The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

وقد تمت الموافقة على جميع التجارب بما في ذلك المواد الإنسان من قبل لجنة الأخلاق المحلية (موافقة رقم 3/2/14). لاختيار المرضى تجدر الإشارة إلى أن هناك عدة عوامل مثل العمر والجنس ونظم العلاج الحالية وغيرها الكثير قد تؤثر على تكوين MV في الدم، وبالتالي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار قبل عينة جمع 22،23. 1. إعداد عينات البلازما <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 1-2 أنابيب من الدم في المانحة من خلال عيار 21 فراشة إبرة في أنبوب vacutainer جمع الدم التي تحتوي على EDTA (1.6 ملغ / مل دم). تأكد من عكس الأنبوب (ق) عدة مرات لضمان كفاءة مضادات التخثر في الدم. ملاحظة: حجم الموصى بها من الدم لالتدفق الخلوي لاحق وتحليل البقعة الغربية هو 5-15 مل. من أجل منع تدهور MV والخسارة، ويجب التعامل مع عينات الدم &lt;30 دقيقة بعد انسحاب الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير عينات البلازما بواسطة الطرد المركزي العينات لمدة 15 دقيقة في 1200 x ج فيدرجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق عامل تصفية صمام من أجل المساعدة في فصل البلازما (= الطبقة العليا) من خلايا الدم (= الطبقة السفلى) المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البلازما في أنبوب 15 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1500 x ج، RT لتكوير أكبر الحطام الخلية وإزالة الصفائح الدموية المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف في أنبوب 15 مل، والشروع مباشرة مع العزلة أو تخزين عينات MV لمدة تصل إلى 6 أشهر عند -20 درجة مئوية. ملاحظة: يمكن أيضا بروتوكول المعروضة استخدامها لعزل MVS (وExos) من supernatants ثقافة الخلية. من أجل القيام بذلك، وزراعة الخلايا في 60-80٪ confluency ل24 - 48 ساعة في مستنبت تستكمل مع المنضب حويصلة FCS، ثم جمع طاف. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 750 x ج، 4 درجة مئوية إلى أن تستنفد خلايا العائمة المتبقية، وملء طاف في جديد 15 مل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق في 1500 x ج، 4 درجات مئوية لتكوير أكبر الحطام الخلية. ويمكن بعد ذلك طاف استخدامها لعزل MVSكما هو موضح في الخطوة 2،1-2،16. </li></ol> 2. عزل MVS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل عينة البلازما في أنبوب الطرد المركزي مناسبة. إذا لزم الأمر، تملأ أنبوب مع برنامج تلفزيوني من أجل تخفيف العينة ومنع انهيار أنابيب رقيقة الجدران أثناء إجراء الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي لمدة 35 دقيقة في 14000 x ج، 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طاف صب، والحفاظ على أنابيب تحولت رأسا على عقب وضعت على منشفة ورقية. الانتظار 3-5 دقائق حتى تم غارقة جميع طاف المتبقية في منشفة، وبالتالي إزالتها من العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية MV في 1000 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني، ونقل إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 35 دقيقة في 14000 x ج، 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي الطاولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية MV في 50-500 ميكرولتر في برنامج تلفزيوني، وهذا يتوقف على حجم الكرية. بدلا من ذلك، ليز MVS مباشرة، على سبيل المثال، في المخزن المعهد الملكي (150 ملي مول كلوريد الصوديوم / 0.1٪ SDS / 0.5٪ نا deoxycholate / 1٪ تريتون X-100/50 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.2)لتحليل البقعة الغربية لاحقا. متجر MVS في -20 درجة مئوية. وسوف يظل مستقرا لعدة أشهر، ولكن تجنب تكرار تجميد أذاب دورات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياري: تحديد تركيز البروتين MV مع فحص البروتين (على سبيل المثال، برادفورد أو طريقة لوري) من أجل تقييم غلة MV أو جرعة MVS لتجارب لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا Exos إضافية هي أن تكون معزولة من عينات البلازما، صب طاف من الخطوة 2.3 في أنبوب تنبيذ فائق وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة عند 110000 x ج، 4 درجات مئوية. صب وطاف كما هو موضح في الخطوة 2.3، و resuspend إكسو بيليه في 1000 ميكرولتر برنامج تلفزيوني ونقل إلى أقسام صغيرة (1.5 مل) أنابيب تنبيذ فائق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نابذة لمدة 2 ساعة عند 110000 x ج، 4 درجات مئوية، نضح طاف و resuspend إكسو بيليه في 50-75 ميكرولتر برنامج تلفزيوني أو عازلة RIPA. </li></ol></li></ol> 3. توصيف MVS بواسطة التدفق الخلوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 15 ميكرولتر PBS + 1٪ المنضب حويصلة مصل العجل الجنين (FCS) في أنبوب التدفق الخلوي. ملاحظة: يتم إعداد المنضب الحويصلة FCS بواسطة الطرد المركزي المعطل الحرارة (30 دقيقة عند 56 درجة مئوية) FCS لمدة 18 ساعة في 110000 x ج والترشيح طاف من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر كما هو موضح سابقا (24). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكروغرام (في حالة العائدات المنخفضة 3 ميكروغرام تنطبق أيضا) من MVS في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT من أجل حجب المواقع ملزمة غير محددة على سطح MV وبالتالي الحد من تلوين الخلفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الأضداد fluorescently المسمى ضد المصلحة البروتين من. عاير كمية من الأجسام المضادة المستخدمة في تلوين قبل استخدامها من أجل تحديد تركيز الأمثل وضمان انخفاض التموينية الإشارة إلى الضوضاء. تأكد من أن تشمل أيضا أنبوب واحد مع MVS غير ملوثين كما المراقبة السلبية وأنبوب واحد من MVS ملطخة الأجسام المضادة مطابقة isotype السيطرة في نفس التركيز (على سبيل المثال، إذا تم استخدام 1 ميكروغرام من الأجسام المضادة، أيضا استخدام 1 ميكروغرام من لisotype السيطرةtibody) لتحديد تلوين الخلفية. ملاحظة: من الممكن أيضا لأداء تدفق متعدد الألوان الخلوي بإضافة الأجسام المضادة متعددة بالإضافة إلى fluorochromes مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني والمضي قدما في قياس العينة باستخدام قياس التدفق الخلوي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة أن العينات لا يمكن أن يقاس على الفور، إضافة 150 ميكرولتر برنامج تلفزيوني و 50 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) لإصلاح العينات وتخزينها في 4 درجات مئوية. تنبيه: PFA سامة. استخدام القفازات ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخفيض عتبة قياس التدفق الخلوي إلى أدنى قيمة ممكنة والبحث عن السكان MV باستخدام مبعثر إلى الأمام (FSC) مقابل الجانب مبعثر (SSC) مؤامرة في مقياس لوغاريتمي. بوابة على السكان MV وتقييم إشارة الفلورسنت في الرسم البياني المقابل. </li></ol> 4. توصيف MVS بواسطة الغربية التنشيف <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية MV مباشرة فيمنطقة عازلة تحلل مناسب (على سبيل المثال، المعهد الملكي عازلة). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حال تم بالفعل معلق بيليه MV في برنامج تلفزيوني، وتخفف من 1: 1 على الأقل في منطقة عازلة تحلل مناسب (على سبيل المثال، عازلة RIPA). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز البروتين من العينة MV، على سبيل المثال، عن طريق لوري الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10-20 ميكروغرام من MVS في 22.5 عازلة ميكرولتر المعهد الملكي. ثم يضاف 7.5 ميكرولتر 4X Laemmli العازلة تحميل والحرارة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الحمل على هلام بولي أكريلاميد وأداء الكهربائي وimmunoblotting وفقا لبروتوكولات موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد نقل البروتينات على الغشاء، إجراء تلطيخ الشقائقية كما تحكم التحميل وفقا لبروتوكولات موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء يزيل اللون في TBST لمدة 5 دقائق على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غشاء كتلة لمدة 30 دقيقة حتى 1 ساعة عند RT في 5٪ BSA في TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية في 4 درجات مئوية خلال الليل أو لمدة 2 ساعة على RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء مع TBST 3 × 5 دقائق.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية بالإضافة HRP-في التخفيف من 1: 10000 في 5٪ BSA. ملاحظة: في حالة الإشارات خلفية عالية، واستخدام مسحوق الحليب بدلا من جيش صرب البوسنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل الغشاء مع TBST 3X 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير الغشاء مع كشف كاشف أطلق بيت التمويل الخليجي والكشف عن إشارات على الأفلام التوهج أو نظام التوهج التصوير. ملاحظة: من أجل التمييز MVS من Exos، والبروتينات مثل تويولين، actinin-4 أو mitofilin يمكن استخدامها والتي ينبغي أساسا أن تكون موجودة على MVS 16،25. الانتباه إلى أن الأجسام المضادة الأكثر tetraspanin (على سبيل المثال، CD9، CD81)، وتستخدم كعلامات لExos، لا تعمل في ظل ظروف الحد، وبالتالي يجب أن يكون مستعدا في المخزن غير الحد تحميل يليه التسخين لمدة 10 دقيقة عند 70 درجة مئوية. </li></ol>

