The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

وقد تمت الموافقة على جميع التجارب بما في ذلك المواد الإنسان من قبل لجنة الأخلاق المحلية (موافقة رقم 3/2/14). لاختيار المرضى تجدر الإشارة إلى أن هناك عدة عوامل مثل العمر والجنس ونظم العلاج الحالية وغيرها الكثير قد تؤثر على تكوين MV في الدم، وبالتالي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار قبل عينة جمع 22،23. 1. إعداد عينات البلازما <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 1-2 أنابيب من الدم في المانحة من خلال عيار 21 فراشة إبرة في أنبوب vacutainer جمع الدم التي تحتوي على EDTA (1.6 ملغ / مل دم). تأكد من عكس الأنبوب (ق) عدة مرات لضمان كفاءة مضادات التخثر في الدم. ملاحظة: حجم الموصى بها من الدم لالتدفق الخلوي لاحق وتحليل البقعة الغربية هو 5-15 مل. من أجل منع تدهور MV والخسارة، ويجب التعامل مع عينات الدم &lt;30 دقيقة بعد انسحاب الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات البلازما بواسطة الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة في 1200 x ج فيدرجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق عامل تصفية صمام من أجل المساعدة في فصل البلازما (= الطبقة العليا) من خلايا الدم (= الطبقة السفلى) المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البلازما في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1500 x ج، RT لتكوير أكبر الحطام الخلية وإزالة الصفائح الدموية المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف في أنبوب 15 مل، والشروع مباشرة مع العزلة أو تخزين عينات MV لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن أيضا بروتوكول المعروضة استخدامها لعزل MVS (وExos) من supernatants ثقافة الخلية. من أجل القيام بذلك، وزراعة الخلايا في 60-80٪ confluency ل24 - 48 ساعة في مستنبت تستكمل مع المنضب حويصلة FCS، ثم جمع طاف. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 750 x ج، 4 درجة مئوية إلى أن تستنفد خلايا العائمة المتبقية، وملء طاف في جديد 15 مل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 1500 x ج، 4 درجات مئوية لتكوير أكبر الحطام الخلية. ويمكن بعد ذلك طاف استخدامها لعزل MVSكما هو موضح في الخطوة 2،1-2،16. </li></ol> 2. عزل MVS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة البلازما في أنبوب الطرد المركزي مناسبة. إذا لزم الأمر، تملأ أنبوب مع برنامج تلفزيوني من أجل تخفيف العينة ومنع انهيار أنابيب رقيقة الجدران أثناء إجراء الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 35 دقيقة في 14000 x ج، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف صب، والحفاظ على أنابيب تحولت رأسا على عقب وضعت على منشفة ورقية. الانتظار 3-5 دقائق حتى تم غارقة جميع طاف المتبقية في منشفة، وبالتالي إزالتها من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية MV في 1000 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني، ونقل إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 35 دقيقة في 14000 x ج، 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الطاولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية MV في 50-500 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني، وهذا يتوقف على حجم الكرية. بدلا من ذلك، ليز MVS مباشرة، على سبيل المثال، في المخزن المعهد الملكي (150 ملي مول كلوريد الصوديوم / 0.1٪ SDS / 0.5٪ نا deoxycholate / 1٪ تريتون X-100/50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.2)لتحليل البقعة الغربية لاحقا. متجر MVS في -20 درجة مئوية. وسوف يظل مستقرا لعدة أشهر، ولكن تجنب تكرار تجميد أذاب دورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: تحديد تركيز البروتين MV مع فحص البروتين (على سبيل المثال، برادفورد أو طريقة لوري) من أجل تقييم غلة MV أو جرعة MVS لتجارب لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا Exos إضافية هي أن تكون معزولة من عينات البلازما، صب طاف من الخطوة 2.3 في أنبوب تنبيذ فائق وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة