The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

인간의 과목을 포함하여 모든 실험은 지역 윤리위원회 (승인없이. 3/2/14)에 의해 승인되었습니다. 환자의 선택을위한 그러한 성별, 나이, 현재 치료 요법 때문에 혈액 MV 조성물 영향과 수 많은 여러 요인 컬렉션 22,23 샘플링하기 전에 고려되어야한다는 것을 주목해야한다. 플라즈마 샘플 1. 준비 <ol><li> EDTA (1.6 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 vacutainer 혈액 수집 튜브에 21 게이지 나비 바늘을 통해 기증자 당 혈액이 튜브 - 1을 그립니다. 효율적인 혈액 응고를 보장하기 위해 관 (들)을 여러 번 반전해야합니다. 참고 : - 15 mL의 후속 유동 세포 계측법과 서양 얼룩 분석을위한 혈액의 권장 용량은 5입니다. MV 열화 및 손실을 방지하기 위하여 혈액 샘플을 30 분 혈액 회수 후에 &lt;취급되어야한다. </li><li> 1,200 XG에에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하여 혈장 샘플을 준비실온 (RT). </li><li> 혈액 세포 (= 하층) 잔류 플라즈마 (= 상층)의 분리를 돕기 위해 밸브 필터를 적용한다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. </li><li> 1,500 XG에 15 분 동안 원심 분리, RT는 큰 세포 파편 펠렛 및 남은 혈소판을 제거합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 뜨는을 전송하고 직접 -20 ° C에서 최대 6 개월 MV 격리 또는 저장 샘플을 진행합니다. 주 : 제시된 프로토콜은 세포 배양 상청액에서 MV를 (그리고 EXOS)을 분리하는데 사용될 수있다. (24) 80 % 컨 플루 - -이를 위해, 60 ℃에서 세포를 배양 소포 고갈 FCS로 보충 된 배지에서 48 시간 후 상층 액을 수집한다. 750 XG에 5 분, 4 ° C를위한 원심 분리기, 잔류 떠있는 세포를 고갈 큰 세포 파편을 펠렛 1,500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 다시 새로운 15 mL의 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 채우기 위해. 이 상등액을 다음 조작량의 분리를 위해 사용될 수있다2.16 - 2.1 단계에 설명 된대로. </li></ol> MV를 2. 분리 <ol><li> 적절한 원심 관에 혈장 샘플을 옮긴다. 필요한 경우, 원심 분리 과정에서 박벽 관 붕괴 샘플을 희석 방지하기 위해 PBS로 관을 채운다. </li><li> 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다 뜨는, 튜브가 거꾸로 서서 종이 타월에 넣어 보관하십시오. 나머지 상층 액은 수건에 적셔하여 샘플에서 제거 될 때까지 5 분 - 3를 기다립니다. </li><li> 1000 μL PBS의 MV 펠렛을 재현 탁, 탁상 원심 분리기에서 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 1.5 mL의 튜브와 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 기음 뜨는. </li><li> 펠렛의 크기에 따라, 500 μL PBS - 50에서 MV 펠렛을 재현 탁. 대안 적으로, RIPA 완충액 예를 Lyse 직접 MV를, (150 mM의 염화나트륨 / 0.1 % SDS / 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 - / 1 % 트리톤 X-100 / 50mM 트리스, pH를 7.2)이후 웨스턴 블롯 분석. -20 ° C에서 보관 MV를. 그들은 몇 달 동안 안정적으로 유지하지만, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 선택적 : MV 수율을 평가 또는 후속 실험 MVS를 투약하기 위해 단백질 분석과 MV 단백질 농도 (예를 들어, 브래드 포드 또는 로우리 법) 결정한다. </li><li> 추가 EXOS 플라즈마 샘플에서 분리 될 경우, 110,000 XG, 4 ° C에서 2 시간에 대한 초 원심 분리 튜브와 원심 분리기로 단계 2.3에서 뜨는을 가만히 따르다. 단계 2.3에 설명 된대로 뜨는을 가만히 따르다, 1,000 μL PBS에 출 펠렛을 재현 탁하고 작은 (1.5 mL)을 초 원심 튜브에 전송합니다. <ol><li> 75 μL PBS 또는 RIPA 버퍼 - 50 110,000 XG, 4 ° C, 기음 뜨는 및 재현 탁 출 펠릿에서 2 시간 동안 초 원심 분리기. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 MV를 3. 