Name: thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram
Uploaded: 2016-11-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
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We thank D. Cawley for generating monoclonal antibodies. We thank A. Penmatsa and K. Wang for sharing ideas and expertise developed from the dopamine transporter. L. Vaskalis for assistance with figures, H. Owen for help with manuscript preparation and other Gouaux laboratory members for helpful discussions. J.A.C. has support from a Banting postdoctoral fellowship from the Canadian Institutes of Health Research. E.M.G. is supported by the National Science Foundation Graduate Research Fellowship. We are particularly grateful to Bernie and Jennifer LaCroute for their generous support, as well as for funding from the NIH (5R37MH070039). E.G. is an investigator of the Howard Hughes Medical Institute.

<ol>
	<li>Kristensen, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLC6+neurotransmitter+transporters:+structure,+function,+and+regulation.">SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation.</a> Pharmacol Rev. 63 (3), 585-640 (2011).</li><li>Broer, S., Gether, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+solute+carrier+6+family+of+transporters.">The solute carrier 6 family of transporters.</a> Br J Pharmacol. 167 (2), 256-278 (2012).</li><li>Andersen, J., Kristensen, A. S., Bang-Andersen, B., Stromgaard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+understanding+of+the+interaction+of+antidepressant+drugs+with+serotonin+and+norepinephrine+transporters.">Recent advances in the understanding of the interaction of antidepressant drugs with serotonin and norepinephrine transporters.</a> Chem Commun (Camb). 25 (25), 3677-3692 (2009).</li><li>Hahn, M. K., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+impact+of+SLC6+transporter+genetic+variation.">The functional impact of SLC6 transporter genetic variation.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 47, 401-441 (2007).</li><li>Abdul-Hussein, S., Andrell, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilisation+of+the+serotonin+transporter+in+a+cocaine-bound+conformation.">Thermostabilisation of the serotonin transporter in a cocaine-bound conformation.</a> J Mol Biol. 425 (12), 2198-2207 (2013).</li><li>Green, E. M., Coleman, J. A., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermostabilization+of+the+human+serotonin+transporter+in+an+antidepressant-Bound+Conformation.">Thermostabilization of the human serotonin transporter in an antidepressant-Bound Conformation.</a> Plos One. 10 (12), e0145688 (2015).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>De Becker, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+adjuvant+monophosphoryl+lipid+A+increases+the+function+of+antigen-presenting+cells.">The adjuvant monophosphoryl lipid A increases the function of antigen-presenting cells.</a> Int Immunol. 12 (6), 807-815 (2000).</li><li>Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+structures+and+mechanism+of+the+human+serotonin+transporter.">X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter.</a> Nature. , (2016).</li><li>White, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progress+of+membrane+protein+structure+determination.">The progress of membrane protein structure determination.</a> Protein Sci. 13 (7), 1948-1949 (2004).</li><li>Gambotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+enhanced+green+fluorescent+protein+(EGFP)+in+BALB/c+mice:+identification+of+an+H2-Kd-restricted+CTL+epitope.">Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope.</a> Gene Ther. 7 (23), 2036-2040 (2000).</li><li>Galfre, G., Howe, S. C., Milstein, C., Butcher, G. W., Howard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+to+major+histocompatibility+antigens+produced+by+hybrid+cell+lines.">Antibodies to major histocompatibility antigens produced by hybrid cell lines.</a> Nature. 266 (5602), 550-552 (1977).</li><li>Deller, M. C., Kong, L., Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+stability:+a+crystallographer's+perspective.">Protein stability: a crystallographer's perspective.</a> Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 72, 72-95 (2016).</li><li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening.">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).</li><li>Tate, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+seven+different+heterologous+protein+expression+systems+for+the+production+of+the+serotonin+transporter.">Comparison of seven different heterologous protein expression systems for the production of the serotonin transporter.</a> Biochim Biophys Acta. 1610 (1), 141-153 (2003).</li><li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes.">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods Enzymol. 372, 65-86 (2003).</li><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases.">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).</li><li>Faham, S., Bowie, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bicelle+crystallization:+a+new+method+for+crystallizing+membrane+proteins+yields+a+monomeric+bacteriorhodopsin+structure.">Bicelle crystallization: a new method for crystallizing membrane proteins yields a monomeric bacteriorhodopsin structure.</a> J Mol Biol. 316 (1), 1-6 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