عند 110000 x ج، 4 درجات مئوية. صب وطاف كما هو موضح في الخطوة 2.3، و resuspend إكسو بيليه في 1000 ميكرولتر برنامج تلفزيوني ونقل إلى أقسام صغيرة (1.5 مل) أنابيب تنبيذ فائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة لمدة 2 ساعة عند 110000 x ج، 4 درجات مئوية، نضح طاف و resuspend إكسو بيليه في 50-75 ميكرولتر برنامج تلفزيوني أو عازلة RIPA. </li></ol></li></ol> 3. توصيف MVS بواسطة التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 15 ميكرولتر PBS + 1٪ المنضب حويصلة مصل العجل الجنين (FCS) في أنبوب التدفق الخلوي. ملاحظة: يتم إعداد المنضب الحويصلة FCS بواسطة الطرد المركزي المعطل الحرارة (30 دقيقة عند 56 درجة مئوية) FCS لمدة 18 ساعة في 110000 x ج والترشيح طاف من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر كما هو موضح سابقا (24). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكروغرام (في حالة العائدات المنخفضة 3 ميكروغرام تنطبق أيضا) من MVS في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT من أجل حجب المواقع ملزمة غير محددة على سطح MV وبالتالي الحد من تلوين الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأضداد fluorescently المسمى ضد المصلحة البروتين من. عاير كمية من الأجسام المضادة المستخدمة في تلوين قبل استخدامها من أجل تحديد تركيز الأمثل وضمان انخفاض التموينية الإشارة إلى الضوضاء. تأكد من أن تشمل أيضا أنبوب واحد مع MVS غير ملوثين كما المراقبة السلبية وأنبوب واحد من MVS ملطخة الأجسام المضادة مطابقة isotype السيطرة في نفس التركيز (على سبيل المثال، إذا تم استخدام 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة، أيضا استخدام 1 ميكروغرام من لisotype السيطرةtibody) لتحديد تلوين الخلفية. ملاحظة: من الممكن أيضا لأداء تدفق متعدد الألوان الخلوي بإضافة الأجسام المضادة متعددة بالإضافة إلى fluorochromes مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني والمضي قدما في قياس العينة باستخدام قياس التدفق الخلوي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة أن العينات لا يمكن أن يقاس على الفور، إضافة 150 ميكرولتر برنامج تلفزيوني و 50 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لإصلاح العينات وتخزينها في 4 درجات مئوية. تنبيه: PFA سامة. استخدام القفازات ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيض عتبة قياس التدفق الخلوي إلى أدنى قيمة ممكنة والبحث عن السكان MV باستخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة في مقياس لوغاريتمي. بوابة على السكان MV وتقييم إشارة الفلورسنت في الرسم البياني المقابل. </li></ol> 4. توصيف MVS بواسطة الغربية التنشيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية MV مباشرة فيمنطقة عازلة تحلل مناسب (على سبيل المثال، المعهد الملكي عازلة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حال تم بالفعل معلق بيليه MV في برنامج تلفزيوني، وتخفف من 1: 1 على الأقل في منطقة عازلة تحلل مناسب (على سبيل المثال، عازلة RIPA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين من العينة MV، على سبيل المثال، عن طريق لوري الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10-20 ميكروغرام من MVS في 22.5 عازلة ميكرولتر المعهد الملكي. ثم يضاف 7.5 ميكرولتر 4X Laemmli العازلة تحميل والحرارة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحمل على هلام بولي أكريلاميد وأداء الكهربائي وimmunoblotting وفقا لبروتوكولات موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل البروتينات على الغشاء، إجراء تلطيخ الشقائقية كما تحكم التحميل وفقا لبروتوكولات موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء يزيل اللون في TBST لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء كتلة لمدة 30 دقيقة حتى 1 ساعة عند RT في 5٪ BSA في TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية خلال الليل أو لمدة 2 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء مع TBST 3 × 5 دقائق.