특성 <ol><li> 이전 15 μL PBS + 1 % 소포 고갈 소 태아 혈청 (F유동 세포 계측법 튜브 CS). 주 : 소포 고갈 된 FCS (24)는 이전에 설명 된 바와 같이 0.2 ㎛의 필터로 상청액을 110,000 XG에서 18 시간 동안 FCS (56 ° C에서 30 분) 열 - 불 활성화를 원심 분리 및 여과에 의해 제조된다. </li><li> PBS에서 MV를 (3 μg의도 적용 할 수있는 낮은 수율의 경우) 5 μg의 추가. </li><li> 조작량 표면에서 비특이적 결합 부위를 차단함으로써, 배경 얼룩을 감소시키기 위해 실온에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 단백질의 관심에 대해 형광 표지 된 항체를 추가합니다. 낮은 신호 - 대 - 잡음비를 최적 농도를 결정하고 보장하기 위하여 사용하기 전에 염색에 사용 된 항체의 양을 적정한다. 또한 음성 대조군으로 염색 MV를 하나의 튜브 (항체의 1 μg의 사용하는 경우 예를 들어, 또한 이소 제어 1 μg의를 사용하는 것과 동일한 농도로 일치하는 이소 타입 대조군 항체로 염색 MV를 하나 튜브를 포함해야합니다tibody) 배경 염색을 정량화한다. 주 : 다른 형광 색소에 결합 된 다수의 항체를 첨가하여 세포 계측법 다색 플로우를 실행하는 것도 가능하다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 250 μL PBS를 추가하고 사이토 흐름을 사용하여 샘플의 측정을 진행합니다. <ol><li> 경우에 시료를 즉시 측정 할 수없는, 4 ° C에서 샘플 및 저장소를 해결하기 위해 150 μL PBS 50 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성이다. 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. </li></ol></li><li> 가능한 최저 값으로 흐름 cytometer의 임계 값을 줄이고 로그 스케일의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 앞으로 분산 형 (FSC)를 사용하여 MV 인구를 검색합니다. 뮤직 비디오 인구에 게이트 및 해당 히스토그램에서 형광 신호를 평가합니다. </li></ol> 웨스턴 블로 팅에 의해 MV를 4. 특성 <ol><li> 에서 직접 MV 펠렛을 재현 탁적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액). <ol><li> 적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액)에서 1 : MV 펠릿 이미 PBS에 재현 탁 된 경우에, 그것을 적어도 1 희석. </li></ol></li><li> 로우리 분석법에 의해 MV 샘플의 단백질 농도는, 예를 결정. </li><li> 22.5 μL RIPA 버퍼에 MV를 20 μg의 - (10)를 준비합니다. 그런 다음 95 ℃에서 5 분 동안 7.5 μL 배 램 믈리 로딩 버퍼와 열을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 폴리 아크릴 아미드 겔에로드 샘플 및 표준 프로토콜에 따라 전기 영동 및 면역를 수행합니다. </li><li> 막에 단백질을 전송 한 후, 표준 프로토콜에 따라 부하 제어 등의 개양귀비 빛 염색을 수행합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 TBST에 Destain 막. </li><li> TBST에서 5 % BSA에서 실온에서 최대 1 시간 30 분 동안 차단 막. </li><li> 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 39 ° C에서 차 항체와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> TBST 3 × 5 분으로 막을 씻으십시오.</li><li> 1의 희석에 HRP 결합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어 : 10,000 5 %의 BSA를. 주 : 높은 배경 신호의 경우, 대신 BSA의 분유를 사용한다. </li><li> TBST 3 배 5 분에 막 씻으십시오. </li><li> ECL 검출 시약 막을 개발하고 화학 발광 필름 또는 화학 발광 이미징 시스템에서 신호를 검출한다. 참고 EXOS에서 MVS를 구별하기 위해, 튜 불린 등의 단백질이 사용될 수있다 4 티닌 또는 mitofilin 주로 16,25 조작량에 존재해야한다. EXOS 마커로서 사용되는 대부분의 tetraspanin 항체 (예, CD9, CD81)은, 환원 조건에서 작동하지 않으며, 따라서, 70 ° C에서 10 분 동안 가열 하였다 비 환원성 로딩 완충액을 제조한다주의. </li></ol>