생물 리 학적 기술에 의해 세포막 단백질 구조의 결정은 많은 심각한 의학적 수송 수용체 및 채널 (11) 발굴 사업 남아있다. 여기에서 우리는 S의 시탈 로프 람 바인딩 인간의 세로토닌 수송 체의 구조 결정을 위해 개발 된 상세한 전문 지식을 공유 할 수 있습니다. 우리는 이러한 방법은 다른 구조적 상태뿐만 아니라 다른 어려운 막 단백질의 구조에 SERT의 구조를 결정하기 유용 할 것으로 기대. 또한, 여기에 설명 된 기술들은 생화학 세제 정제 SERT 및 가까운 천연 지질 환경의 기능을 연구하는데 사용될 수있다. SERT 결정화 여러 도구와 방법의 개발에 힌지. 첫째, 수송 열 안정성 개선은 막 6에서 수송의 추출 다음과 같은 다양한 세제 미셀에 잘 행동했다 SERT의 변종을 생산했다. 둘째, 사용정제 및 결정화에 걸쳐 높은 친 화성 리간드 S의 시탈 로프 람 더욱 향상된 안정성 및 감소 된 구조적 이질성. 셋째, 접종 결정화 양을 용이하게 이주 단기간에 SERT 대량 생산에 허용 BacMam 발현 시스템 (7)의 발전. 마지막으로, 전략의 개발이 결정에 SERT - 항체 복합체의 잘 정렬 된 포장을 촉진 8B6 항체의 발견 허용 3D 에피토프를 인식 높은 친 화성 항체를 선택합니다. 종종 프로토콜에 걸쳐 발생할 중요한 단계 및 시약뿐만 아니라 공통의 문제점이있다. 먼저, 높은 역가 SERT P2 바이러스의 발생이 문제가 될 수있다. 이 프로토콜에 기재된 P2 바이러스를 생성 P1 바이러스의 낮은 농도를 추가하는 것은 일반적으로 이러한 문제를 완화하고, P2 바이러스 역가가 낮은 경우에, P3 바이러스 날기하게 할 수있다0.0001의 MOI에서 g 바이러스. 1 × 10 8 바이러스 입자 미만의 역가와 바이러스 / mL를 사용할 수 없습니다 거의 항상 낮은 단백질 수율가 발생합니다. 표현의 경우, 감염된 HEK293S GnTI은 - 그들은 N 복잡한 N의 -glycans를 합성 할 수 없습니다, 따라서 내가 활동을 -acetylglucosaminyltransferase 및 부족하기 때문에 세포 대신 만 높은 만노스의 N의 -glycans 생산, 선택되었다. EndoH의 절단은 N은 아스파라긴에 부착 된 N의 -acetylglucosamine을 떠나, 세포 외 루프 2 (EL2)의 두 사이트에서 높은 만노스 글리 칸의 글리코 실화를 -linked. N의 소화는 설탕이 결정화 가능성이 중요하다 EL2의 표면 엔트로피를 감소 -linked. 항체의 생성을 위해 상기 IC SERT 예방 접종에 사용되어야한다. GFP 12 고도로 면역 원성이고 완전히 SEC에 의해 제거하는 것이 곤란하기 때문에 항체를 생성하는 융합 태그로서 사용되어서는 안된다. SERT의가요 N- 및 C- 말단은 없었다이들 영역에 대한 항체를 방지하기 위해 구조물에 포함. 마우스는 재구성 된 단백질의 30 μg의와 예방 접종을 할 수있다; 항체의 높은 혈청 농도를 검출 할 수있을 때까지 면역화 된 마우스를 계속 설명 (13) 하이 브리 도마 세포를 생성한다. thermostabilized 구조는 일반적으로 예방 접종을위한 최선의 선택; 반송 장치가 바르게 행동이며, 정제 다음의 생물학적 활성을 유지한다면, 이것은 종종 항체를 발생하기에 충분하다. 8B6 항체는 WT SERT에 대해 제기되었다. 결정화, FSEC 판단으로 단 분산 복합체를 함유 SEC 만 피크 분획을 합치고 농축한다. SERT-8B6 결정은 조건의 좁은 범위에서 성장하고 구체적으로 SERT의 결정 성장과 관련된 문제를 해결하기 위해주의해야 단계가 있습니다. HCl로 조정 트리스 염기의 버퍼가 결정 성장을 지원하지 않기 때문에, 저류 액에 사용되어서는 안된다; 그것은 따라서 CRI입니다광 케이블 (optical) 대신 NaOH로 조정 트리스를 사용합니다. 결정이 성장하지 않거나 많은 작은 결정이 관찰되면, PEG 400 농도도 작은 증감이 의뢰 될 것인지 결정하도록 SERT은 PEG 400의 좁은 농도 범위로 성장한다. 또한, 첨가제 -6- 아미노 헥산 산 또한 핵을 향상시키기 위해 최적화 된 스크린에 사용되었다. 단백질의 감소 비율 : 웰 용액은 결정 성장 인자를 결정하는 핵심이다. 일반적으로 큰 3 차원 결정의 성장을 지원하는 1 : 2에 가까운 드롭 비율로, 권장 1 : 2-1.5의 비율을 삭제합니다. 마지막으로, 낮은 프로파일 24- 웰 플레이트의 사용은 아마도 때문에 증기의 확산 속도 수정을 또한 결정 성장 방향으로 중요하다. 인민 방법으로 다른 방법이 시험 5를 결합하는 필터를 사용하여 코카인 - 결합 된 형태로 래트 세로토닌 전달체를 안정화 변이체 스크리닝하기 위해 개발되었다. 대조적으로, SPA 바SED 분석은 리간드에 결합 남아 SERT의 비율의 결정에 의해 다음과 같은 순서 가열 단계 수 있습니다. 따라서,이 샘플의 소수의 용융 온도의 신속한 측정을 허용한다. 스파 방법은 방사성 표지 높은 친 화성 리간드의 가용성에 의존하고 더 리간드가 submicromolar 선호도와 결합되는 알려져 있지 않은 경우 다음 다른 방법이 필요합니다. 많은 다른 방법이 일반적으로 형광 염료 및 열량 (14)의 결합으로 단백질 안정성을 측정하는 데 사용되어 있지만 낮은 처리량을 직접 측정 기능 또는 단백질을 다량 필요로하거나없는된다. SPA에 법을 사용할 수없는 경우, 하나의 대안 높은 처리량 방법은 샘플을 수송 잔여 분획을 분리 하였다 가열 FSEC 계 열 안정성 분석 15 (FSEC-TS)이다. FSEC-TS는 크로마토 동작 및 올리고머 상태에 액세스하기위한 유용한 방법이며 AP 인인민 방법과 함께 사용할 수 있습니다 owerful 보완적인 도구입니다. 다양한 일반적인 단백질 발현 시스템의 비교도 SERT 식 (16)에 대한 포유 동물 세포의 사용을 선호하는 것으로하고, 당연히이 가능성 포유류 기원의 다양한 단백질에 대한 경우이다. 우리는 표현을 위해 사용한 방법은 SERT에 맞게 조정하지만 가능성이 쉽게 적응할 수있다. 발현의 높은 수준을 선호하는 조건은 신중 나트륨 부티레이트 히스톤 데 아세틸 라제 억제제의 발현 온도 바이러스 농도, 및 현재의 시간 변화에 의해 식별되어야한다. 우리는 일반적으로 이전 바인딩 높은 친 화성 리간드를 유지하기 위해 재구성하는 CHS와 함께 같은 C12M 같은 가벼운 긴 사슬 세제의 선호도 정화를 선호. 소수성 흡수를 사용하여 재구성은 우리가 여러 가지 다른 운송 및 수용체에 대한 효과적인 것으로 나타났습니다 가벼운 기술이다. 이 경우투석, 희석, 또는 SEC에 의해 높은 임계 미셀 농도 세제의 제거 (17)가 항원은 세제 충분히 안정 제공 성공적으로 이용 될 수 없습니다. 더 적합한 항체가 발견되지 않는 경우에, 우리는 거의 항상 문제가 기능 또는 항원의 변성의 손실에 기인하며 이러한 경우 우리가 성공적으로 단백질의 생화학에 특별한주의를 지불하는 새로운 예방 접종을 실시 찾을 수 있습니다. 마지막으로 높은 친화 도로 결합 리간드 및 항체를 합리적으로 계획된 정석 실험을위한 기초를 형성해야하며, 내열성 변형을 이용하여, 하나는 다른 계면 활성제의 성질을 변화시킴으로써 조건의 넓은 범위를 선별 할 수있다. 또한, 지질 메소 18 bicelles 결정화 또는 19을 사용하여 항상 미셀 결정화 대안으로 고려되어야한다. 이러한 원리 및 방법은 약간의 후 변형과 함께 사용될 수있다표현하고 다른 표현 호스트에서 정화, 높은 친 화성 약물의 표적의 구조 결정에 특히 유용하기 어려운 다른 많은 횡단 단백질 양이온.

