Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Biyofiziksel tekniklerle membran proteini yapısının belirlenmesi, birçok tıbbi önemli taşıyıcıları, reseptörler ve kanallar 11 için zor bir girişim olarak kalır. Burada S -citalopramın bağlı insan serotonin taşıyıcı yapı tayini için geliştirilen ayrıntılı uzmanlık paylaşır. Biz bu yöntemlerin diğer yapısal durumları yanı sıra diğer zor zar proteinlerinin yapılarda SERT yapılarının yararlı olacağını tahmin ediyoruz. Bundan başka, burada açıklanan biyokimyasal teknikler aynı zamanda, deterjan saflaştırıldı eki ve bir yakın yerel lipid ortam işlevi çalışmak için de kullanılabilir. SERT kristalleşme birkaç araç ve tekniklerin geliştirilmesi üzerine menteşeli. İlk olarak, taşıyıcı termo gelişmeler membranların 6 taşıyıcı çıkarma aşağıdaki çeşitli deterjan miseller iyi davrandım SERT varyantları üretti. İkincisi, kullanımsaflaştırma ve kristalizasyon boyunca yüksek afiniteli ligandı S -citalopramın daha da geliştirilmiş kararlılık ve düşük yapısal heterojenite. Üçüncü olarak, aşılama ve kristalleşme hem de kolaylaştıran 2 hafta gibi kısa bir süre içinde SERT büyük miktarlarda üretimi için izin BacMam sentezleme sistemi 7 geliştirilmesi. Son olarak, stratejilerinin geliştirilmesi kristaller halinde SERT-antikor komplekslerinin iyi sıralı ambalaj teşvik 8B6 antikorunun keşfine izin 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli antikorların seçilmesi için. genellikle protokol boyunca meydana gelen kritik adımlar ve reaktifler yanı sıra ortak bir takım sorunlar vardır. İlk olarak, yüksek titre SERT P2 virüsün üretimi sorunlu olabilir. Bu protokolde tarif edildiği gibi P2 virüs üretmek için P1 virüsünün düşük konsantrasyonlarda eklemek genellikle bu sorunu ortadan kaldıran, ve P2 Virüs titresi düşük olduğu durumlarda, P3 virüsü usin yapılabilir0.0001 bir MOI&#39;da g virüsü. 1 x 10 8 virüs partiküllerinin daha düşük bir titreye sahip bir virüs / ml kullanılmamalıdır ve hemen hemen her zaman düşük protein verimine neden olur. Ekspresyon için, HEK293S GnTI - bunlar N kompleks N -glycans sentezleyemediği dolayısıyla I aktivitesini -acetylglucosaminyltransferase ve eksik olur hücreler yerine, yalnızca yüksek mannoz N -glycans üreten seçilmiştir. EndoH böler N asparajin bağlı bir N -acetylglucosamine bırakarak hücre dışı döngü 2 (EL2) iki noktada yüksek mannoz glikanların glikozilasyon -bağlı. N sindirimi şekerler kristalleştirme için olası önemli El2 yüzey entropi azaltır -bağlı. Antikorların üretimi için, SERT IC immünizasyon için kullanılmalıdır. GFP 12 yüksek oranda immünojenik ve tamamen SEC tarafından çıkarılması zor olduğu için antikorların üretilmesi için, bir füzyon etiket olarak kullanılmamalıdır. SERT esnek N- ve C-terminali de değildiBu bölgelerin karşı antikor önlemek için bir yapı da yer almaktadır. Fareler yeniden oluşturulmuş proteinin 30 ug ile immünize edilebilir; antikorların yüksek serum konsantrasyonları tespit edilmeye kadar immünize fareler devam tarif 13 hibridoma hücrelerinin üretilmesi. Bir thermostabilized yapı genellikle aşılama için en iyi seçimdir; taşıyıcı iyi davrandım ve arıtma için aşağıdaki biyolojik aktivitesini muhafaza, bu genellikle antikorları geliştirmek için yeterli olmaktadır. 8B6 antikoru WT SERT karşı büyüdü. kristalizasyon için FSEC ile değerlendirildiği gibi tek dağılımlı kompleksini ihtiva SEC sadece pik fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve konsantre olmalıdır. SERT-8B6 kristalleri koşullar dar bir aralıkta büyür ve özellikle SERT kristal büyümesi ile ilgili sorunları gidermek için alınması gereken adımların bir dizi vardır. HCI ile ayarlanmıştır Tris baz, bu tampon, kristal büyümesini desteklemez, rezervuar çözeltisi içinde kullanılmamalıdır; böylece CRI olduğukortikal yerine NaOH ile ayarlanmıştır Tris kullanımı. Kristaller uzamıyor veya çok sayıda küçük kristaller gözlenir