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D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> 혈액에서 전기 자동차에 대한 최근의 연구는 EV 조성 및 계산은 여러 질병의 원인 중에 변경할 것을 증명하고있다. 따라서 이러한 전기 자동차의 분석 및 추가 특성 추가 진단 및 예후에 대한 질병 바이오 마커로서의 사용 가능성을 평가하거나 치료 반응을 평가하기 위해 높은 관심입니다. 우리가 여기에 제시 프로토콜은 모든 세포 소기관을 포함하지 않는 최대 600 nm의 직경 소포의 분리를 할 수 있습니다. 이러한 관측 된 MV의 현재의 정의에 부합하며, 세포 자멸 소체 (2)의 존재를 배제. 종종 엑소 마커로서 사용되는 tetraspanins CD9 및 CD81 발현 약간만 동안 웨스턴 블로 팅을 사용하여, 우리는 상기 격리 된 MV는 튜 불린의 높은 발현을 표시 함을 입증 할 수 있었다. 이 MVS가 EXOS 차이가 있음을 확인하고 프로테오믹스 (25)에 의해 최근 심도있는 특성 모두 EV 인구의 비교에 적합합니다. 혈액 샘플을 수집하는 동안 콘텐츠 &quot;&gt;는 MV 저하를 방지하기 위해 짧은 가능한 정맥 천자 혈장 제제 사이의 시간을 유지하기 위해 중요하다. 또한, 혈액 샘플의 장기간 보관이 향상 MV를 일으키는 혈액 세포의 활성화를 초래할 수도 궁극적으로 세포 사멸 기관의 발표 결과 세포 사멸을 발산합니다. MV 격리를위한 또 다른 중요한 고려 사항은 따라서, 아래로 회전 후 가능한 한 상층 액만큼을 제거하는 것이 중요하다. 혈장 단백질 이하 EXOS와 MV 준비의 오염을 방지하는 것입니다 펠렛 정상적으로 볼 단단히 튜브의 벽에 부착되어 있기 때문에 14,000 × g에서 조작량이. 상등액 용이 피펫 팁으로 제거 될 수있다. EXOS 달리 고속 초 원심 분리에 의해 제조시 응집체를 형성하는 경향이있는 자주 재현 탁하기 어려운이 문제가 MV를 발생하지 않습니다. 본 연구는 possi 것을 보여준다유동 세포 계측법에 의해 혈액에 존재하는 MV의 소집단의 특성에 상상력. 대부분의 유동 세포 계측기의 검출 한계는 200이지만 - 300 nm의 조작량이 재현 명확 배경 신호로부터 자신의 구별을 허용 동일한 분석 파라미터들 및 게이트들과 도너뿐만 아니라 세포 배양 샘플에서 측정 하였다. 이는 PBS가 유동 세포 계측법 (도 3) 중 높은 배경을 일으킬 수있는 오염 입자를 포함하지 않는 분석에 사용한 측정에 앞서 확인하는 것이 중요하다. 일부 작은 MV를가 유세포 방식에서 캡처되지 않을 수 있지만, 우리는 모든 주요 혈액 세포 집단 (예, 혈소판, 적혈구, 백혈구, 내피 세포)에서 MVS를 발견했습니다. 29 - 우리의 분석에서 우리는 이전에 MV를 26 일에 발견 된 다른 혈액 세포에 대한 표준 마커를 사용했다. 또한 주목해야한다, t 유동 세포 계측법에 의해 최적의 결과를 얻기 위해서는그 금액과 모든 항체의 농도는 관심의 항원을 발현하는 MV 샘플에 적정해야한다. 혈액에서 특정 MV의 소집단이 높은 특이성으로 식별되어야한다 경우, 각각의 MV를에 두 개의 서로 다른 항원 존재에 대해 이중 염색을 수행하고 이후 23 분석에만 모든 더블 긍정적 인 MVS를 고려하는 것이 가능하다. 현재 건강한 사람 23,30의 혈액에 MV의 개체군의 표준 범위를 정의하기위한 노력이있다. 이 연구는 이미 혈소판 유래 MVS가 우리의 관찰과 대응에 혈액의 MV를 가장 큰 인구를 구성하는 것으로 나타났습니다. MV 샘플의 특성을 유동 세포 계측법의 하나의 장점은이 방법은 이미 잘 일상적인 임상 진단에서 바이오 마커 등의 MV를의 가능한 사용을 허용하는 대부분의 임상 센터에서 진단 목적으로 설립된다는 점이다. 주로 초점을 혈액에서 전기 자동차에 대한 이전의 연구작은 EXOS에 에드 선택적 원하는 엑소 목표 인구 (31, 32)를 분석하는 특정 분류 절차 중 하나에 의존하거나 분석 18 일 전에 비드 라텍스 EXOS의 커플 링 시간 소모적 (2 일) 분리 공정을 필요로한다. 우리의 관찰되지 않은 전혈 제제의 조작량의 유세포 분석은 심지어 그러한 선택 과정없이 종양 유래의 MV와 같은 조작량의 검출을 허용하는 것이 제안한다. 여기에 제시된 프로토콜은 표준 실험실 장비와 말초 혈액 샘플에서 MV를의 빠른 분리를 허용하고 그 이후의 특성은 유동 세포 계측법과 서양 블로 팅하여, 함께. 전체 프로세스는 질병 표지자로서 조작량의 전위를 평가하는 데 필요한 환자의 혈액 MV 프로파일에 미래 연구를 용이하게 약 2 시간 동안 수행 될 수있다.