세로토닌 운반체 (SERT)는 세포막에 걸쳐 1 세로토닌의 수송을 용이하게하는 세포막 단백질이다. SERT 또한 도파민과 노르 에피네프린 수송 (2) 신경 전달 물질 나트륨 Symporters (NSSS)의 가족에 속한다. 세로토닌 SERT 경쟁적 수송층 (3)을 억제하는 작용을 널리 처방 우울 및 항 불안 약물의 분자 표적이다. SERT는 시냅스 틈새에서 신경 전달 물질을 제거하는 나트륨의 에너지 적으로 유리한 cotransport을 이용한다. 세로토닌 시스템의 광범위한 특성은 세로토닌 대사의 변화가 거의 기분, 수면, 통증,인지 등 모든 신경 프로세스에 영향을 미칠 것으로 보입니다 것으로 나타났습니다, 그리고 침략은 4 행동들. SERT 함수 S의 시탈 로프 람과 같은 항우울제 및 선택적 세로토닌 재 흡수 억제제 (SSRI는)의 사용을 통해뿐만 아니라 psychostimula 의해 변형 될 수있다국세청 및 암페타민과 3,4- 메틸렌 디 옥시 N의 -methylamphetamine 또는 &quot;엑스터시&quot;1, 2 등의 중독의 약물. SSRI는 기분 장애의 치료에 대단히 중요하다, 그러나 자신의 행동에 대한 정확한 구조적으로는 잘 이해되지 않습니다. WT SERT 따라서 SERT 5,6의 3 차원 구조의 진전을 저해 세제 미셀 불안정하다. 최근에는 세제의 넓은 범위에서 견고하게 안정하고 활성 6 바인딩 SSRI 유지 SERT의 변이체를 개발 하였다. 이 내열성 SERT의 변형은 섬광 근접 기반의 열 안정성 분석을 이용하여 선정되었다. 여기에서 우리는 항체 및 S의 시탈 로프 람 복잡한에, SERT을 결합 할 수있는 높은 친 화성 항체의 생성을위한 절차 및 내열성 SERT의 정제 및 결정화에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 SERT 및 8B6 유전자가 성공적인 된 것으로 가정Y는 각각 BacMam 7 및 곤충 발현 벡터에 클로닝. 항체를 생성하려면, cDNA를 코딩하는 잔류 WT SERT의 73-616은 C 말단 연쇄상 구균 II 태그 (SERT IC)와 BacMam 벡터에 클로닝 하였다. 열 안정성 화면 들어 SERT 잔기 C 말단 GFP와 73-616, 패 혈성 II 및 10 그의 태그 (SERT의 TC)를 사용 하였다. 개별 점 돌연변이는 SERT TC 배경에서 발생했다. 결정화 프로토콜의 경우, SERT-GFP 융합 단백질 표면 시스테인 C554A, C580A의 열 안정성 돌연변이, Y110A, I291A, 및 T439S 돌연변이를 들고, 트윈 연쇄상 구균 [TrpSerHisProGlnPheGluLys (GlyGlyGlySer) 2 GlyGlySerAlaTrpSerHisProGlnPheGluLys] 10-그의 태그 사용 및 C622A (SERT의 CC). 트롬빈 절단 서열 (LVPRGS)도 N- 제거 및 C 말단을 허용 Q76 및 T618 후 SERT의 CC에 삽입 하였다. 8B6 팹을 코딩하는 플라스미드는 무거운 빛을 모두 표현하기 위해 설계되었다두 개의 별도의 폴리 헤드린 프로모터의 조절하에 GP67 분비 서열과 항체의 사슬. 8B6 항체의 중쇄의 C- 말단 8 His 태그를 태그로하고, 트롬빈 ​​절단 부위는 중쇄 및 태그 사이에 삽입 하였다.