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة HRP-في التخفيف من 1: 10000 في 5٪ BSA. ملاحظة: في حالة الإشارات خلفية عالية، واستخدام مسحوق الحليب بدلا من جيش صرب البوسنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء مع TBST 3X 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير الغشاء مع كشف كاشف أطلق بيت التمويل الخليجي والكشف عن إشارات على الأفلام التوهج أو نظام التوهج التصوير. ملاحظة: من أجل التمييز MVS من Exos، والبروتينات مثل تويولين، actinin-4 أو mitofilin يمكن استخدامها والتي ينبغي أساسا أن تكون موجودة على MVS 16،25. الانتباه إلى أن الأجسام المضادة الأكثر tetraspanin (على سبيل المثال، CD9، CD81)، وتستخدم كعلامات لExos، لا تعمل في ظل ظروف الحد، وبالتالي يجب أن يكون مستعدا في المخزن غير الحد تحميل يليه التسخين لمدة 10 دقيقة عند 70 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, (2015).</li><li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA.">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180 (2011).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells.">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li><li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+trail+left+in+blood.">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li><li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid.">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).</li><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li><li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis.">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li><li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria.">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).</li><li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus.">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure.">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li><li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients.">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li><li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN.">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li><li>Moon, P. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection.">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer.">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy.">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans.">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles.">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li><li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Incorporation+of+CD45,+CD80+(B7-1),+CD86+(B7-2),+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles:+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation.">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li><li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens:+an+analysis+by+flow+cytometry.">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li><li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., L&#246;sche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes:+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P.">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li><li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation.">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li><li>Rupp, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes:+role+of+proteolytic+cleavage.">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> وقد أثبتت الدراسات الحديثة في المركبات الكهربائية في الدم الذي تكوين EV وتعول تتغير خلال ظهور العديد من الأمراض. ولذلك، فإن تحليل وتوصيف مزيد من هذه المركبات الكهربائية ذات فائدة عالية لمواصلة تقييم استخدامها المحتمل والمؤشرات الحيوية المرض التشخيص والتشخيص أو لتقييم الاستجابات العلاج. بروتوكول نقدم هنا يسمح للعزلة الحويصلات التي