هذه الطريقة تسمح زراعة السل الفطري في ظل ظروف صارمة الحديد المنخفض وتنقية غشاء من الترشيح ثقافة الحديد المنخفض. لأن الحد من الحديد هو معروف لتحفيز إنتاج الغشاء vesicle، هذا البروتوكول ينتج وفرة عالية من غشاء محض vesicles التي يمكن استخدامها لمزيد من البيوكيميائية أو وظيفية. عندما نثبت البروتوكول باستخدام mycobacterium smegmatis ، السلالة غير الخبيثة ، يمكن اتباع هذا البروتوكول في مرافق BSL-2 باستخدام السل الفطري ، السلالة الخبيثة.
للبدء، وإعداد لتر واحد من الحد الأدنى من المتوسطة عن طريق حل خمسة غرامات من الفوسفات أحادية الوبوتاسيوم، وخمسة غرامات من الهليون L-، 20 ملليلتر من الجلسرين، واثنين من غرام من ديكستروز في 900 ملليلتر من المياه الأيونة في وعاء من البلاستيك. ضبط درجة اله pH إلى 6.8 مع خمسة هيدروكسيد الصوديوم العادي وضبط مستوى الصوت إلى لتر واحد مع المياه الأيونية. ثم إضافة 50 غراما من راتنج المعادن chelating وتهيج بلطف باستخدام شريط ضجة المغناطيسي لمدة 24 ساعة في أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي، ووقف اثارة والسماح للراتنج الرواسب لمدة 30 دقيقة. تعقيم وإزالة الراتنج المتبقي من الحل عن طريق الترشيح من خلال وحدة مرشح 22 ميكرون مع جهاز استقبال من البلاستيك. الآن، تكملة الحد الأدنى المتوسطة مع 0.5 ملليغرام لكل لتر من كلوريد الزنك، 40 ملليغرام لكل لتر من كبريتات المغنيسيوم، و 0.1 ملليغرام لكل لتر من كبريتات المنغنيز.
تلقيح مستعمرة واحدة من MTB في مليلترين من مرق ميقومي المتوسط تكملها ADN التخصيب. احتضان مع الانفعالات في 37 درجة مئوية. عندما يكون هناك نمو مرئي، استخراج مليلترين من الثقافة وقياس OD 540 على مقياس الطيفي.
إيقاف الحضانة عندما يصل OD 540 إلى 0.8 مما يشير إلى المرحلة اللوغاريتمية المتأخرة. انتشار 200 ميكرولترات من الثقافة اللوغاريتمية في وقت متأخر على لوحات agar ميكروكتريا تكملها 0.2 الجلسرين، 0.5٪ توين 80، وDN. تلقيح على الأقل خمسة لوحات.
احتضان لوحات في 37 درجة مئوية. وبعد أسبوع واحد، والنمو البكتيري مرئيا كطبقة التقاء. ثم الرطب مسحة القطن العقيمة في متوسط الحديد منخفضة الحد الأدنى.
استخدم هذه المسحة لجمع البكتيريا من لوحات أجار. تلقيح البكتيريا في 100 ملليلتر من انخفاض الحد الأدنى من وسائل الإعلام الحديد في أنبوب. جمع البكتيريا الكافية لإعداد تعليق مع OD 540 واحد.
تخفيف التعليق 10 مرات إلى لتر واحد مع انخفاض الحد الأدنى من الحديد المتوسطة وتقسيمه إلى اثنين من الزجاجات البلاستيكية المعقمة. بعد ذلك، نقل مليلترين من الثقافة إلى أنبوب ثقافة خمسة ملليلتر. إضافة 10 ميكروليتر من 10٪ حجم من قبل حجم tyloxapol.
احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية لمدة 14 يوما. نقل الثقافة إلى خمسة 225 ملليلتر أنابيب أجهزة الطرد المركزي المخروطية والطرد المركزي في 2,850 مرات ز لمدة سبع دقائق في 20 درجة مئوية. جمع فائق الثقافة مع ماصة 50 ملليلتر وتصفية تعقيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون.
لعزل MEVs، نقل الترشيح الثقافة إلى نظام الترشيح فائقة الخلية أثار وضعت في أربع درجات مئوية وتصفية التركيز في ضغط أقل من 50 PSI من خلال 100 كيلودالون قطع غشاء. ثم الطرد المركزي تركيز الترشيح الثقافة في 15، 000 مرات ز لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية وجمع عظمى في أنابيب الطرد فائقة التركيز البولي. أجهزة الطرد المركزي في 100،000 مرات ز لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية.
بعد ذلك ، قم بإزالة السوبر و resuspend الكريات membranous في ما مجموعه ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة عن طريق الأنابيب لطيف. مزيج 0.5 ملليلتر من تعليق بيليه مع 1.5 ملليلتر من 60٪ iodixanol حل في الجزء السفلي من البولي بروبلين رقيقة مسورة جداً أنبوب. تراكب هذا iodixanol 45٪ تعليق مع ملليلتر واحد من 40٪35٪30٪25٪، و 20٪ iodixanol حلول وميليلتر واحد من برنامج تلفزيوني في الجزء العلوي.
أجهزة الطرد المركزي في 100،000 مرة ز لمدة 18 ساعة في أربع درجات مئوية. بعد ذلك، استخدم حقنة هاملتون ملليلتر واحدة لجمع كسور تدرج كثافة المليلتر واحد بدءا من الأعلى. تمييع كل جزء جمعه إلى 20 ملليلتر مع PBS والطرد المركزي بمعدل 100،000 مرة ز لمدة ساعتين في أربع درجات مئوية.
إزالة افرا و resuspend في 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. تخزين الأنابيب في أربع درجات مئوية. لإجراء تحليل الدهون الغشاء، والجمع بين 10 ميكرولترات من كل كسر التدرج مع مسبار الغشاء الفلورسنت TMA-DPH في تركيز نهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل بئر من لوحة سوداء 96 جيدا.
احتضان لوحات في 33 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قياس الفلوريسنس في 360 نانومتر للإثارة و 430 نانومتر للانبعاثات. في هذا البروتوكول، تم تنقية MEVs بواسطة تفاضلية الترسيب في تدرج الكثافة.
في ظل الظروف الموصوفة، تم فصل معظم MEVs في الكسر التدرجي ثلاثة الذي يتوافق مع 25٪ iodixanol. وتركزت البروتينات المرتبطة بالـحُيّة في الكسر الثالث الذي يظهره تحليل بقع النقطة. كما أكد التلطيخ السلبي وجود MEVs في الكسر الثالث وأظهر تحليل الجسيمات النانوية أن حجم MEV كان حوالي 100 نانومتر.
البروتين والدهون تركيز تطبيع إلى وحدات تشكيل مستعمرة أظهرت زيادة ثمانية أضعاف تقريبا من العائد MEV في الحديد منخفضة بالنسبة لظروف الحديد عالية. أظهر تحليل لطخة النقطة إشارة أكثر كثافة من العلامات المرتبطة بـ MEV في كسور تدرج الكثافة من ثقافة MTB المحدودة للحد من الحديد من الثقافات MTB الكافية. اتبع التعليمات لإعداد الحد الأدنى من المتوسطة لضمان ظروف محدودة للحديد ومنع تلوث حويصلات الغشاء مع مجاميع البروتين الدهني.
يمكن استخدام الغشاء الفطري الحفولي المنقى بهذه الطريقة في التوصيف الكيميائي الحيوي والتحليل الوظيفي.
