, C580A , e C622A (CC SERT). Sequências de clivagem de trombina (LVPRGS) também foram inseridos no CC SERT após Q76 e T618 para permitir a remoção do N- e C-terminais. O plasmídeo que codifica para o Fab de 8B6 foi manipulada para expressar tanto o pesada e levecadeias do anticorpo com sequências de secreção de gp67 sob o controlo de dois promotores poliedrina separados. O C-terminal da cadeia pesada do anticorpo 8B6 foi marcado com um 8-His e um local de clivagem de trombina foi inserido entre a cadeia pesada e a etiqueta.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Cation exchanger used for Fab purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-well VDXm plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm coverslips</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virus counter</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-well scintillation counter</td></tr><tr><td>HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

O transportador da serotonina é um transportador de sódio e acoplado a cloreto de que &quot;bombas&quot; de serotonina extracelular em células. -citalopram S é um medicamento utilizado para tratar a depressão e ansiedade através da ligação ao transportador da serotonina com alta afinidade, bloqueando a recaptação de serotonina. Aqui nós relatamos um procedimento eficiente e um conjunto de ferramentas para estabilizar, expresso, purificar e cristalizar serotonina complexos transportadores de anticorpos ligados a S -citalopram e outros antidepressivos. Mutações que estabilizam o transportador da serotonina foram identificados utilizando um ensaio de ligação S -citalopram. Transportador de serotonina expressa em baculovírus transduzidas HEK293S GnTI - células, foi reconstituída em proteolipossomas e utilizados para produzir anticorpos de elevada afinidade. Nós desenvolvemos uma estratégia para descobrir anticorpos que são úteis para estudos estruturais. Uma abordagem simples para a expressão de fragmentos de anticorpo em células Sf9 também foi estabelecida.Complexos transportadores-anticorpo purificado usando este procedimento são bem-comportado e prontamente cristalizar, produzindo complexos com S -citalopram que difractam raios-X para 3-4 Å de resolução. As estratégias desenvolvidas aqui pode ser utilizado para determinar a estrutura de outras proteínas da membrana desafiantes.