يبلغ قطرها يصل إلى 600 نانومتر والتي لا تحتوي على أي عضيات الخلية. هذه الملاحظات تتفق مع التعريف الحالي للMVS وشاملة وجود الهيئات أفكارك 2. باستخدام الغربية التنشيف، كنا قادرين على إثبات أن MVS معزولة تظهر تعبير عال من تويولين، في حين أن tetraspanins CD9 وCD81 التي غالبا ما تستخدم كعلامات إكسو وأعرب إلا قليلا. وهذا يؤكد أن MVS تختلف من Exos ويناسب مؤخرا توصيف معمقة ومقارنة كل من السكان EV من البروتينات 25. محتوى &quot;&gt; وخلال الحصول على عينات الدم، فإنه أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوقت بين بزل الوريد وإعداد البلازما قصيرة قدر الإمكان من أجل منع تدهور MV. وعلاوة على ذلك، يمكن التخزين لفترات طويلة من عينات الدم يؤدي إلى تنشيط خلايا الدم يسبب تعزيز MV وذرف وموت الخلايا المبرمج الذي يؤدي إلى الإفراج عن الهيئات أفكارك في نهاية المطاف. هناك اعتبار آخر مهم لMV العزلة هو لمنع التلوث من الاستعدادات MV مع بروتينات البلازما أو Exos أصغر. ولذلك، من المهم جدا لإزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن بعد الغزل أسفل وMVS في 14000 ز س منذ بيليه هو عادة مرئية وتعلق بإحكام على جدار الأنبوب، طاف يمكن إزالتها بسهولة مع طرف ماصة. وعلى النقيض من Exos التي تميل إلى تشكيل المجاميع أثناء إعداد بالسرعة العالية تنبيذ فائق و في كثير من الأحيان من الصعب ل resuspend، لا تحدث هذه المشكلة مع MVS. أظهرت دراستنا أنه possiبلي لتوصيف القطعان MV الموجودة في الدم عن طريق التدفق الخلوي. على الرغم من أن الحد الكشف عن معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي حوالي 200-300 نانومتر، تم قياس MVS بتكاثر في المانحة وكذلك عينات ثقافة الخلية مع نفس المعلمات من التحليل والبوابات التي يسمح بوضوح تميزهم من الإشارات الخلفية. فمن المهم للتحقق من قبل القياسات أن برنامج تلفزيوني المستخدمة في تحليلات لا يحتوي على أي جزيئات الملوثة التي يمكن أن تسبب خلفية عالية خلال التدفق الخلوي (الشكل 3). على الرغم من أن بعض MVS أصغر قد لا يتم القبض في نهج تدفق cytometric، اكتشفنا MVS من جميع السكان خلايا الدم الرئيسي (على سبيل المثال، الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء، كريات الدم البيضاء، والخلايا البطانية). في تحليلاتنا استخدمنا علامات قياسية لخلايا الدم المختلفة التي تم العثور عليها سابقا على MVS 26-29. وتجدر الإشارة إلى أنه من أجل الحصول على أفضل النتائج الممكنة عن طريق التدفق الخلوي، رانه يرقى، وينبغي معاير تركيز كل الأجسام المضادة على عينة MV معربا عن مستضد من الفائدة. إذا يجب أن تبين القطعان MV محددة في الدم مع ارتفاع خصوصية، فمن الممكن أن تؤدي تلطيخ مزدوج ضد اثنين من مستضدات مختلفة موجودة على MVS منها والنظر فقط عن MVS إيجابي مزدوج لالتحليلات اللاحقة 23. حاليا، هناك جهود لتحديد نطاق قياسي من القطعان MV في الدم من الأشخاص الأصحاء 23،30. وقد أظهرت هذه الدراسات بالفعل أن MVS المشتقة من الصفائح الدموية تشكل أكبر عدد من MVS في الدم والتي هي في المراسلات مع ملاحظاتنا. ميزة واحدة من التدفق الخلوي لتوصيف عينات MV هي أن هذا الأسلوب بالفعل راسخة لأغراض التشخيص في معظم المراكز الطبية التي من شأنها أن تسمح للاستفادة ممكنة من MVS والمؤشرات الحيوية في التشخيص السريري اليومية. الدراسات السابقة على المركبات الكهربائية في الدم الذي يكون في الغالب التركيزإد على Exos أصغر، والاعتماد على أي إجراءات الفرز محددة لتحليل انتقائي المطلوب السكان المستهدفين إكسو 31،32 أو تتطلب (2 أيام) عملية عزل تستغرق وقتا طويلا مع اقتران Exos لاللاتكس الخرز السابقة للتحليل 18. وتشير ملاحظاتنا غير منشورة الخاصة أن تحليل تدفق cytometric من MVS من الاستعدادات الدم كلها حتى يسمح للكشف عن MVS مثل MVS المستمدة من الورم دون أي عمليات الاختيار هذه. معا، وبروتوكول المعروضة هنا يسمح للعزلة سريعة من MVS من عينات الدم الطرفية مع معدات المختبرات القياسية والتوصيف لاحقا باستخدام التدفق الخلوي والتنشيف الغربية. العملية برمتها لا يمكن أن يؤديها في حوالي 2 ساعة مما يسهل الدراسات المستقبلية على ملامح MV في الدم المرضى المطلوبة لتقييم إمكانات MVS كما المؤشرات الحيوية المرض.