ise, PEG 400 konsantrasyonda bile küçük bir artış veya azalış tavsiye edilir eğer öyleyse SERT kristalleri, PEG 400 dar bir konsantrasyon aralığında büyür. Bundan başka, ilave 6-aminoheksanoik asit, aynı zamanda, nükleasyon artırmak için optimize ekran kullanılmıştır. Protein damla oranı: de bir çözüm de, kristal büyümesi için önemli bir belirleyici faktör olduğunu. tipik olarak daha büyük bir 3 boyutlu kristallerin büyümesine destek 1: 2 daha yakın açılan oranları önerilmektedir 1: 2 - 1.5 oranlarını bırakın. Son olarak, düşük profil 24 oyuklu plakalar kullanımı ki tahminen bu, buharı difüzyon hızının değiştirilmesi için, kristal büyüme yönünde çok önemlidir. SPA yöntemine alternatif bir yaklaşım, tahlil 5 bağlayıcı filtre kullanılarak kokaine bağlı konformasyonunda sıçan serotonin taşıyıcısını stabilize mutantlar için ekrana geliştirilmiştir. Buna karşılık, SPA baSED deney ligandına bağlı kalır SERT fraksiyonunun belirlenmesi ile, sırasıyla aşağıdaki ısıtma adımları sağlar. Bu nedenle, bu örneklerin az sayıda erime sıcaklığının hızlı bir şekilde belirlenmesine izin verir. SPA yöntem radyo-etiketli yüksek afiniteli bir ligandın varlığına dayanır ve herhangi bir ligand submikromolar afınite ile bağlanan, bilinmektedir sonra alternatif bir yaklaşım, gerekli olacaktır. Birçok diğer yöntemler yaygın olarak bu tür floresan boyalar ve kalorimetri 14 bağlayıcı protein stabilitesini ölçmek için kullanılan, ancak, düşük-verimlilik ve işlevi doğrudan ölçülmesi veya yüksek miktarda protein gerektirecek ya edemiyoruz vardır. SPA yöntem kullanılabilir olamaz, alternatif bir yüksek verimli bir yaklaşım, örnek taşıyıcı kalan fraksiyonunun ayrılması ve ardından ısıtılan bir FSEC tabanlı Termostabilite Deney 15 (FSEC-TS) vardır. FSEC-TS kromatografik davranış ve oligomerik durumunu erişmek için kullanışlı bir yaklaşım ve ApSPA yöntemiyle birlikte kullanılabilecek owerful tamamlayıcı bir araç. Çeşitli ortak protein ekspresyon sistemlerinin bir karşılaştırma da SERT ifadesi 16 için memeli hücrelerinin kullanımı tercih bulunmuştur ve şaşırtıcı Bu büyük olasılıkla, memeli kökenli birçok proteinler için geçerlidir. Biz ifade için kullanılan metodlar SERT için uyarlanmış ancak büyük olasılıkla kolayca adapte edilmiştir. yüksek ifade seviyeleri tercih şartlar dikkatli bir şekilde, örneğin sodyum bütirat histon deasetilaz inhibitörleri sentezlenmesi, sıcaklık, virüs konsantrasyonu ve varlığı süresi değiştirilerek belirlenmelidir. Genellikle bağlanmadan önce yüksek afiniteli bir ligandın tutmak için yeniden-teşekkül ettirilmeden CHS birlikte böyle C12M gibi hafif bir uzun zincirli deterjan afinite saflaştırma lehinedir. hidrofobik emilimini kullanarak Sulandırma biz birkaç diğer nakliyecilere ve alıcıları için etkili olduğu bulduk hafif bir tekniktir. Eğer budiyaliz, seyreltme, veya sek. yüksek kritik misel konsantrasyonu ile deterjan çıkarılması 17 antijeni deterjanlar içinde yeterince kararlı olarak temin başarılı kullanılabilir değildir. Uygun bir antikor bulunan durumlarda, hemen hemen her zaman sorun işlevi veya antijen denatürasyon kaybı nedeniyle ve bu gibi durumlarda başarıyla protein biyokimyası özel dikkat yeni aşılar uygulandı bulabilirsiniz. Son olarak, yüksek bir afinite ile bağlanan ligandlar ve antikorlar, bir rasyonel olarak planlanmış kristalizasyon deney için bir temel oluşturacaktır ve ısıya dayanıklı bir varyantın yararlanarak, biri farklı deterjanların özellikleri değiştirilerek koşullarının geniş bir aralıkta tarayabilir. Bundan başka, bir lipidik mezofaz 18 kristalleştirme veya bicelles 19 kullanılarak her miseller kristalleşme alternatif olarak düşünülmelidir. Bu ilkeler ve yöntemler bazı modifi ile kullanılabilirifade ve diğer ekspresyon ana den saflaştırmak ve yüksek afiniteli ilaçların hedeflerinden yapı tayini için özellikle faydalı olacaktır zor olan diğer zar proteini için bir katyondur.