<table><tbody><tr><td>DH10Bac</td><td>Invitrogen</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Fisher</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Fisher</td><td>BP918-1</td><td></td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma</td><td>T-7660</td><td></td></tr><tr><td>Bluo-gal</td><td>Invitrogen</td><td>15519-028</td><td>5-Bromo-3-indolyl &amp;beta;-D-galactopyranoside</td></tr><tr><td>Isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>I1003</td><td>IPTG</td></tr><tr><td>Miniprep kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td>Sf9 transfection reagent</td></tr><tr><td>Sf9</td><td>ATCC</td><td>CRL-1711</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 III SFM media</td><td>Life Technologies</td><td>12658-027</td><td></td></tr><tr><td>HEK-293S GnTI&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293 media</td><td>Life Technologies</td><td>12338-018</td><td>293 expression media</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>0984018DJ</td><td></td></tr><tr><td>Sodium butyrate</td><td>Sigma</td><td>303410</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;-citalopram</td><td>Sigma</td><td>E4786</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>Cholesteryl hemmisuccinate</td><td>Sigma</td><td>C6013</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850457P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoethanolamine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850757P</td><td></td></tr><tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphoglycerol</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840457P</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatin A</td><td>Sigma</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1000-05</td><td></td></tr><tr><td>Asolectin</td><td>Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C-8667</td><td></td></tr><tr><td>Lipid A</td><td>Sigma</td><td>L5399</td><td></td></tr><tr><td>Brain polar lipid</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>141101C</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads</td><td>Biorad</td><td>152-3920</td><td>Hydrophobic absorption resin</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IRDye 680RD</td><td>Odyssey</td><td>926-68070</td><td>Used as secondary antibody for western blotting</td></tr><tr><td>Lauryl maltose neopentyl glycol</td><td>Anatrace</td><td>NG310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Serotonin</td><td>Sigma</td><td>H9523</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac 8B6</td><td></td><td></td><td>Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT Strep II</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;IC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;TC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>pEG Bacmam SERT ts3 GFP twin Strep His</td><td></td><td></td><td>SERT&lt;sub&gt;CC&lt;/sub&gt;, Available from authors</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>n-Octyl &amp;beta;-D-maltoside</td><td>Anatrace</td><td>O310</td><td>Anagrade</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Haematologic Technologies</td><td>HCT-0020</td><td></td></tr><tr><td>EndoH</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Tris is used for preparation of crystallization reservoirs</td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Sigma</td><td>91893</td><td></td></tr><tr><td>6-aminohexanoic acid</td><td>Sigma</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Fisher</td><td>MT25052CV</td><td></td></tr><tr><td>Isoplate-96 TC</td><td>PerkinElmer</td><td>6005070</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen</td><td>SL100688</td><td>Polymer transfection reagent for mamalian cells</td></tr><tr><td>Copper HIS-Tag YSI SPA Beads</td><td>PerkinElmer</td><td>RPNQ0096</td><td>His-tag affinity SPA beads</td></tr><tr><td>Citalopram, [N-Methyl-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET1039250UC</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000023</td><td>heating block for thermostability assay</td></tr><tr><td>ThermoTop</td><td>Eppendorf</td><td>5308000003</td><td></td></tr><tr><td>SmartBlock PCR 96, thermoblock for PCR plates</td><td>Eppendorf</td><td>5306000006</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m syringe filter</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-243</td><td></td></tr><tr><td>1 L filter system</td><td>Corning</td><td>430517</td><td></td></tr><tr><td>2 L flat bottom tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000</td><td></td></tr><tr><td>2 L baffled tissue culture flask</td><td>Genemate</td><td>F-5909-2000B</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3950</td><td></td></tr><tr><td>Forma Orbital Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>416</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin resin</td><td>Iba Life Sciences</td><td>2-1208-025</td><td>Strep affinity resin</td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Northern Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Li-Cor imaging system</td><td>Odyssey</td><td></td><td>western blot imaging system</td></tr><tr><td>XK16 column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9889-37</td><td>column used for Strep-Tactin and Talon purificaiton</td></tr><tr><td>100 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO protein concentrator</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;kta FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>UPC-900</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>51476</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 (10/300) column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td>Used for FSEC</td></tr><tr><td>Tangential flow apparatus</td><td>Pall Filtron</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 &amp;micro;m filter tangential flow cell</td><td>Pall Filtron</td><td>PSM20C11</td><td></td></tr><tr><td>30 kDa MWCO tangential flow concentrator</td><td>Pall Filtron</td><td>OS030T12</td><td></td></tr><tr><td>Talon resin</td><td>Clonetech</td><td>635504</td><td>His-tag affinity resin used for Fab purification</td></tr><tr><td>1 mL HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td>Cation exchanger used for Fab purification</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL column</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5175-01</td><td>Used for SEC separation of SERT-8B6</td></tr><tr><td>24-well VDXm plate</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-306</td><td></td></tr><tr><td>18 mm coverslips</td><td>Hampton Research</td><td>HR3-239</td><td></td></tr><tr><td>Virocyt virus counter</td><td>Virocyt</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>MicroBeta Trilux</td><td>PerkinElmer</td><td>1450</td><td>96-well scintillation counter</td></tr><tr><td>HiTrap SP column</td><td>GE Healthcare</td><td>17115101</td><td></td></tr><tr><td>Sertraline</td><td>Sigma</td><td>S6319</td><td></td></tr></tbody></table>

thermostabilization, expression, purification, and crystallization of the human serotonin transporter bound to s-citalopram