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, (2015).</li><li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA.">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180 (2011).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells.">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li><li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+trail+left+in+blood.">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li><li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid.">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).</li><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li><li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis.">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li><li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria.">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).</li><li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus.">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure.">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li><li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients.">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li><li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN.">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li><li>Moon, P. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection.">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer.">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy.">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans.">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles.">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li><li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Incorporation+of+CD45,+CD80+(B7-1),+CD86+(B7-2),+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles:+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation.">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li><li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens:+an+analysis+by+flow+cytometry.">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li><li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., L&#246;sche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes:+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P.">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li><li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation.">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li><li>Rupp, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes:+role+of+proteolytic+cleavage.">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> وقد أثبتت الدراسات الحديثة في المركبات الكهربائية في الدم الذي تكوين EV وتعول تتغير خلال ظهور العديد من الأمراض. ولذلك، فإن تحليل وتوصيف مزيد من هذه المركبات الكهربائية ذات فائدة عالية لمواصلة تقييم استخدامها المحتمل والمؤشرات الحيوية المرض التشخيص والتشخيص أو لتقييم الاستجابات العلاج. بروتوكول نقدم هنا يسمح للعزلة الحويصلات التي يبلغ قطرها يصل إلى 600 نانومتر والتي لا تحتوي على أي عضيات الخلية. هذه الملاحظات تتفق مع التعريف الحالي للMVS وشاملة وجود الهيئات أفكارك 2. باستخدام الغربية التنشيف، كنا قادرين على إثبات أن MVS معزولة تظهر تعبير عال من تويولين، في حين أن tetraspanins CD9 وCD81 التي غالبا ما تستخدم كعلامات إكسو