지난 몇 년 동안 시험 관내 연구에 많은 세포 소낭은 EVS (는) 간 통신에있어서 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 살아있는 세포는 지속적으로 크기, 콘텐츠 및 생합성에 차이가 소포를 흘렸다. 가장 좋은 공부 전기 자동차는이 multivesicular 몸에서 관내 소포로 저장되는 위치 엔도 좀의 시스템에서 발생하는 엑소 좀 있습니다. 세포막과 후자 퓨즈되면 함유 소포는 엑소 좀으로 방출된다 (EXOS 직경이 30-100 nm 인 1). 세포막이 직접 오프 꽃 봉오리 - 지난 몇 년 동안 증가 관심을 얻고있다 EV의 두 번째 인구는 큰 마이크로 소포 (1,000 nm의 MV를, 직경 100)이다. 5, 이들이 인접하는 C로 전송할 수있는 단백질의 과다 - 소포 두 유형, 예를 들어, DNA, mRNA의 또는 miRNA의 3 지질 이중층에 의해 둘러싸인 핵산이 포함되어있다ELL 학생. 일반적으로 소포의 단백질 조성물은 원래 셀의 상태를 반영하면서, 일부 단백질은 선택적 타겟팅 및 전기 자동차 (1)에 농축 된 것으로 보인다. 주요 연구 관심은 신규 한 바이오 마커로서 전기차의 사용을 허용 할 수 특정 EV 서명을 정의하기 위해 이상 및 질병 세포로부터 전기차의 특성이다. 특히 종종 종양 자체가 쉽게 액세스하지 않는 암에서 혈액 종양 특이 전기차 타겟팅 액체 생검 치료 반응의 모니터링을 허용하거나 침습적 6 없이도 일차 종양 특성화 도울 것이다. 실제로, 전기 자동차는 이미 성공적으로 소변 7, CSF 8, 모유 (9) 또는 혈액 (10) 등 다양한 체액에서 분리되었다. 몇몇 연구는 다른 인간의 질병에 EV 계수의 변화와 구성을 확인했다. 예를 들어, 패혈증 환자 프로 응집제 조작량의 수이다상당히 건강한 사람 (11)에 비해 증가했다. 또한 심각한 뇌 말라리아 환자에서 혈중 총 조작량의 증가가 관찰 될 수 있고, 혈소판 유래 된 MV의 수는 코마 깊이 감소증 (12)과 상관 관계. 다른 연구는이 심혈 13,14 높은 확률과 상관, 전신성 홍 반성 루푸스 또는 심부전 환자에서, 후자의 경우는 내피 - 유래 소체의 상승 된 수치를보고한다. 특히 암, 혈액의 전기 자동차는 현재 진단 및 예후 가치와 새로운 바이오 마커로 설명합니다. 이러한 MUC1, EGFR 또는 FAK 같은 종양 관련 단백질을 발현하는 MV를의 수준은 유방암 환자 (15, 16)의 혈액에서 증가 할 것으로 보인다. 또한 EXOS를 들어, 최근의 연구는 Glypican-1 초기 질병 드를 허용 유방암 췌장암 또는 델-1과 같은 종양 특이 항원을 운반하는 혈액 유래 EXOS을 보여 주었다높은 특이성과 감도 (17, 18)와 tection. 게다가, 혈청 - 유래 종양 EXOS는 KRAS 및 치료 예측 19의 사용을 제안 p53과 같은 돌연변이의 검출에 사용할 수있는 DNA를 포함 할 수있다. 최근 진보는 특정 마이크로 유체 칩을 사용하여 아교 모세포종 환자의 혈액에서 EXOS의 분석 요법 (20)의 감시를 허용 보여 주었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 소포의 질병 별 소집단의 분석은 진단, 예후뿐만 아니라 치료 옵션과 성공에 대한 유용한 정보를 제공하는 것을 의미한다. 그러나, 혈액 EXOS의 분리 및 분석은 시간 소모적이다 특별한 실험 장비를 필요로하기 때문에 아직 일상적인 임상 진단에 적합하지 않다. 대조적으로, 조작량은 EXOS (18)에 필요로 계측법 라텍스 비드에 결합을 할 필요없이 쉽게 흐르지 의해 분석 될 수 있고, 그들의 큰 크기에 훨씬 빨리 격리 될 수21. 따라서, 우리가 혈액 샘플의 조작량의 표준 단리 및 유동 세포 계측법에 의해 MV의 개체군의 후속 특성화에 사용될 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 추가 연구와 일상적인 임상 진단을위한 MVS를 사용하기 위해 필요합니다 큰 환자 그룹의 MV 프로파일의 깊이 특성에 허용됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>butterfly needle (21 gauge)</td>
			<td>Hospira Deutschland GmbH</td>
			<td>490P29201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8076.3</td>
			<td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H2O and adjust pH to 7.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H2O and add 1 mL Tween-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD235a-PE</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A07792</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-FITC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>7782</td>
			<td>use 5&#181;l for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62E-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>336008</td>
			<td>use 0.8&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD62P-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>304905</td>
			<td>use 0.1&#181;g for staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD81 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>349501</td>
			<td>1:2000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD9 antibody</td>
			<td>Immunotools</td>
			<td>21270091</td>
			<td>1:1000 in 5%BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td>
			<td>Fujitsu Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC protein assay kit II</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>5000112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL detection reagent</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>RPN2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA vacutainers for blood collection</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>01.1605.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal calf serum (FCS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10091148</td>
			<td>heat-inactivated (30 min, 56&#176;C)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>filter 0.22&#181;m</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td>santa cruz</td>
			<td>sc-2004</td>
			<td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td>
			<td>Roth</td>
			<td>K929.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microfuge SIGMA 1-15K</td>
			<td>Sigma Laborzentrifugen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>170-6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multifuge 3 L-R</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM10</td>
			<td>NanoSight Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, w/o Ca and Mg</td>
			<td>Pan biotech</td>
			<td>P04-36500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perfusor syringe 50 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8728844F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ponceau-S staining solution</td>
			<td>PanReac AppliChem</td>
			<td>A2935,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6x 17 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10x 1.5 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>344061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>343778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05-829</td>
			<td>1:5000 in 5%BSA in TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultracentrifuge TL-100</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve filter Seraplas V15</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>53,428</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