Serotonin (SERT) hücre membranları 1 arasında serotonin taşınmasını kolaylaştıran bir integral membran proteinidir. SERT ayrıca dopamin ve norepinefrin taşıyıcıları 2 içeren nörotransmitter Sodyum Symporters (NSSs) bir aile aittir. SERT rekabetçi serotonin naklini 3 inhibe hareket yaygın olarak reçete antidepresan ve anti-anksiyete ilaçları moleküler hedeftir. SERT sinaptik gelen nörotransmitter çıkarmak için sodyum enerjik olumlu cotransport patlatır. Serotonerjik sistemin kapsamlı karakterizasyonu serotonin metabolizmasında değişiklikler neredeyse ruh hali, uyku, ağrı, kavrama dahil olmak üzere tüm nörolojik süreçleri etkilemek için görünür olduğunu göstermiştir ve saldırganlık 4 davranışları. SERT fonksiyonu S -citalopramın gibi antidepresanlar ve selektif serotonin gerialım inhibitörleri (SSRI) kullanımı yoluyla yanı sıra psychostimula tarafından değiştirilebilirNTS ve amfetamin ve 3,4-Metilendioksi N -methylamphetamine veya &quot;ecstasy&quot; 1,2 olarak bağımlılık ilaçlar. SSRI ruh hali bozukluklarının tedavisi için son derece önemli olan, ancak bunların eylem için değerli yapı temeli çok iyi anlaşılmamıştır. WT SERT Böylece SERT 5,6 bir üç boyutlu (3D) bir yapı doğru ilerlemeyi engelleyen, deterjan miseller stabil değildir. Son zamanlarda, deterjan geniş bir sağlam kararlıdır ve aktivitesi 6 bağlanma SSRI korumak SERT varyantlarını geliştirdi. Bu termo SERT varyantları, bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite deneyi kullanılarak belirlenmiştir. Burada antikorun ve S -citalopramın ile kompleks olarak, SERT bağlanan yüksek afiniteli antikorların üretilmesi için bir işlem, ve ısıya dayanıklı SERT saflaştırılması ve kristalleşme açıklar. Bu protokol SERT ve 8B6 genler başarılı olmuştur varsayary, sırasıyla, BacMam 7 ve böcek sentezleme vektörlerine klonlanmıştır. Antikorların üretilmesi için, bir cDNA kodlayan tortuları WT SERT&#39;in 73-616 bir C-terminal Strep II etiketi (SERT İS) BacMam vektörüne klonlanmıştır. Termostabilite ekran için, SERT artıkları C-terminali GFP ile 73-616, Strep II ve 10-His etiketleri (SERT TC) kullanılmıştır. Bireysel nokta mutasyonları SERT TC arka planda üretildi. Kristalleşme protokolü için, SERT-GFP füzyon proteini yüzey sisteinler C554A, C580A ve ısı ayarlı mutantlar, Y110A, I291A ve T439S ve mutasyonlar taşıyan Twin-Strep [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] ve 10-His etiketleri ile kullanılmıştır ve C622A (SERT CC). Trombin parçalama dizileri (LVPRGS) de N- çıkarılması ve C-ucu sağlamak için S76 ve T618 sonra SERT CC sokulmuştur. 8B6 Fab kodlayan plazmid ağır ve hafif hem de ifade etmek için olaniki ayrı polihedrin promoterlerin kontrolü altında GP67 salgılama sekansları ile antikor zincirleri. 8B6 antikorunun ağır zincirinin C-terminal 8 His etiketi ile etiketlenmiş ve bir trombin parçalanma alanı ağır zincir ve etiket arasına sokulmuştur.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Cation exchanger used for Fab purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-well VDXm plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm coverslips</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virus counter</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-well scintillation counter</td></tr><tr><td>HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