وأعرب إلا قليلا. وهذا يؤكد أن MVS تختلف من Exos ويناسب مؤخرا توصيف معمقة ومقارنة كل من السكان EV من البروتينات 25. محتوى &quot;&gt; وخلال الحصول على عينات الدم، فإنه أمر بالغ الأهمية للحفاظ على الوقت بين بزل الوريد وإعداد البلازما قصيرة قدر الإمكان من أجل منع تدهور MV. وعلاوة على ذلك، يمكن التخزين لفترات طويلة من عينات الدم يؤدي إلى تنشيط خلايا الدم يسبب تعزيز MV وذرف وموت الخلايا المبرمج الذي يؤدي إلى الإفراج عن الهيئات أفكارك في نهاية المطاف. هناك اعتبار آخر مهم لMV العزلة هو لمنع التلوث من الاستعدادات MV مع بروتينات البلازما أو Exos أصغر. ولذلك، من المهم جدا لإزالة أكبر قدر من طاف وقت ممكن بعد الغزل أسفل وMVS في 14000 ز س منذ بيليه هو عادة مرئية وتعلق بإحكام على جدار الأنبوب، طاف يمكن إزالتها بسهولة مع طرف ماصة. وعلى النقيض من Exos التي تميل إلى تشكيل المجاميع أثناء إعداد بالسرعة العالية تنبيذ فائق و في كثير من الأحيان من الصعب ل resuspend، لا تحدث هذه المشكلة مع MVS. أظهرت دراستنا أنه possiبلي لتوصيف القطعان MV الموجودة في الدم عن طريق التدفق الخلوي. على الرغم من أن الحد الكشف عن معظم أجهزة قياس التدفق الخلوي حوالي 200-300 نانومتر، تم قياس MVS بتكاثر في المانحة وكذلك عينات ثقافة الخلية مع نفس المعلمات من التحليل والبوابات التي يسمح بوضوح تميزهم من الإشارات الخلفية. فمن المهم للتحقق من قبل القياسات أن برنامج تلفزيوني المستخدمة في تحليلات لا يحتوي على أي جزيئات الملوثة التي يمكن أن تسبب خلفية عالية خلال التدفق الخلوي (الشكل 3). على الرغم من أن بعض MVS أصغر قد لا يتم القبض في نهج تدفق cytometric، اكتشفنا MVS من جميع السكان خلايا الدم الرئيسي (على سبيل المثال، الصفائح الدموية وخلايا الدم الحمراء، كريات الدم البيضاء، والخلايا البطانية). في تحليلاتنا استخدمنا علامات قياسية لخلايا الدم المختلفة التي تم العثور عليها سابقا على MVS 26-29. وتجدر الإشارة إلى أنه من أجل الحصول على أفضل النتائج الممكنة عن طريق التدفق الخلوي، رانه يرقى، وينبغي معاير تركيز كل الأجسام المضادة على عينة MV معربا عن مستضد من الفائدة. إذا يجب أن تبين القطعان MV محددة في الدم مع ارتفاع خصوصية، فمن الممكن أن تؤدي تلطيخ مزدوج ضد اثنين من مستضدات مختلفة موجودة على MVS منها والنظر فقط عن MVS إيجابي مزدوج لالتحليلات اللاحقة 23. حاليا، هناك جهود لتحديد نطاق قياسي من القطعان MV في الدم من الأشخاص الأصحاء 23،30. وقد أظهرت هذه الدراسات بالفعل أن MVS المشتقة من الصفائح الدموية تشكل أكبر عدد من MVS في الدم والتي هي في المراسلات مع ملاحظاتنا. ميزة واحدة من التدفق الخلوي لتوصيف عينات MV هي أن هذا الأسلوب بالفعل راسخة لأغراض التشخيص في معظم المراكز الطبية التي من شأنها أن تسمح للاستفادة ممكنة من MVS والمؤشرات الحيوية في التشخيص السريري اليومية. الدراسات السابقة على المركبات الكهربائية في الدم الذي يكون في الغالب التركيزإد على Exos أصغر، والاعتماد على أي إجراءات الفرز محددة لتحليل انتقائي المطلوب السكان المستهدفين إكسو 31،32 أو تتطلب (2 أيام) عملية عزل تستغرق وقتا طويلا مع اقتران Exos لاللاتكس الخرز السابقة للتحليل 18. وتشير ملاحظاتنا غير منشورة الخاصة أن تحليل تدفق cytometric من MVS من الاستعدادات الدم كلها حتى يسمح للكشف عن MVS مثل MVS المستمدة من الورم دون أي عمليات الاختيار هذه. معا، وبروتوكول المعروضة هنا يسمح للعزلة سريعة من MVS من عينات الدم الطرفية مع معدات المختبرات القياسية والتوصيف لاحقا باستخدام التدفق الخلوي والتنشيف الغربية. العملية برمتها لا يمكن أن يؤديها في حوالي 2 ساعة مما يسهل الدراسات المستقبلية على ملامح MV في الدم المرضى المطلوبة لتقييم إمكانات MVS كما المؤشرات الحيوية المرض.