작은 엔도 좀 유래 엑소 좀 (EXOS, 직경 &lt;100 ㎚) 및 대형 플라즈마 막 유래 마이크로 소포 (MV를, 직경&gt; 100 ㎚)를 포함하는 세포 외 소포 (전기 자동차)의 방출은 모든 살아있는 세포에서 발생하는 근본적인 세포 과정이다. 원산지 자신의 휴대 및 시험 관내 연구에서 특정이 소포 수송 단백질, 지질 및 핵산은 세포 간 의사 소통의 매개체로 자신의 중요성을 강조했다. 전기차 성공적 다양한 체액으로부터 분리 된 혈액에서 특히 전기차 암 또는 감염성 질병에 대한 생체 유망한 것으로 확인되었다. 혈액 MV의 개체군 연구를 허용하기 위해, 우리는 말초 혈액에서 조작량의 표준 단리 및 특성화를위한 프로토콜을 제시한다. MV를 차동 원심 분리하여 EDTA-항 응고 혈장 샘플에서 펠렛 일반적으로 (100)의 직경을 가지고있다 - 600 nm의. 그들의 더 큰 크기로, 그들은 수쉽게 유동 세포 계측법, 정기적으로 임상 진단에 사용되는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 기술에 의해 연구 될 수있다. 격리 된 MV의 품질 관리 분석을위한 여러 실시 예를 설명한다 혈액 다른 MV 개체군의 판정에 사용할 수있는 마커를 제공한다.