Serotonin taşıyıcı hücre içine ekstraselüler serotonin &quot;pompaları&quot; bir sodyum ve klorür-birleştiğinde taşıyıcı olduğunu. S -citalopram serotonin geri alımını engelleyerek, yüksek afinite ile serotonin taşıyıcısı bağlanarak depresyon ve anksiyete tedavisinde kullanılan bir ilaçtır. Burada verimli bir prosedür ve ekspres, stabilize arındırmak ve S -citalopramın ve diğer antidepresanlara bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksleri kristalize için bir dizi araç sunduk. Serotonin taşıyıcısını stabilize mutasyonlar bağlanma tahlili S -citalopram kullanılarak belirlendi. Bakulovirüs kalıt HEK293S GnTI ifade serotonin taşıyıcı - hücreleri, proteoliposomes halinde yeniden kurulmuş ve yüksek afıniteli antikorlar yükseltmek için kullanılmıştır. Biz yapısal çalışmalar için yararlı olan antikorları keşfetmek için bir strateji geliştirdik. Sf9 hücrelerinde antikor fragmanlarının ekspresyonu için basit bir yaklaşım, aynı zamanda tespit edilmiştir.Bu yordamı kullanarak arıtılmış Transporter-antikor kompleksleri uslu ve kolayca 3-4 Å çözünürlük X-ışınları yaymak S -citalopramın ile kompleks üreten, kristalize bulunmaktadır. Burada geliştirilen stratejiler diğer zorlu membran proteinlerinin yapısını belirlemek için kullanılabilir.