في السنوات الأخيرة أثبتت العديد من الدراسات المختبرية أن الحويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية) تلعب دورا هاما في التواصل بين الخلايا. الخلايا الحية تسليط باستمرار الحويصلات والتي تختلف في الحجم والمحتوى ونشوء حيوي. والمركبات الكهربائية أفضل درس هي exosomes التي تنشأ من نظام endosomal حيث يتم تخزينها كما حويصلات داخل اللمعة في الهيئات عديد الحويصلات. مرة واحدة فتيل الأخير مع غشاء البلازما، ويتم الإفراج عن الحويصلات كما وردت exosomes (Exos، قطرها 30-100 نانومتر 1). عدد سكانها الثاني من EV التي اكتسبت اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة وmicrovesicles كبيرة (MVS، قطرها 100 - 1000 نانومتر) التي برعم خارج مباشرة من غشاء البلازما 2. وتحيط كلا النوعين من الحويصلات التي كتبها طبقة ثنائية الدهون ويحتوي على الأحماض النووية، على سبيل المثال، الحمض النووي، ومرنا أو ميرنا 3-5، وعدد كبير من البروتينات التي يمكن نقلها إلى ج المجاورةملتعلمي اللغة اإلنكليزية. بينما في عام تكوين البروتين من الحويصلات يعكس حالة من الخلية الأصلية، ويبدو أن بعض البروتينات لتكون مستهدفة بشكل انتقائي وأثرت على المركبات الكهربائية 1. والفائدة بحثية رئيسية هي تميز المركبات الكهربائية من الخلايا الشاذة والمريضة من أجل تحديد التوقيعات EV المحددة التي قد تسمح باستخدام المركبات الكهربائية والمؤشرات الحيوية الجديدة. وخصوصا في سرطان، والذي غالبا ما يكون الورم نفسه لا يمكن الوصول إليه بسهولة، الخزعات السائلة التي تستهدف المركبات الكهربائية للورم معين في الدم قد يسمح برصد ردود العلاج أو المساعدة تميز الورم الرئيسي دون الحاجة إلى إجراءات الغازية 6. في الواقع، وقد تم بالفعل عزل المركبات الكهربائية بنجاح من سوائل الجسم المختلفة بما في ذلك البول 7، 8 CSF، حليب الثدي 9 أو الدم 10. حددت العديد من الدراسات التغييرات في التهم EV والتكوين في الأمراض البشرية المختلفة. على سبيل المثال، في المرضى الذين يعانون الإنتان عدد MVS المساعد على حدوث تخثر هوزيادة كبيرة مقارنة مع الأفراد الأصحاء 11. أيضا في المرضى الذين يعانون من الملاريا الدماغية الشديدة زيادة في مجموع MVS في الدم ويمكن ملاحظة وتهم MVS المشتقة من الصفائح الدموية ترتبط مع عمق الغيبوبة ونقص الصفيحات 12. دراسات أخرى تفيد أرقام مرتفعة من الحويصلات المشتقة من البطانة في المرضى الذين يعانون من الذئبة الحمامية الجهازية أو فشل القلب وفي الحالة الأخيرة، وهذا يرتبط مع احتمال أكبر للأحداث القلب والأوعية الدموية 13،14. خصوصا في السرطان، وتناقش المركبات الكهربائية في الدم حاليا منصب المؤشرات الحيوية الرواية مع القيمة التشخيصية والنذير. ويبدو أن مستويات MVS معربا عن البروتينات المرتبطة الورم مثل MUC1، EGFR أو FAK لتكون مرتفعة في الدم لمرضى سرطان الثدي 15،16. أيضا لExos، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن Exos المشتقة من الدم تحمل مستضدات الأورام محددة مثل Glypican-1 لسرطان البنكرياس أو ديل-1 للكشف عن سرطان الثدي في وقت مبكر يسمح المرض دياحلماية مع خصوصية عالية وحساسية 17،18. بالإضافة إلى ذلك، قد الورم المشتقة من الدم Exos يحتوي على الحمض النووي التي يمكن استخدامها للكشف عن الطفرات مثل KRAS والبروتين p53 مما يوحي استخدامها للتنبؤ العلاج 19. وقد أظهرت التطورات الأخيرة أن تحليل Exos في الدم لمرضى ورم أرومي باستخدام رقاقة ميكروفلويديك محدد يسمح رصد العلاج 20. معا، وهذه النتائج تعني أن تحليل القطعان بأمراض محددة من الحويصلات يعطي معلومات قيمة عن التشخيص، والتشخيص، وكذلك الخيارات العلاجية والنجاح. ومع ذلك، والعزلة وتحليل Exos من الدم تستغرق وقتا طويلا، ويتطلب معدات المختبرات الخاصة وبالتالي فهي ليست مناسبة لتشخيص السريرية الروتينية حتى الان. في المقابل، MVS يمكن عزل أسرع بكثير، ونظرا لحجم أكبر، ويمكن تحليلها بسهولة عن طريق التدفق الخلوي دون الحاجة لزوجين لهم حبات اللاتكس بقدر ما هو ضروري لExos 1821. وهكذا، وهنا نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها لعزل موحدة للMVS من عينات الدم وتوصيف لاحق من القطعان MV التدفق الخلوي. سوف يسمح هذا البروتوكول مزيد من الدراسة وفي عمق توصيف ملامح MV في مجموعات المرضى الكبيرة التي سوف تكون هناك حاجة لاستخدام MVS عن التشخيص السريري اليومية.