세로토닌 전달체는 세포로 세포 세로토닌 &quot;펌프&quot;는 나트륨과 염소 결합 수송된다. S의 시탈 로프 람은 세로토닌 재 흡수를 차단하는 고 친화력 세로토닌 운반체에 결합함으로써 우울증 및 불안증의 치료에 사용되는 약물이다. 여기에서 우리는 효율적인 절차 및 명시 적, 안정 정화 및 S의 시탈 로프 람과 다른 항우울제에 결합 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 구체화 할 수있는 도구 세트를보고한다. 세로토닌 전달체를 안정화 돌연변이는 결합 분석을 S - 시탈 로프 람을 사용하여 확인 하였다. 배큘로 바이러스 - 형질 감염된 HEK293S GnTI 발현 세로토닌 운반자 - 세포로 재구성 테오 높은 친 화성 항체를 발생하기 위해 사용되었다. 우리는 구조 연구를위한 유용한 항체를 발견하는 전략을 개발했습니다. Sf9 세포에서의 항체 단편의 발현을위한 직접적인 방법은 확립되어있다.이 절차를 사용하여 정제 수송 - 항체 복합체는 잘 행동하고 쉽게 3-4 Å 해상도에 X 선을 회절 S의 시탈 로프 람과 복합체를 생산, 결정화입니다. 여기서 개발 된 전략은 다른 도전 막 단백질의 구조를 결정하는데 이용 될 수있다.