Uma biblioteca de mutantes de um único ponto no fundo SERT TC foi criado para a tela para thermostabilizing mutações. mutantes individuais foram geradas utilizando a mutagénese padrão. O protocolo de selecção utiliza células HEK293S e uma tela de termoestabilidade com base em proximidade de cintilação transientemente transfectada para rapidamente identidade mutações úteis para a cristalização, conforme descrito na Figura 1A. Valores Trama Tm contra ligado de [3H] citalopram à TA revela construções com elevada termoestabilidade e de expressão de níveis adequados para a purificação de proteínas (Figura 1B). Três mutantes (Y110A, I291A, e T439S) foram combinadas para gerar uma construção altamente estável (Figura 1C). A termoestabilidade está também correlacionada com o aumento da estabilidade em detergentes de cadeia curta necessárias para a cristalização do complexo Fab-SERT. A expressão em larga escala de SERT humano utilizando baculovírus-transduced HEK293S GnTI - células pode levar menos de 2 semanas e podem produzir quantidades de miligramas, tal como ilustrado na Figura 2A. Utilização da proteína SERT CC GFP permite a SERT ser convenientemente seguido durante a expressão e a purificação por fluorescência (Figura 2B). A nossa estratégia de purificação envolveu 1) solubilização de SERT ligado a S -citalopram a partir de GnTI HEK293S - células em C12M na presença de CHS como um lípido de estabilização; 2) ligação do SERT a uma matriz de afinidade Strep; 3) a remoção de proteínas contaminantes por lavagem exaustiva; e 4) eluição da SERT funcional com tampão contendo destiobiotina (Figura 2C). A proteína eluída é em grande parte isenta de outras proteínas detectáveis por coloração com azul de Coomassie e monodisperso como julgado por FSEC (Figura 2D, E). Uma estratégia semelhante foi feita para purificar SERT com uma etiqueta Strep II que foi usada para reconstitution e imunização (Figura 3A, B). Incorporação de SERT em proteolipossomas aumenta a meia-vida no soro e a estabilidade da SERT e aumenta a probabilidade de isolamento de anticorpos de elevada afinidade. Além disso, a inclusão de lípido A, um componente da parede celular bacteriana, serve como um potente adjuvante 9. Os lipossomas multilamelares foram preparados pela adição de tampão para uma mistura de lípidos secos em tubos de vidro e ressuspensas em tampão. A extrusão de lipossomas através de filtros de tamanho de poro de 200 nm produz monodispersas suspensões lipossómicas unilamelares. Os lipossomas são, em seguida, saturado com um detergente, seguida pela adição de SERT purificada em detergente. Finalmente, o detergente é removido por adição de resina hidrofóbica de absorção para o lípido: mistura detergente. ligando adicional deve ser adicionado à amostra reconstituída para seleccionar anticorpos que reconhecem a conformação ligada antidepressivo. A presença de SERT nas proteolipossomos deve ser confirmado porsolubilização de uma pequena amostra com tintura SDS-PAGE carga ou C12M e em execução no SDS-PAGE e FSEC (Figura 3C, D). linhas celulares de hibridoma que expressam anticorpos SERT pode ser rastreada para ligantes de afinidade elevada que reconhecem epítopos em 3D. Estas propriedades são cruciais para o eventual sucesso de cristalização, como o anticorpo deve manter-se firmemente ligada a uma região estruturada para promover empacotamento cristalino de homogéneos, domínios bem ordenadas. No primeiro passo, os anticorpos que reconhecem regiões não estruturados são identificados. SERT é desnaturado e transferido para uma membrana de nitrocelulose; anticorpos que se ligam SERT desnaturado será ocidental-positiva e provavelmente reconhecem epítopos lineares. Na Figura 4A, que mostram exemplos de 2 anticorpos que são ocidental-positiva e, provavelmente, não é útil para promover crystallogenesis. Na Figura 4B, os restantes anticorpos ocidental-negativos são incubadas com 100 nM de SERT-GFP e separados porFSEC. Os anticorpos que se ligam SERT irá deslocar o pico de GFP-positiva para uma posição anterior. Os complexos SERT-anticorpo pode ser diluída adicionalmente em detergente para determinar se eles podem ligar-se com afinidade nanomolar, seguido de análise por FSEC. A adição de resultados de serotonina em alterações conformacionais no transportador e, portanto, os anticorpos podem ser novamente pesquisadas para determinar se são capazes de reconhecer especificamente a conformação SSRI-ligado. Na Figura 4C, os anticorpos são mostrados para ligar SERT na presença de serotonina, que mostra que o epitopo (s) não mudam do SSRI ao substrato estado ligado. Finalmente, na Figura 4D combinações de anticorpos são testados quanto à sua capacidade para se ligar epitopos distintos, o que resulta em mais um desvio para a esquerda. Aqui, o 15B8 ou 8A11 anticorpos reconhecem um epitopo que é diferente do 8B6. O anticorpo 8B6 foi escolhido para posterior análise estrutural com base na triagem de cristal preliminar com trea papaínated Fab. Os genes de 8B6 do Fab foram clonados num vector de expressão de células de insecto. Fab podem ser expressas e segregadas a partir de células Sf9 em crescimento em suspensão. O 8B6 Fab pode ser purificado a partir do sobrenadante de células Sf9 por His-tag de afinidade (Figura 5A, B) e cromatografia de permuta catiónica (Figura 5C, D) resultando em proteína que aparece livre de contaminantes em geles de SDS-PAGE. Na Figura 5E, o recombinante 8B6 Fab é mostrado ligar SERT e é usado em experiências bioquímicas e biofísicas subsequentes. A afinidade purificado SERT CC é digerida com trombina e a EndoH e misturado com 8B6 Fab de modo a formar um complexo na presença de S -citalopram. O complexo transportador-anticorpo é então separado por SEC em C8M (Figura 6A) e as fracções de pico conter tanto SERT e Fab como mostrado por SDS-PAGE (Figura 6B). Uso de C8M é crucial para a formação de cristais, provavelmente porqueo detergente de cadeia curta permite uma melhor embalagem entre as moléculas na rede cristalina. FSEC é empregada para determinar quais as fracções devem ser recolhidas para cristalização (Figura 6C); As fracções que não são monodispersas e / ou contêm grandes quantidades de SERT livre ou Fab não devem ser combinados. Prisma cristais SERT-anticorpo em forma podem ser cultivadas na presença de S -citalopram usando este protocolo por enforcamento difusão de vapor de queda (Figura 7A). Os cristais resultantes difratar raios-X para uma resolução de 3,15 Å 10 (Figura 7B). <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Figura 1: proximidade de cintilação à base de termoestabilidade Ensaio A.. Visão geral do protocolo para o rastreio de termoestabilidade na presença de [3H] citalopram. B. Máxima ligado [3 </sup&gt; H] citalopram versus a temperatura de fusão aparente (Tm). As linhas pontilhadas representam os valores para o transportador WT. Os 3 mutantes mais termoestáveis ​​são rotulados. Área cinzenta representa mutantes que têm menos de 10% de [3H] citalopram em relação ao WT e valores de Tm de ligação, portanto, imprecisas devido a uma baixa relação sinal-ruído. C. Curvas termoestabilidade para WT SERT TC e os 3 primeiros mutantes. As barras de erro representam o desvio padrão (SD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Figura 2: Visão de mamíferos heterólogos Protein Expression A.. Visão geral esquematizado de geração de vírus BacMam e expressão de SERT em HEK293S GnTI -. Células B. ELEK293S GnTI - células que expressam o CC SERT (fluorescência da GFP) C.. Perfil de eluição de CC SERT em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100% (0-5 mM) D.. Análise de afinidade purificado CC SERT numa 4 - gel de 15% SDS-PAGE E.. FSEC de afinidade CC SERT purificada detectado pelo GFP fluorescência (excitação: 480 nm; emissão: 510 nm). O pico de eluição de 15 mL é SERT (#) e 18 mL é GFP livre (*). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Figura 3: Representante Affinity Purificação e Reconstituição da SERT IC A.. Visão esquemática da geração de anticorpos. &lt;strong&gt; B. Perfil de eluição observado a 280 nm de a purificação por afinidade de SERT IC em resina de afinidade Strep. Vestígio verde representa a concentração de destiobiotina, 0 - 100%. (0-5 mM) C. Análise de afinidade purificados e reconstituídos num SERT 4 - gel de 15% SDS-PAGE D.. FSEC de SERT solubilizado após a reconstituição. A fluorescência dos resíduos de triptofano foi usado para detectar SERT (Excitação: 280 nm; emissão: 335 nm). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Figura 4:. Análise do representante SERT Antibodies A. O rastreio de anticorpos por Western blot. Aproximadamente 1 ug de CC SERT com ou sem GFP foi aplicado a 4 - 15% de SDS-gel de PAGE e transferidas para uma membrana de nitrocelulose. A ligação foi detectada utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com corante IV. 2G4 e 10F2 são western positivo. B. A ligação de anticorpos a 100 nM SERT GFP e detecção por FSEC detectada utilizando GFP fluorescência. C. A ligação de Fab seleccionados a 100 nM SERT GFP na presença de 1 mM de serotonina. D. A ligação de 8A11 ou 15B8 Fabs para Sert-8B6 Fab. Picos menores de eluição de 18 ml são GFP livre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Figura 5: A purificação representativas do 8B6 de Fab a partir de células Sf9 Um.. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por His-tag de afinidade chromatograp<html> HY. Vestígio verde representa a concentração de imidazole, 0 - 50% (0 - 250 mM) B.. Não-redutoras e redutoras em gel de SDS-PAGE depois de purificação por afinidade de His-tag. Proteína que corre perto de 50 kDa é Fab não reduzido (#) e as espécies menores de 25 kDa é reduzido Fab (*). C. perfil de eluição observado a 280 nm da purificação do 8B6 Fab por permuta catiónica exibindo um único pico simétrico que elui sob um gradiente linear de cloreto de sódio. Vestígio verde representa a concentração de NaCl, 0 - 100%. (0 - 500 mM) D. Análise do 8B6 Fab num gel de SDS-PAGE a 12,5%, após purificação por permuta catiónica. E. Ligação do 8B6 Fab a 10 nM SERT GFP, detectada usando fluorescência da GFP. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Figura 6: Cromatograf ia de Filtração em Gel representativas do Complexo SERT-8B6 na presença de S Uma -citalopram.. Gel perfil de eluição da filtração purificado complexo SERT-8B6. pico principal que elui a 11,5 mL é o complexo SERT-8B6. Pico em 15-17 mL contém GFP e Fab B.. Análise do complexo SERT-8B6 purificado numa 4 - em gel de SDS-PAGE a 15%. As posições de SERT e as cadeias pesada e leve do Fab são mostrados por uma barra. C. FSEC das fracções separadas por tamanho. complexos SERT-8B6 foram detectados utilizando a fluorescência do triptofano. Fracção 17 contém uma quantidade maior de SERT que não fez complexo com Fab. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Figura 7: Cristalização do Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram A.. A microscopia de luz em forma de paralelepípedo de cristais do complexo SERT-8B6 após 2 semanas de crescimento. A barra de escala é igual a 200 um. B. cristais SERT-8B6 difratar raios-X a 3,15 Å. anel azul representa 3,15 Å. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Tabela 1:. A tela cristalização para o Complexo SERT-8B6 Bound to S -citalopram <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Por favor clique aqui para baixar esta tabela.</a>

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

15.0K visualizações.  Oregon Health & Science University.  Este manuscrito descreve como para o rastreio de mutações thermostabilizing, purificar o transportador humano de serotonina, gerar anticorpos de elevada afinidade, e cristalizar o complexo transportador-anticorpo serotonina ligada ao -citalopram S droga antidepressiva. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo de outros transportadores difíceis de membrana, receptores e canais. 

Vídeo: Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Bioquímica

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Expressão, solubilização e purificação de transportadores eucarióticas borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR Mutagenesis, Clonagem, Expressão, Protocolos rápidos de purificação de proteínas e Cristalização do Tipo Selvagem e Formas Mutantes de Synthase Triptofano

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Estratégias para expressar e purificar transportadores de soluto

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Autor em destaque: Expressão e purificação de transportadores de soluto humano usando genes otimizados para códons 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Expressão de alto rendimento e purificação de carreadores de solutos humanos para estudos estruturais e bioquímicos

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Imunologia e Infecção

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Termoestabilização, expressão, purificação e cristalização do transportador de serotonina humano Bound to

Resumo

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