<table><tbody><tr><td>butterfly needle (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust pH to 7.6</td></tr><tr><td colspan="4">For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and add 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>use 0.8 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>use 0.1 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD81 antibody</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers for blood collection</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated (30 min, 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuge SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S staining solution</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valve filter Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

الافراج عن حويصلات خارج الخلية (السيارات الكهربائية) بما في ذلك exosomes صغيرة المستمدة endosomal (Exos، قطرها &lt;100 نانومتر) والبلازما كبير microvesicles المشتقة من غشاء (MVS، قطر&gt; 100 نانومتر) هو عملية الخلوية الأساسية التي تحدث في جميع الخلايا الحية. وقد أبرزت هذه البروتينات حويصلات النقل، والدهون والأحماض النووية محددة لخلايا المنشأ وفي الدراسات المختبرية أهميتها وسطاء من الاتصالات بين الخلايا. وقد تم عزل المركبات الكهربائية بنجاح من مختلف سوائل الجسم وتم التعرف خصوصا المركبات الكهربائية في الدم واعدة المؤشرات الحيوية لمرض السرطان أو أمراض المعدية. من أجل السماح للدراسة القطعان MV في الدم، نقدم بروتوكول لعزل موحدة وتوصيف MVS من عينات الدم الطرفية. ومكعبات MVS من عينات البلازما anticoagulated EDTA بواسطة الطرد المركزي التفاضلي وتمتلك عادة يبلغ قطرها 100-600 نانومتر. نظرا لحجم أكبر، فإنها يمكنبسهولة دراستها من قبل التدفق الخلوي، وهي تقنية تستخدم بشكل روتيني في التشخيص السريري ومتوفرة في معظم المختبرات. سيتم إعطاء العديد من الأمثلة لفحوصات مراقبة الجودة من MVS معزولة وستعرض علامات التي يمكن استخدامها للتمييز من القطعان MV مختلفة في الدم.