SERT TC 배경에 하나의 점 돌연변이의 라이브러리는 돌연변이를 thermostabilizing위한 화면으로 만들어졌습니다. 각각의 돌연변이 체는 표준 돌연변이 유발을 이용하여 생성 하였다. 그림 1A에 설명 된대로 선별 프로토콜은 일시적으로 빠르게 정체성 결정에 유용한 돌연변이에 감염된 HEK293S 세포와 섬광 근접 기반의 열 안정성 화면을 형질 사용한다. 플로팅 Tm은 값을 바운드 [3 H] RT에서 시탈 로프 람은 높은 열 안정성과 표현 수준에 적합한에게와 구조를 보여준다 대 단백질 정제 용 (그림 1B). 세 돌연변이 (Y110A, I291A 및 T439S)은 매우 안정한 구조체 (도 1C)를 생성하기 위해 결합시켰다. 내열성도 SERT 팹 복합체의 결정화에 필요한 단쇄 세제 증가 된 안정성과 관련된다. 배큘-TR을 사용하여 SERT 인간의 대규모 발현ansduced 감염된 HEK293S GnTI는 - 세포는 2 주 미만 걸릴 수 있으며,도 2a에 도시 된 바와 같이, 밀리그램 양을 생산할 수있다. GFP의-태그 SERT의 CC 단백질의 사용은 SERT 편리 형광 (그림 2B)에 의해 발현 및 정제하는 동안 다음에 할 수 있습니다. ; 안정화 지질 등 CHS의 존재 C12M 셀 - 우리의 정제 전략은 1) 감염된 HEK293S GnTI에서 S의 시탈 로프 람에 결합 SERT의 가용화를 포함 2) 연쇄상 구균 친 화성 기질에 SERT의 결합; 광범위한 세정하여 오염 단백질 3) 제거; 4) 버퍼 포함 desthiobiotin (그림 2C)와 기능 SERT의 용출. FSEC (그림 2D, E)에 의해 판단으로 용출 된 단백질은 크게 쿠마 블루 염색에 의해 다른 검출 가능한 단백질의 자유 단 분산이다. 유사한 전략 reconstitutio에 사용 된 연쇄상 구균 II 태그 SERT를 정화 찍은n 및 예방 접종 (그림 3A, B). 테오으로 SERT의 설립은 SERT의 혈청 반감기과 안정성을 향상 높은 친 화성 항체의 분리 가능성을 향상시킨다. 또한, 지질 A의 포함은 세균 세포벽의 성분은 유력한 보조제 구로서 기능한다. 다중 층 리포좀 유리 튜브에 건조 된 지질의 혼합물에 완충액을 첨가하여 제조하고, 완충액에 재현 탁 하였다. 200 nm의 공극 크기의 필터를 통해 리포좀 압출 단 분산 단층 라멜라 리포좀 현탁액을 생성한다. 리포좀이어서 세제 정제 SERT 첨가 한 후 세제로 포화된다. 세제 액 : 마지막으로, 세제 지질 소수성 흡착 수지의 첨가에 의해 제거된다. 추가 리간드는 항우울제 결합 된 형태를 인식하는 항체를 선택하기 위해 재구성 된 샘플에 추가해야합니다. 테오 SERT에서의 존재가 확인되어야SDS-PAGE 로딩 염료 또는 C12M와 작은 샘플을 용해 및 SDS-PAGE 및 FSEC (그림 3C, D)에서 실행. SERT 항체를 발현하는 하이 브리 도마 세포주는 3D 에피토프를 인식 고친 화성 바인더에 대해 스크리닝 할 수있다. 항체가 완전히 균일 한, 잘 정렬 된 도메인의 크리스탈 포장을 촉진하기 위해 구조화 된 영역에 결합되어 있어야 이러한 특성은 결정의 궁극적 인 성공에 매우 중요하다. 첫 번째 단계에서는, 비 구조화 영역을 인식하는 항체가 식별된다. SERT 변성하고 니트로 셀룰로오스 멤브레인 상에 블랏; 변성 SERT을 결합하는 항체는 서쪽 긍정적 가능성 선형 에피토프를 인식합니다. 도 4a에서, 우리는 서부 양성 및 crystallogenesis을 촉진 할 가능성이 유용하지 않습니다 항체의 2 예를 보여줍니다. 도 4b에서, 나머지 웨스턴 음성 항체가 100 nM의 SERT-GFP와 인큐베이션에 의해 구분FSEC. SERT가 이전 위치로 GFP 양성 피크를 이동합니다 결합하는 항체. SERT - 항체 복합체가 FSEC에 의해 분석 한 다음 나노 몰 친화력으로 결합 할 수 있는지 확인하기 위해 추가로 세제를 희석 할 수있다. 구조적 운반체 변화하므로 항체 세로토닌 결과의 첨가가 특히 SSRI 바인딩 형태를 인식 할 수 있는지 확인 rescreened 수있다. 도 4C에서, 상기 항체는 항원 (S)이 결합 된 상태로 기판에 SSRI로 변경하지 않는 것이 도시 세로토닌의 존재 SERT 바인딩 나타낸다. 마지막으로,도 4d에 항체의 조합은 상기 좌측 시프트의 결과로, 고유의 에피토프에 결합하는 능력에 대해 시험한다. 다음은 15B8 또는 8A11 항체 8B6 다른 에피토프를 인식하고 있습니다. 8B6 항체를 파파인 누와 예비 결정 심사에 따라 추가 구조 분석을 위해 선택되었다테드 팹. 8B6 팹의 유전자를 곤충 세포 발현 벡터에 클로닝 하였다. 팹 표현 및 정지에서 성장 Sf9 세포에서 분비 될 수있다. 8B6 팹은 그의 태그 친 화성 (그림 5A, B) 및 SDS-PAGE 젤에 오염 물질이 나타납니다 단백질의 결과 양이온 교환 크로마토 그래피 (그림 5C, D)에 의해 인 Sf9 세포 상층 액에서 정제 할 수있다. 도 5E에서, 재조합 8B6 팹은 SERT 바인딩 도시되고 후속 생화학 및 생물 물리학 실험에 사용된다. 친화도 정제 SERT의 CC는 트롬빈과 EndoH로 분해 및 S의 시탈 로프 람의 존재 복합체를 형성 8B6 팹와 혼합된다. 운반체 - 항체 복합체는 C8M (도 6A)에 SEC에 의해 분리하고 SDS-PAGE (도 6b)로 도시 된 바와 같이 피크 분획 SERT 팹을 모두 포함한다. C8M의 사용은 결정 형성 아마 때문에 매우 중요하다단쇄 세제는 결정 격자에서 분자간 잘 포장 할 수있다. FSEC 결정화를위한 풀링되어야하는 분획을 확인하기 위해 사용된다 (도 6c); 단 분산되지 않고 / 또는 자유 SERT 또는 팹의 많은 양을 함유하는 분획을 결합되어서는 안된다. 프리즘 형상 SERT 항체 결정 드롭 증기 확산 (도 7A)를 매달아이 프로토콜을 이용하여 S의 시탈 로프 람의 존재 하에서 성장시킬 수있다. 생성 된 결정을 3.15 10 (도 7b)의 해상도에 X 선을 회절. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig1.jpg" /> 그림 1 :. 섬광 열 안정성 분석을 근접 기반. [3 H] 시탈 로프 람. B의 존재 내열성 스크리닝 프로토콜의 개요. 최대 바인딩 [3 </겉보기 융점 (Tm)이 대 SUP&gt; H] 시탈 로프 람. 