في السنوات الأخيرة أثبتت العديد من الدراسات المختبرية أن الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية) تلعب دورا هاما في التواصل بين الخلايا. الخلايا الحية تسليط باستمرار الحويصلات والتي تختلف في الحجم والمحتوى ونشوء حيوي. والمركبات الكهربائية أفضل درس هي exosomes التي تنشأ من نظام endosomal حيث يتم تخزينها كما حويصلات داخل اللمعة في الهيئات عديد الحويصلات. مرة واحدة فتيل الأخير مع غشاء البلازما، ويتم الإفراج عن الحويصلات كما وردت exosomes (Exos، قطرها 30-100 نانومتر 1). عدد سكانها الثاني من EV التي اكتسبت اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة وmicrovesicles كبيرة (MVS، قطرها 100 - 1000 نانومتر) التي برعم خارج مباشرة من غشاء البلازما 2. وتحيط كلا النوعين من الحويصلات التي كتبها طبقة ثنائية الدهون ويحتوي على الأحماض النووية، على سبيل المثال، الحمض النووي، ومرنا أو ميرنا 3-5، وعدد كبير من البروتينات التي يمكن نقلها إلى ج المجاورةملتعلمي اللغة اإلنكليزية. بينما في عام تكوين البروتين من الحويصلات يعكس حالة من الخلية الأصلية، ويبدو أن بعض البروتينات لتكون مستهدفة بشكل انتقائي وأثرت على المركبات الكهربائية 1. والفائدة بحثية رئيسية هي تميز المركبات الكهربائية من الخلايا الشاذة والمريضة من أجل تحديد التوقيعات EV المحددة التي قد تسمح باستخدام المركبات الكهربائية والمؤشرات الحيوية الجديدة. وخصوصا في سرطان، والذي غالبا ما يكون الورم نفسه لا يمكن الوصول إليه بسهولة، الخزعات السائلة التي تستهدف المركبات الكهربائية للورم معين في الدم قد يسمح برصد ردود العلاج أو المساعدة تميز الورم الرئيسي دون الحاجة إلى إجراءات الغازية 6. في الواقع، وقد تم بالفعل عزل المركبات الكهربائية بنجاح من سوائل الجسم المختلفة بما في ذلك البول 7، 8 CSF، حليب الثدي 9 أو الدم 10. حددت العديد من الدراسات التغييرات في التهم EV والتكوين في الأمراض البشرية المختلفة. على سبيل المثال، في المرضى الذين يعانون الإنتان عدد MVS المساعد على حدوث تخثر هوزيادة كبيرة مقارنة مع الأفراد الأصحاء 11. أيضا في المرضى الذين يعانون من الملاريا الدماغية الشديدة زيادة في مجموع MVS في الدم ويمكن ملاحظة وتهم MVS المشتقة من الصفائح الدموية ترتبط مع عمق الغيبوبة ونقص الصفيحات 12. دراسات أخرى تفيد أرقام مرتفعة من الحويصلات المشتقة من البطانة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية أو فشل القلب وفي الحالة الأخيرة، وهذا يرتبط مع احتمال أكبر للأحداث القلب والأوعية الدموية 13،14. خصوصا في السرطان، وتناقش المركبات الكهربائية في الدم حاليا منصب المؤشرات الحيوية الرواية مع القيمة التشخيصية والنذير. ويبدو أن مستويات MVS معربا عن البروتينات المرتبطة الورم مثل MUC1، EGFR أو FAK لتكون مرتفعة في الدم لمرضى سرطان الثدي 15،16. أيضا لExos، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن Exos المشتقة من الدم تحمل مستضدات الأورام محددة مثل Glypican-1 لسرطان البنكرياس أو ديل-1 للكشف عن سرطان الثدي في وقت مبكر يسمح المرض دياحلماية مع خصوصية عالية وحساسية 17،18. بالإضافة إلى ذلك، قد الورم المشتقة من الدم Exos يحتوي على الحمض النووي التي يمكن استخدامها للكشف عن الطفرات مثل KRAS والبروتين p53 مما يوحي استخدامها للتنبؤ العلاج 19. وقد أظهرت التطورات الأخيرة أن تحليل Exos في الدم لمرضى ورم أرومي باستخدام رقاقة ميكروفلويديك محدد يسمح رصد العلاج 20. معا، وهذه النتائج تعني أن تحليل القطعان بأمراض محددة من الحويصلات يعطي معلومات قيمة عن التشخيص، والتشخيص، وكذلك الخيارات العلاجية والنجاح. ومع ذلك، والعزلة وتحليل Exos من الدم تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب معدات المختبرات الخاصة وبالتالي فهي ليست مناسبة لتشخيص السريرية الروتينية حتى الان. في المقابل، MVS يمكن عزل أسرع بكثير، ونظرا لحجم أكبر، ويمكن تحليلها بسهولة عن طريق التدفق الخلوي دون الحاجة لزوجين لهم حبات اللاتكس بقدر ما هو ضروري لExos 1821. وهكذا، وهنا نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها لعزل موحدة للMVS من عينات الدم وتوصيف لاحق من القطعان MV التدفق الخلوي. سوف يسمح هذا البروتوكول مزيد من الدراسة وفي عمق توصيف ملامح MV في مجموعات المرضى الكبيرة التي سوف تكون هناك حاجة لاستخدام MVS عن التشخيص السريري اليومية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>butterfly needle (21 gauge)</td>
			<td>Hospira Deutschland GmbH</td>
			<td>490P29201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07792</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7782</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62E-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>336008</td>
			<td>use 0.8&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62P-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304905</td>
			<td>use 0.1&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349501</td>
			<td>1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>21270091</td>
			<td>1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>Fujitsu Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA vacutainers for blood collection</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>01.1605.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated (30 min, 56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter 0.22&#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge SIGMA 1-15K</td>
			<td>Sigma Laborzentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusor syringe 50 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau-S staining solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2935,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829</td>
			<td>1:5000 in 5%BSA in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge TL-100</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve filter Seraplas V15</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>53,428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