من أجل قياس العائد من MVS التي يمكن أن تكون معزولة بعد بروتوكول وصفها، وحساب كمية MVS المعزولة من عينات الدم من 10 جهات مانحة. تراوح العائد MV، التي قيمت في البروتين فحص لوري، من 10 إلى 30 ميكروغرام بمتوسط 19.2 ميكروغرام MVS لكل مليلتر دم (الجدول 1). تراوح تركيز الجسيمات التي يحددها التحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر (NTA) من 1.66 × 10 9 حتي 2،36 × 10 10 بمتوسط قدره 5.9 × 10 9 الجسيمات في عينة البلازما مل (الجدول 2). مزيد من توصيف MVS بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ كشفت عن وجود سكان من الحويصلات التي يبلغ قطرها&gt; 100 نانومتر التي تحيط بها طبقة ثنائية الدهون ولا تحتوي على أي عضيات الخلية (الشكل 1A). أكدت الهيئة الوطنية للمواصلات أن حجم MVS معزولة تراوحت من 100 إلى 600 نانومتر (الشكل 1B) ومتوسط حجم MV كان 201نانومتر (الشكل 1C). تلطيخ لMV وإكسو علامات نموذجية عن طريق ويسترن التنشيف أثبتت أن MVS معزولة كانت ايجابية للتويولين وأظهر فقط تعبير بسيط من CD9 وCD81، في حين كانت Exos السلبية لتويولين والتخصيب في CD9 وCD81 (الشكل 2). تحليل MVS معزولة من قبل التدفق الخلوي (الشكل 3A) كشفت عن وجود السكان حويصلة المحددة التي يمكن أن بوابات باستخدام نفس المعايير التي تستخدم عادة لMVS معزولة عن supernatants ثقافة الخلية والذي كان مختلفا بشكل واضح من إشارة الخلفية التي حصل عليها قياس من برنامج تلفزيوني + 1٪ الحويصلات المنضب FCS دون إضافة MVS (الشكل 3B). من أجل تحليل السكان MV مختلفة موجودة في الدم، وكانت ملطخة MVS مع علامات الموضوعة لمختلف مجموعات خلايا الدم، على سبيل المثال، CD62P لMVS المشتقة من الصفائح الدموية، CD45 لMVS المستمدة من الكريات البيض، CD235a لالدم الحمراء MVS وCD62E خلية مستمدة من أجل MVS المستمدة من الخلايا البطانية (الشكل 4). وأظهر هذا التوصيف أن نسبة القطعان MV اختلفت بين عينات الدم المانحة التحقيق، في حين بدا أن غالبية MVS أن أبكاها الصفائح الدموية في جميع العينات. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> الشكل 1: حجم توزيع MVS المعزولة من الدم المحيطي. وتصور A، MVS المعزولة بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. B، تحليل تتبع التمثيلية جسيمات متناهية الصغر (NTA) من MVS توضح توزيع حجم الحويصلات. وقد تم قياس C، ومتوسط حجم MV من 10 الاستعدادات مستقلة NTA (يعني). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة ال</a>نسخة arger من هذا الرقم. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> الشكل 2: توصيف MVS معزولة عن طريق ويسترن التنشيف. وقد تصور بروتين تعبير التفاضلي على MVS معزولة وExos من اثنين من المانحين عن طريق ويسترن التنشيف. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> الشكل 3: تحليل MVS بواسطة التدفق الخلوي. وتصور A، MVS لأول مرة في الأمام (FSC) مقابل sidescatter (SSC) مؤامرات لبوابة على السكان MV منها. وفي وقت لاحق، وتتميز هذه MVS للمستضد من الاهتمام من قبل<html> باستخدام الأجسام المضادة fluorescently المسمى موجهة ضد مستضد. ب، نموذجي FSC مقابل المؤامرات التعاون بين بلدان الجنوب لMVS معزولة من بلازما اثنين من المانحين. ومقارنة، وتظهر قطعة نموذجية لورم MVS المشتقة من خلية من خلايا سرطان الرئة A549 معزولة من طاف ثقافة الخلية وكذلك السيطرة السلبية فقط باستخدام برنامج تلفزيوني + 1٪ حويصلة المنضب FCS دون MVS على اليمين. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> الشكل 4: توصيف MVS المعزولة بواسطة التدفق الخلوي. وتميزت MVS من ثلاث جهات مانحة للتعبير عن علامات خلايا الدم تأسيس (أحمر) من خلال التدفق الخلوي. تظهر عناصر التحكم في نمط إسوي منها في الرمادي.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> MVS / مل دم [ميكروغرام] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: MV إنتاج البروتين من عينات الدم الطرفية. </strأونج&gt; يظهر هو مقدار MVS لكل مليلتر الدم المحيطي التي تم استخلاصها من 10 جهات مانحة. وتم قياس كمية الغلة MV بواسطة لوري الفحص. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة </td><td> MVS / مل بلازما [عدد الجسيمات] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> الجدول 2: MV الجسيمات العائد من عينات الدم الطرفية. </stرونغ&gt; تم عزل MV من عينات البلازما و10 المانحين وتعول الجسيمات التي يحددها التحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر. أظهرت هو القيمة المتوسطة من ثلاثة قياسات مستقلة.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

23.0K Views.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

Video: Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Biochemistry

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Cancer Research

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Bioengineering

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Immunology and Infection

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medicine

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

<meta charset="utf8"></head><body>عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

عزل وتوصيف Microvesicles من الدم المحيطي

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

توصيف واحد حويصلات خارج الخلية في الدم البشري مع تحليل تتبع نانوحبيبات المستندة إلى الأسفار السريع

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

عزل Exosomes من البلازما من HIV-1 الأفراد ايجابية

العزلة ومن التنميط Exosomes من الصفراء الإنسان التي تحتوي على الرنا الميكروي

العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره

عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

عزل الحويصلات الدقيقة الطحالية في نموذج الفئران للعدوى البكتيرية داخل الصفاق

عزل وتحليل الحويصلات خارج الخلية التي يمكن تتبعها والوظيفية من البلازما والأنسجة الصلبة

عزل وتوصيف وتطبيق علاجي للحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة البشرية المستزرعة