점선은 WT 수송에 대한 값을 나타냅니다. 3 가장 내열성 돌연변이가 표시되어 있습니다. 회색 영역은 낮아 신호대. WT C에 따라서 Tm은 부정확 한 값에 대하여 결합 [3 H] 시탈 로프 람의 10 % 미만이 돌연변이 체를 나타낸다. WT SERT TC 및 상위 3 돌연변이에 대한 열 안정성 곡선. 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig2.jpg" /> 그림 2 :. 포유 동물 이종 단백질 식 (A)의 개요. 감염된 HEK293S GnTI에서 BacMam 바이러스 발생 및 SERT의 표현의 도식화 개요 -. 세포 B. 그K293S GnTI -. SERT의 CC (GFP의 형광) C를 발현하는 세포. 패 혈성 친 화성 수지에 SERT의 CC의 용출 프로파일. 100 % (0 - - 5 mM)을 D. 녹색 추적 desthiobiotin의 농도, 0을 나타냅니다. 15 % SDS-PAGE 젤 E -. 4에 친 화성 정제 SERT의 CC의 분석. GFP의 형광 검출 친 화성 정제 SERT의 CC의 FSEC (여진 : 480 nm의, 방출 : 510 ㎚). 15 mL의에서 용출 피크는 SERT (#)이며, 18 mL의 무료 GFP (*)입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig3.jpg" /> 그림 3 :. SERT IC (A)의 대표 선호도 정화와에서 재구성. 항체 생성의 도식 개요. &lt;강한&gt; B. 용출 프로파일은 패 혈성 친 화성 수지에 SERT IC의 친화력 정화의 280 nm에서 관찰했다. 100 %. (0 - - 5 mM)을 C 녹색 추적 desthiobiotin의 농도, 0을 나타냅니다. 친화도 분석 정제와 4 SERT를 재구성 - 15 % SDS-PAGE 겔 D.. 재구성 다음 가용화 SERT의 FSEC. 트립토판 잔기의 형광 SERT (: 280 nm의, 방출 : 여진 335 nm의)를 감지하는 데 사용되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig4.jpg" /> 그림 4 :. 대표 SERT 항체 분석를했다. 웨스턴 블롯에 의한 항체 검사. 약 1 μg의 GFP 유무에 관계없이 SERT의 CC의는 4인가 - 15 % SDS-PAGE 겔 및 니트로 셀룰로오스 막 상에 블 롯팅. 바인딩은 IR 염료에 접합 된 염소 항 - 마우스 항체를 사용하여 검출 하였다. 2G4 및 10F2 서부 긍정적. B입니다. FSEC 100 나노 GFP - 태그 SERT 및 검출에 대한 항체의 결합 GFP의 형광을 이용하여 검출. C를. 1 mM의 세로토닌. D의 존재에서 100 나노 미터 GFP - 태그 SERT에 선정 된 Fab의 결합. 8A11 또는 15B8 팹의 바인딩 르트-8B6하는 팹을. 18 mL의에서 용출 작은 피크가 무료 GFP입니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/54792/54792fig5.jpg" /> 그림 5 : Sf9 세포에서 8B6 팹의 대표적인 정제를했다.. 용출 프로파일은 그의 태그 친 화성 chromatograp하여 8B6 팹의 정제의 280 nm에서 관찰<html> HY. 50 % (0 - - 250 밀리미터) B. 녹색 추적은 이미 다졸의 농도, 0을 나타냅니다. 비 감소 및 그의 태그 친 화성 정제 한 후 SDS-PAGE 젤을 줄일 수있다. 50 kDa의 단백질 근처 실행 비 환원 팹 (#)와 kDa의 팹 (*). C를 감소 부 25 종이다. 용출 프로파일은 선형 염화나트륨 구배 용출 하에서 단일 대칭 피크를 표시 양이온 교환하여 8B6 팹의 정제의 280 nm에서 관찰했다. 100 %. (0 - - 500 밀리미터) D 녹색 추적 염화나트륨의 농도, 0을 나타냅니다. 양이온 교환. E 그래피 다음 12.5 % SDS-PAGE 겔상의 8B6 된 Fab의 분석. GFP의 형광을 이용하여 검출, 10 나노 GFP - 태그 SERT에 8B6 팹의 결합. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 전자 6 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 54792 / 54792fig6.jpg &quot;/&gt; 그림 6 :. 임재 S의 시탈 로프 람 A의 SERT-8B6 단지의 대표 젤 여과 크로마토 그래피. 정제 SERT-8B6 단지의 젤 여과 용출 프로파일. 11.5 용액에 용출 주 피크는 SERT-8B6의 복잡합니다. 15에서 피크 -. 17 mL를 GFP 및 팹 B가 포함되어 있습니다. 15 % SDS-PAGE 젤 - 4에 정제 된 SERT-8B6 복합체의 분석. SERT 및 팹의 중쇄 및 경쇄의 위치는 대시. C에 의해 도시된다. 크기 구분 분수의 FSEC. SERT-8B6 단지는 트립토판 형광을 사용하여 검출 하였다. 분수 (17)는 팹으로 복잡하지 않았다 SERT의 더 큰 금액이 포함되어 있습니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 7"SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 54792 / 54792fig7.jpg&quot;/&gt; 그림 7 :. S 시탈 로프 람 (A)에 바운드 SERT-8B6 단지의 결정화. 성장 2 주 후 SERT-8B6 단지의 평행 모양의 결정의 광학 현미경. 스케일 바는 200 μm의. B와 동일합니다. SERT-8B6 결정은 3.15 Å으로 X 선을 회절. 블루 링은 3.15 Å를 나타냅니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 표 1 :. S의 시탈 로프 람에 바인딩 SERT-8B6 단지에 대한 결정화 화면 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54792/54792table1.xlsx">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드<em&gt; S</em&gt; 시탈 로프 람