الافراج عن حويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية) بما في ذلك exosomes صغيرة المستمدة endosomal (Exos، قطرها &lt;100 نانومتر) والبلازما كبير microvesicles المشتقة من غشاء (MVS، قطر&gt; 100 نانومتر) هو عملية الخلوية الأساسية التي تحدث في جميع الخلايا الحية. وقد أبرزت هذه البروتينات حويصلات النقل، والدهون والأحماض النووية محددة لخلايا المنشأ وفي الدراسات المختبرية أهميتها وسطاء من الاتصالات بين الخلايا. وقد تم عزل المركبات الكهربائية بنجاح من مختلف سوائل الجسم وتم التعرف خصوصا المركبات الكهربائية في الدم واعدة المؤشرات الحيوية لمرض السرطان أو أمراض المعدية. من أجل السماح للدراسة القطعان MV في الدم، نقدم بروتوكول لعزل موحدة وتوصيف MVS من عينات الدم الطرفية. ومكعبات MVS من عينات البلازما anticoagulated EDTA بواسطة الطرد المركزي التفاضلي وتمتلك عادة يبلغ قطرها 100-600 نانومتر. نظرا لحجم أكبر، فإنها يمكنبسهولة دراستها من قبل التدفق الخلوي، وهي تقنية تستخدم بشكل روتيني في التشخيص السريري ومتوفرة في معظم المختبرات. سيتم إعطاء العديد من الأمثلة لفحوصات مراقبة الجودة من MVS معزولة وستعرض علامات التي يمكن استخدامها للتمييز من القطعان MV مختلفة في الدم.