SERT TC arka planda tek nokta mutantlar bir kütüphane mutasyonlarını termo ekranına oluşturuldu. Bağımsız mutantlar standart mutagenez kullanılarak elde edilmiştir. Şekil 1A tarif edilen tarama programı geçici hızlı kimlik kristalleştirme için yararlı mutasyonlara HEK293S hücreleri ve bir sintilasyon yakınlık tabanlı termostabilite ekran transfekte kullanmaktadır. Çizim Tm değerleri bağlı [3H] oda sıcaklığında sitalopram, yüksek termostabilite ve sentezleme seviyeleri, uygun olan yapılar ortaya karşısında protein saflaştırma için (Şekil 1B). Üç mutant (Y110A, I291A ve T439S) son derece stabil bir yapı (Şekil 1C) oluşturmak üzere bir araya getirilmiştir. Termostabilitesini ayrıca SERT-Fab kompleksinin kristalleşme için gerekli kısa zincirli deterjanlarda artan istikrar ile ilişkilidir. baculovirüs-tr kullanılarak insan SERT büyük ölçekli ekspresyonuansduced HEK293S GnTI - hücreleri en az 2 hafta sürebilir ve Şekil 2A&#39;da gösterildiği gibi, miligram miktarları üretebilir. GFP etiketli SERT CC proteininin kullanımı SERT uygun floresan (Şekil 2B) ile ekspresyonu ve saflaştırılması sırasında takip edilebilir. ; Stabilize edici bir lipid olarak CHS mevcudiyetinde C12M hücrelerin - Bizim saflaştırma stratejisi 1) HEK293S GnTI S -citalopramın bağlı SERT çözünürlüğünü dahil 2) Strep afinite matrisi Sert bağlanması; Kapsamlı yıkama ile kirletici madde proteinlerinin 3) kaldırılması; ve 4) tamponu ihtiva eden destiyobiyotin (Şekil 2C) fonksiyonel SERT elüsyonu. FSEC (Şekil 2D, E) ile değerlendirildiği gibi Elüt edilen protein, büyük ölçüde, Coomassie mavi boyanması yolu ile, diğer tespit proteinlerin serbest ve tek dağılımlı olduğunu. Benzer bir strateji, reconstitutio için kullanılan bir Strep II etiketiyle SERT saflaştırmak için alındın ve aşılama (Şekil 3A, B). proteoliposomes halinde SERT eklenmesi SERT serum yarı-ömrü ve stabilitesini artırır ve yüksek afıniteli antikorların izole edilmesi ihtimalini arttırır. Bundan başka, lipid A dahil, bakteri hücre duvarının bir bileşeni olan güçlü bir yardımcı madde 9 olarak hizmet eder. Çok katmanlı lipozomlar cam tüplerde bir kurutulmuş lipid karışımına tampon maddesinin eklenmesi ile hazırlanmış ve tampon maddesi içinde yeniden süspansiyona alınmıştır. 200 nm gözenek büyüklüğü filtrelerden lipozomların Ekstrüzyon tek dağılımlı tek lamelli lipozom süspansiyonları üretir. Lipozomlar daha sonra deterjan saflaştırılmış SERT ilave edilir deterjan ile doymuştur. deterjan karışımı: Son olarak, deterjan lipide hidrofobik emici reçinenin eklenmesiyle kaldırılır. Ek ligand antidepresan bağlı yapısını tanıyan antikorları seçmek için yeniden örnek eklenmelidir. proteoliposomes içinde SERT varlığı ile teyit edilmelidirSDS-PAGE yükleme boya veya C12M olan küçük bir örnek çözündürülmesi ve SDS-PAGE ve FSEC (Şekil 3C, D) üzerinde çalışan. SERT antikorları eksprese eden hibridoma hücre çizgileri 3D epitopları tanıyan yüksek afiniteli bağlayıcılar için taranabilir. Antikor sıkıca homojen, iyi sıralı etki kristal ambalaj teşvik etmek yapılandırılmış bölgeye bağlı kalmalıdır gibi bu özellikler, kristalleşme nihai başarısı için çok önemlidir. İlk adımda, yapısal olmayan bölgeleri tanıyan antikorlar tanımlanmıştır. SERT denature edilir ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir; denatüre SERT bağlanan antikorlar batı-pozitif ve büyük olasılıkla lineer epitopları tanıyacaktır. Şekil 4A, biz batı-pozitif ve crystallogenesis teşvik etmek olası yararlı değildir antikorların 2 örneklerini göstermektedir. Şekil 4B&#39;de, diğer Batı negatif antikorlar 100 nM SERT-GFP ile kuluçkaya yatırılır ve ayrılmışFSEC. SERT önceki bir konuma GFP pozitif tepe kayacak bağlayan antikorlar. SERT-antikor kompleksleri FSEC ile analiz ardından nanomolar afinite ile bağlanan belirlemek için başka deterjan seyreltilebilir. yapısal taşıyıcı değişiklikleri ve böylece antikorlar serotonin sonuçları eklenmesi de özellikle SSRI bağlı yapısını kabul belirlemek için tekrar elenebilir edilebilir. Şekil 4C&#39;de, antikorlar, epitop (lar) ilişkili bir durumu substrat SSRI arasında değişmez gösteren serotonin mevcudiyetinde SERT bağlandığı gösterilmiştir. Son olarak, Şekil 4D&#39;de antikorların kombinasyonları daha sola doğru bir kayma ile sonuçlanır, apayn epitopları bağlanma yetenekleri açısından test edilir. Burada 15B8 veya 8A11 antikorlar 8B6 farklı bir epitopu tanır. 8B6 antikor papain Akne tedavi edici ile ön kristal tarama dayalı daha fazla yapısal analiz için seçildited Fab. 8B6 Fab genler, bir böcek hücresi sentezleme vektörüne klonlanmıştır. Fab ifade süspansiyon içinde büyüyen Sf9 hücrelerinden salgılanabilir. 8B6 Fab His-tag afinite (Şekil 5a, b) ve SDS-PAGE jelleri üzerinde yabancı maddelerden arındırılmış görünen protein elde katyon değişim kromatografisiyle (Şekil 5C, D) Sf9 hücre yüzer saflaştırılabilir. Şekil 5E&#39;de, yeniden birleştirici 8B6 Fab SERT bağlandığı gösterilmiştir ve sonraki biyokimyasal ve biyofiziksel deneylerde kullanılır. Eğilim saf hale getirilmiş SERT CC trombin ve EndoH ile sindirilmiş ve S -citalopramın mevcudiyetinde bir kompleks oluşturmak için 8B6 Fab ile karıştırılır. Taşıyıcı-antikor kompleksi, daha sonra C8M (Şekil 6A) SEC ile ayrılır ve SDS-PAGE (Şekil 6B) ile gösterildiği gibi, en yüksek fraksiyonlar eki ve Fab ikisini de içerir. C8M kullanımı kristal oluşumu muhtemelen için çok önemlidirkısa zincirli deterjan kristal kafes içinde moleküller arasında daha iyi ambalaj sağlar. FSEC kristalizasyon için toplanmış hangi fraksiyonlar belirlemek için kullanılmıştır (Şekil 6C); tek dağılımlı değildir ve / veya serbest SERT veya Fab büyük miktarlarda içeren fraksiyonlar kombine edilmemelidir. Prizma şeklindeki SERT-antikor kristaller damla buhar difüzyonu (Şekil 7A) asılarak Bu protokol kullanılarak S -citalopramın mevcudiyetinde yetiştirilebilir. Oluşan kristaller 3.15 Å 10 (Şekil 7B) bir çözünürlük X-ışınları yaymak. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> Şekil 1:. Sintilasyon Termostabilite Deneyi A Yakınlık tabanlı. [3H] sitalopram. B mevcudiyetinde termostabilite taranması için protokol bakış. En bağlanmış [3 </belirgin erime sıcaklığı (Tm) karşı destek&gt; H] sitalopram. Noktalı çizgiler WT taşıyıcısı değerlerini temsil etmektedir. 3 En termostabil mutantlar etiketlenir. Gri alanı nedeniyle düşük sinyal-gürültü. C WT ve dolayısıyla doğru olmayan Tm değerlerine kıyasla bağlanan [3H] sitalopram% 10&#39;dan daha az olan mutantlar temsil eder. WT SERT TC ve ilk 3 mutantlar için termostabilite eğrileri. Hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> Şekil 2:. Memeli Heterolog Protein Ekspresyonu A Genel Bakış. HEK293S GnTI içinde BacMam virüs üretimi ve SERT ifade şematize bakış -. Hücreler B. HEK293S GnTI -. SERT CC (GFP floresans) Cı ifade eden hücreler. Strep afinite reçine SERT CC elüsyon profili. % 100 (0 - - 5 mM) D. Yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. % 15 SDS-PAGE jeli e -. 4 üzerinde yakınlık saf hale SERT CC analizi. GFP floresans tespit afinite saflaştırılmış SERT CC FSEC (eksitasyon: 480 nm; emisyon: 510 nm). 15 mL akıtılarak zirve SERT (#) ve 18 ml ücretsiz GFP (*) &#39;dir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> Şekil 3:. SERT IC A Temsilcisi Affinity Arıtma ve Sulandırma. Antikor nesil şematik bakış. &lt;strong&gt; B. Elüsyon profili Strep afinite reçinesi üzerinde SERT IC afinite saflaştırma 280 nm&#39;de gözlendi. % 100. (0 - - 5 mM) C yeşil iz destiyobiyotin konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Afinitesi analizi saf hale getirilir ve bir 4 SERT yeniden -% 15 SDS-PAGE jeli D.. yeniden çözme aşamalarından sonraki çözündürülmüş SERT&#39;in FSEC. Triptofan artıklarının floresan SERT (: 280 nm; Emisyon: Uyarma 335 nm) tespit etmek için kullanılmıştır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> Şekil 4:. Temsilci SERT Antikorların Analizi. Western blot ile antikorların taranması. Yaklaşık 1 mikrogram GFP ile veya olmadan SERT CC 4 uygulandı -% 15 SDSPAGE jel ve bir nitroselüloz zarı üzerine beneklendirilmiştir. Bağlama IR boyası konjüge edilmiş bir keçi anti-sıçan antikoru kullanılarak tespit edildi. 2G4 ve 10F2 batı olumlu. B bulunmaktadır. FSEC 100 nM GFP etiketli eki ve algılama antikorların bağlanma GFP floresan kullanılarak tespit edildi. C. 1 mM serotonin. D varlığında 100 nM GFP etiketli Sert seçilen Fab&#39;ların bağlanması. 8A11 ve 15B8 Fab&#39;ın bağlanma SERT-8B6 için Fab. 18 mL akıtılarak minör zirveleri ücretsiz GFP vardır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> Şekil 5: Sf9 hücrelerinden 8B6 Fab&#39;ın Örnek saflaştırılması için uygun değildir.. Elüsyon profili His-tag afinite kromatografisi yolu ile 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm&#39;de gözlenmiştir<html> hy. % 50 (0 - - 250 mM) B. Yeşil iz imidazol konsantrasyonunu, 0 temsil eder. Indirgeyici olmayan ve His-etiketi afinite saflaştırmadan sonra, SDS-PAGE jeli azaltır. 50 kDa yakınına kadar protein indirgenmemiş Fab (#) ve kDa Fab (*). C azalır 25 ° küçük bir türdür. Elüsyon profili, doğrusal bir sodyum klorür gradyanı altında elüt edilmektedir tek simetrik tepe gösteren katyon değişimiyle 8B6 Fab saflaştırılması 280 nm&#39;de gözlendi. % 100. (0 - - 500 mM) D yeşil iz NaCl konsantrasyonu, 0 temsil eder. Katyon değişim. E ile saflaştırma sonrasında% 12.5 SDS-PAGE jeli üzerinde 8B6 Fab analizi. GFP floresan kullanılarak tespit, 10 nM GFP etiketli SERT için 8B6 Fab bağlanması. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> e 6 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; Şekil 6:. Varlığı S -citalopram A SERT-8B6 Kompleksi&#39;nin Temsilcisi Jel Filtrasyon Kromatografisi. saflaştınldı SERT-8B6 kompleksinin Jel filtrasyon elüsyon profili. 11.5 mL elüsyon ana pik SERT-8B6 kompleksidir. 15 tepe -. 17 mL GFP ve Fab B içerir. % 15 SDS-PAGE jeli - 4 üzerinde saflaştırıldı SERT-8B6 kompleksi analizi. SERT ve Fab ağır ve hafif zincirlerinin pozisyonları tire. C ile gösterilir. beden ayrılan fraksiyonların FSEC. SERT-8B6 kompleksleri triptofan floresan kullanılarak tespit edildi. Fraksiyon 17 Fab ile kompleks vermedi SERT daha büyük bir miktarda içerir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7,"src = &quot;/ files / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot; /&gt; Şekil 7:. S -citalopram A Bound SERT-8B6 Kompleksinin Kristalizasyon. büyüme 2 hafta sonra SERT-8B6 kompleksinin paralel yüzlü şekilli kristallerin ışık mikroskobu. Ölçek çubuğu 200 mikron. B eşittir. SERT-8B6 kristalleri 3.15 Å X-ışınları yaymak. Mavi halka 3.15 Å temsil eder. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Tablo 1:. S -citalopramın Bound SERT-8B6 Kompleksi için bir Kristalizasyon Ekranı <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">Bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram at JoVE.com