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

thermostabilization-expression-purification-crystallization-human

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

15.0K 조회수.  Oregon Health & Science University.  이 원고는 돌연변이를 thermostabilizing을 선별 인간의 세로토닌 수송을 정화, 높은 친 화성 항체를 생성하고, 항우울제 약물 S의 시탈 로프 람 바인딩 세로토닌 수송 - 항체 복합체를 결정화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 도전 막 수송 수용체와 채널들의 연구에 적용 할 수있다. 

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some S100 proteins have the capacity to bind transition metals with high affinity and effectively sequester them away from invading microbial pathogens in a process that is termed "nutritional immunity". S100A12 (EN-RAGE) binds both zinc and copper and is highly abundant in innate immune cells such as macrophages and neutrophils. We report a refined method for the expression, enrichment and purification of S100A12 in its active, metal-binding configuration. Utilization of this protein in bacterial growth and viability analyses reveals that S100A12 has antimicrobial activity against the bacterial pathogen, Helicobacter pylori. The antimicrobial activity is predicated on the zinc-binding activity of S100A12, which chelates nutrient zinc, thereby starving H. pylori which requires zinc for growth and proliferation.

Here, we present a method to express and purify S100A12 (calgranulin C). We describe a protocol to measure its antimicrobial activity against the human pathogen H. pylori.

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

연구

생화학

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis is an obligate pathogen that causes fatal inhalational anthrax. Bacillus cereus is considered a useful model for studying B. anthracis due to its close evolutionary relationship. The gene cluster ba1554 - ba1558 of B. anthracis is highly conserved with the bc1531- bc1535 cluster in B. cereus, as well as with the bt1364-bt1368 cluster in Bacillus thuringiensis, indicating the critical role of the associated genes in the Bacillus genus. This manuscript describes methods to prepare and characterize a protein product of the first gene (ba1554) from the gene cluster in B. anthracis using a recombinant protein of its ortholog in B. cereus, bc1531.

Recombinant Protein Expression, Crystallization, and Biophysical Studies of a Bacillus-conserved Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Bacillus anthracis is the obligate pathogen of fatal inhalational anthrax, so studies of its genes and proteins are strictly regulated. An alternative approach is to study orthologous genes. We describe biophysicochemical studies of a B. anthracis ortholog in B. cereus, bc1531, requiring minimal experimental equipment and lacking serious safety concerns.

재조합 단백질 발현, 결정화 및 생물 물리학 연구<em&gt; 바실러스</em&gt; 보존 된 뉴클레오티드 피로 인산화 효소, BcMazG

To overcome safety restrictions and regulations when studying genes and proteins from true pathogens, their homologues can be studied. Bacillus anthracis ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

식 및 단일 입자 Cryo 전자 현미경 검사 법에 의하여 구조 결심에 대 한 인간의 지질 민감한 양이온 채널 TRPC3의 정화

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

표현, 가용 화, 그리고 진 핵 Borate 전송기의 정화

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand its catalytic mechanism, allosteric behavior, and details of the enzymatic transformation of substrate to product in PLP-dependent enzymes. In this work, a novel expression system to produce the isolated &#945;- and isolated &#946;-subunit allowed the purification of high amounts of pure subunits and &#945;2&#946;2 StTS complex from the isolated subunits within 2 days. Purification was carried out by affinity chromatography followed by cleavage of the affinity tag, ammonium sulfate precipitation, and size exclusion chromatography (SEC). To better understand the role of key residues at the enzyme &#946;-site, site-direct mutagenesis was performed in prior structural studies. Another protocol was created to purify the wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes. A simple, fast and efficient protocol using ammonium sulfate fractionation and SEC allowed purification of &#945;2&#946;2 StTS complex in a single day. Both purification protocols described in this work have considerable advantages when compared with previous protocols to purify the same complex using PEG 8000 and spermine to crystalize the &#945;2&#946;2 StTS complex along the purification protocol. Crystallization of wild type and some mutant forms occurs under slightly different conditions, impairing the purification of some mutants using PEG 8000 and spermine. To prepare crystals suitable for x-ray crystallographic studies several efforts were made to optimize crystallization, crystal quality and cryoprotection. The methods presented here should be generally applicable for purification of tryptophan synthase subunits and wild type and mutant &#945;2&#946;2 StTS complexes.

This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of Salmonella typhimurium tryptophan synthase comp this protocol a rapid system to purify the protein complex in a day. Covered methods are site-directed mutagenesis, protein expression in Escherichia coli, affinity chromatography, gel filtration chromatography, and crystallization.

PCR 돌연변이 발생, 복제, 발현, 빠른 단백질 정화 프로토콜 및 트립토판 신타제의 야생 유형 및 돌연변이 형태의 결정화

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Strategies for Expressing and Purifying Solute Carrier Transporters

High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, metabolites, neurotransmitters, and pharmaceuticals. Despite having emerged as attractive therapeutic targets and markers of disease, this group of proteins is still relatively underdrugged by current pharmaceuticals. Drug discovery projects for these transporters are impeded by limited structural, functional, and physiological knowledge, ultimately due to the difficulties in the expression and purification of this class of membrane-embedded proteins. Here, we demonstrate methods to obtain high-purity, milligram quantities of human SLC transporter proteins using&#160;codon-optimized gene sequences. In conjunction with a systematic exploration of construct design and high-throughput expression, these protocols ensure the preservation of the structural integrity and biochemical activity of the target proteins. We also highlight critical steps in the eukaryotic cell expression, affinity purification, and size-exclusion chromatography of these proteins. Ultimately, this workflow yields pure, functionally active, and stable protein preparations suitable for high-resolution structure determination, transport studies, small-molecule engagement assays, and high-throughput in vitro screening.

저자 스포트라이트: Expression and Purification of Human Solute Carrier Transporters Using Codon-Optimized Genes 

Structural and biochemical studies of human membrane transporters require milligram quantities of stable, intact, and homogeneous protein. Here we describe scalable methods to screen, express, and purify human solute carrier transporters using codon-optimized genes.

구조 및 생화학 연구를 위한 Human Solute Carriers의 High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies(구조 및 생화학 연구를 위한 인간 용질 담체의 고처리량 발현 및 정제)

Solute carriers (SLCs) are membrane transporters that import and export a range of endogenous and exogenous substrates, including ions, nutrients, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

면역학 및 감염병학

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

항온, 발현, 정제, 인간 세로토닌 전달체 결정화 바운드

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