전술 한 프로토콜에 따라 단리 될 수 조작량의 수율을 정량화하기 위해, 우리는 열 도너의 혈액으로부터 분리 된 MV의 양을 계산 하였다. 라 단백질 분석에서 평가 된 MV 수율은 mL의 혈액 당 19.2 μg의 MV를 (표 1)의 평균과 μg의 30까지 10에서였다. 나노 추적 분석 (NTA)에 의해 결정되는 입자의 농도가 1.66 × 109 mL의 플라즈마에서 샘플 당 5.9 × 109 입자 (표 2)의 평균이 2.36 × 106 (10)이었다. 투과 전자 현미경에 의한 MV를의 추가 특성은 지질 이중층에 의해 포위하고있는 세포 소기관 (그림 1A)를 포함하지 않은 직경&gt; 100 nm의와 소포의 인구를 한 것으로 밝혀졌습니다. NTA는 절연 조작량의 크기가 600 나노 미터 (도 1b) 및 MV 평균 크기 100 원거리에서 확인되었다 201나노 미터 (도 1C). 웨스턴 블로 팅에 의한 전형적인 MV 및 출 마커 염색하면 격리 MVS가 tubulin에 양성이었고, EXOS는 튜 불린에 대한 부정적이었고, CD9 및 CD81 (그림 2) 풍부한 동안 만, CD9 및 CD81의 약간의 표현을 보여 주었다 보여 주었다. 유동 세포 계측법 (도 3a)에 의해 격리 된 MV의 분석은 일반적으로 세포 배양 상청액에서 분리 된 MV들에 사용 된 것과 동일한 파라미터를 이용하여 게이팅 될 수있는 정의 소낭 집단을 계시하고는 PBS의 측정에 의해 얻어진 배경 신호로부터 명확히 달랐다 + 1 %의 조작량 (도 3b)을 첨가하지 않은 FCS를 소포 고갈. 혈액 중에 존재하는 다른 MV 개체군을 분석하기 위해, MV들은 예 CD62P 혈소판 유래 MV를 들어, CD45, 백혈구 유래 MV를 들면, CD235a 들어, 다른 혈액 세포 집단 확립 마커 염색적혈구 내피 세포 유래 MV를 (그림 4)에 대한 MV를하고 CD62E을 세포 유래. 이 특성은 MV를 대부분의 모든 샘플에서 혈소판에 의해 흘릴 듯하면서 MV의 개체군의 비율은 조사 기증자의 혈액 샘플 사이에 차이가 있음을 보여 주었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> 그림 1 : 말초 혈액에서 분리 된 MV의 크기 분포. A, 격리 된 MV는 투과 전자 현미경에 의해 가시화 하였다. B, 소포의 크기 분포를 나타낸 조작량의 대표적인 나노 추적 분석 (NTA). C (10)로부터 독립적으로 제제의 평균 MV 크기 NTA (평균)을 측정 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">알을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 arger 버전입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> 그림 2 : 웨스턴 블로 팅에 의해 고립 된 MV의 특성. 두 기증자로부터 격리 된 MV들과 EXOS에 차등 단백질 발현은 웨스턴 블로 팅에 의해 가시화되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> 그림 3 : 유동 세포 계측법에 의해 MV를 분석. A, MV를 먼저 각각의 MV 인구에 게이트에 sidescatter (SSC) 플롯 대 앞으로 (FSC)에 시각화된다. 그 후,이 MV를가 관심의 항원에 의한에 대한 특징<html> 항원에 대해 지시 형광 표지 된 항체를 사용. B, 두 기증자의 혈장에서 분리 MV를위한 SSC 플롯 대 일반적인 FSC. 비교 만 PBS + 1 % 소포 고갈 조작량없이 FCS를 사용하여 세포 배양액뿐 아니라 음성 대조군으로부터 격리 A549 폐암 세포의 종양 세포 유래 MV를위한 전형적인 플롯은 오른쪽에 표시된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> 그림 4 : 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 MV의 특성. 세 기증자 MV를 유동 세포 계측법에 의해 설립 된 혈액 세포 마커 (적색)의 발현을 특징으로 하였다. 각각의 아이소 타입 컨트롤은 회색으로 표시됩니다.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> MVS / mL의 혈액 [μg의] </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> #삼 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 말초 혈액 샘플에서 MV 단백질 수율. </str옹&gt; 표시됨 10 기증자에서 도출 된 mL의 말초 혈액 당 MV를의 양입니다. MV 수익률은 로리의 분석에 의해 정량화 하였다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> MVS / ㎖의 혈장 [입자 수] </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> #삼 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 말초 혈액 샘플에서 MV 입자 항복. </st룽&gt; MV 10 공여자 입자 계수는 나노 추적 분석에 의해 측정 하였다 혈장 샘플로부터 분리 하였다. 세 독립적 인 측정의 평균치가 도시.