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

15.0K Görüntüleme.  Oregon Health & Science University.  Bu el yazması, mutasyonlar termo için ekran insan serotonin taşıyıcı arındırmak, yüksek afiniteli antikorların üretilmesi ve antidepresan ilaç S -citalopramın bağlı serotonin taşıyıcı-antikor kompleksi kristalize açıklamaktadır. Bu protokol için diğer zor membran ileticileri, reseptör ve kanal çalışması için adapte edilebilir. 

Video: Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

S100A12&#39;nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Biyokimya

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları<em&gt; Bacillus</em&gt; - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

İfade, Solubilization ve ökaryotik Bor taşıyıcılar arıtma

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcıların İfade Edilmesi ve Saflaştırılması için Stratejiler

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

Yazar Spotlight: Kodon İçin Optimize Edilmiş Genler Kullanılarak İnsan Çözünen Taşıyıcı Taşıyıcılarının İfadesi ve Saflaştırılması 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

Yapısal ve biyokimyasal çalışmalar için insan çözünen taşıyıcılarının yüksek verimli ekspresyonu ve saflaştırılması

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Aşırı Ezme ve İnsanın Saflaştırılması<em&gt; Cis</em&gt; -prenıltransferaz in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Termo, İfade, saflaştırılması, ve İnsan serotonin Transporter Kristalizasyon Bound

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

PLAYLIST