من أجل قياس العائد من MVS التي يمكن أن تكون معزولة بعد بروتوكول وصفها، وحساب كمية MVS المعزولة من عينات الدم من 10 جهات مانحة. تراوح العائد MV، التي قيمت في البروتين فحص لوري، من 10 إلى 30 ميكروغرام بمتوسط 19.2 ميكروغرام MVS لكل مليلتر دم (الجدول 1). تراوح تركيز الجسيمات التي يحددها التحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA) من 1.66 × 10 9 حتي 2،36 × 10 10 بمتوسط قدره 5.9 × 10 9 الجسيمات في عينة البلازما مل (الجدول 2). مزيد من توصيف MVS بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ كشفت عن وجود سكان من الحويصلات التي يبلغ قطرها&gt; 100 نانومتر التي تحيط بها طبقة ثنائية الدهون ولا تحتوي على أي عضيات الخلية (الشكل 1A). أكدت الهيئة الوطنية للمواصلات أن حجم MVS معزولة تراوحت من 100 إلى 600 نانومتر (الشكل 1B) ومتوسط حجم MV كان 201نانومتر (الشكل 1C). تلطيخ لMV وإكسو علامات نموذجية عن طريق ويسترن التنشيف أثبتت أن MVS معزولة كانت ايجابية للتويولين وأظهر فقط تعبير بسيط من CD9 وCD81، في حين كانت Exos السلبية لتويولين والتخصيب في CD9 وCD81 (الشكل 2). تحليل MVS معزولة من قبل التدفق الخلوي (الشكل 3A) كشفت عن وجود السكان حويصلة المحددة التي يمكن أن بوابات باستخدام نفس المعايير التي تستخدم عادة لMVS معزولة عن supernatants ثقافة الخلية والذي كان مختلفا بشكل واضح من إشارة الخلفية التي حصل عليها قياس من برنامج تلفزيوني + 1٪ الحويصلات المنضب FCS دون إضافة MVS (الشكل 3B). من أجل تحليل السكان MV مختلفة موجودة في الدم، وكانت ملطخة MVS مع علامات الموضوعة لمختلف مجموعات خلايا الدم، على سبيل المثال، CD62P لMVS المشتقة من الصفائح الدموية، CD45 لMVS المستمدة من الكريات البيض، CD235a لالدم الحمراء MVS وCD62E خلية مستمدة من أجل MVS المستمدة من الخلايا البطانية (الشكل 4). وأظهر هذا التوصيف أن نسبة القطعان MV اختلفت بين عينات الدم المانحة التحقيق، في حين بدا أن غالبية MVS أن أبكاها الصفائح الدموية في جميع العينات. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> الشكل 1: حجم توزيع MVS المعزولة من الدم المحيطي. وتصور A، MVS المعزولة بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. B، تحليل تتبع التمثيلية جسيمات متناهية الصغر (NTA) من MVS توضح توزيع حجم الحويصلات. وقد تم قياس C، ومتوسط حجم MV من 10 الاستعدادات مستقلة NTA (يعني). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة ال</a>نسخة arger من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> الشكل 2: توصيف MVS معزولة عن طريق ويسترن التنشيف. وقد تصور بروتين تعبير التفاضلي على MVS معزولة وExos من اثنين من المانحين عن طريق ويسترن التنشيف. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> الشكل 3: تحليل MVS بواسطة التدفق الخلوي. وتصور A، MVS لأول مرة في الأمام (FSC) مقابل sidescatter (SSC) مؤامرات لبوابة على السكان MV منها. وفي وقت لاحق، وتتميز هذه MVS للمستضد من الاهتمام من قبل<html> باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى موجهة ضد مستضد. ب، نموذجي FSC مقابل المؤامرات التعاون بين بلدان الجنوب لMVS معزولة من بلازما اثنين من المانحين. ومقارنة، وتظهر قطعة نموذجية لورم MVS المشتقة من خلية من خلايا سرطان الرئة A549 معزولة من طاف ثقافة الخلية وكذلك السيطرة السلبية فقط باستخدام برنامج تلفزيوني + 1٪ حويصلة المنضب FCS دون MVS على اليمين. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> الشكل 4: توصيف MVS المعزولة بواسطة التدفق الخلوي. وتميزت MVS من ثلاث جهات مانحة للتعبير عن علامات خلايا الدم تأسيس (أحمر) من خلال التدفق الخلوي. تظهر عناصر التحكم في نمط إسوي منها في الرمادي.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> MVS / مل دم [ميكروغرام] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: MV إنتاج البروتين من عينات الدم الطرفية. </strأونج&gt; يظهر هو مقدار MVS لكل مليلتر الدم المحيطي التي تم استخلاصها من 10 جهات مانحة. وتم قياس كمية الغلة MV بواسطة لوري الفحص. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> MVS / مل بلازما [عدد الجسيمات] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> الجدول 2: MV الجسيمات العائد من عينات الدم الطرفية. </stرونغ&gt; تم عزل MV من عينات البلازما و10 المانحين وتعول الجسيمات التي يحددها التحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر. أظهرت هو القيمة المتوسطة من ثلاثة قياسات مستقلة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

Video: Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

العزلة والثقافة في الخلايا البطانية الرئوي من الفئران حديثي الولادة

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

عزل وتوصيف المحتوية على الحمض النووي الريبي Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

جيل من صنع الإنسان من الخلايا الجذعية المحفزة الدموية المحيطية باستخدام Lentiviral STEMCCA المتجهات

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

جيل وثقافة الدم ثمرة غشائي خلايا من الدم المحيطي الإنسان

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

عزل خلايا CD4+ خلايا تي و "تحليل لتعميم" مساعد تي الحبيبي (كتفه) "خلية مجموعات فرعية" من 6-لون "الدم الطرفية استخدام التدفق الخلوي"

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

عزل وتوصيف الخلايا الليفية القلبية للبالغين والخلايا الليفية الليفية

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

عزل وتوصيف الإكسوسومات من الخلايا الليفية العضلية الهيكلية

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

عزل العدلات البشرية من الدم الكامل والمعاطف بافي

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...