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K 조회수.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

신생아 마우스의 폐 내피 세포의 분리 및 문화

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

연구

생물학

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

RNA 함유 Exosomes의 분리 및 특성

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

STEMCCA Lentiviral 벡터를 사용하여 말초 혈에서 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

인간의 골격 근육에서 혈관 유래 다 능성 전구체의 분리

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular mechanisms underlying endothelial dysfunction in these individuals. However, the recent identification of blood outgrowth endothelial cells (BOECs), generated from circulating endothelial progenitors in adult peripheral blood, may circumvent this limitation by offering an endothelial-like, primary cell surrogate for patient-derived endothelial cells. Beyond their value to understanding endothelial biology and disease modeling, BOECs have potential uses in endothelial cell transplantation therapies. They are also a suitable cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) via nuclear reprogramming, offering a number of advantages over other cell types. We describe a method for the reliable generation, culture and characterization of BOECs from adult peripheral blood for use in these and other applications. This approach (i) allows for the generation of patient-specific endothelial cells from a relatively small volume of adult peripheral blood and (ii) produces cells that are highly similar to primary endothelial cells in morphology, cell signaling and gene expression.

This protocol allows for the reliable generation and characterization of blood outgrowth endothelial cells (BOECs) from a small volume of adult peripheral blood. BOECs can be used as a surrogate for endothelial cells from patients with vascular disorders and as a substrate for the generation of induced pluripotent stem cells.

사람 말초 혈액에서 생성 및 문화 혈액의 파생물 내피 세포

Historically, the limited availability of primary endothelial cells from patients with vascular disorders has hindered the study of the molecular ...

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper (cTfh) Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the lymph node microenvironment in B-cell non-Hodgkin&#39;s lymphoma is analyzed. Subsets of circulating T-follicular helper cells (cTfh), the circulating memory compartment of Tfh cells in the blood, are also perturbed in disease and therefore represent potential novel predictive biomarkers. Peripheral blood-based testing is advantageous because it is relatively non-invasive and allows simple serial monitoring.This article describes a method for isolating CD4+ T-cells from human blood, and further analysis by flow-cytometry to enumerate cTfh cells and the proportions of their various subsets (cTfhPD-1-/+/hi, cTfh1,2,17 and cTfh1/17). The level of these subsets was then compared between normal subjects and patients with lymphoma. We found that the method was robust enough to obtain reliable results from routinely collected patient material. The technique we describe for the analysis can be easily adapted to cell sorting and downstream applications such as RT-PCR.

Isolation of CD4+ T-cells and Analysis of Circulating T-follicular Helper cTfh Cell Subsets from Peripheral Blood Using 6-color Flow Cytometry

Here, a protocol for the isolation and characterization of CD4+ T-cell subsets from human peripheral blood is described. Purified CD4+ T-cells are analyzed by flow cytometry to determine proportions of T-follicular helper cell subsets.

CD4의 격리+ T-세포 및 분석의 순환 T-follicular 도우미 (cTfh) 6 컬러 Flow Cytometry 주변 혈액을 사용 하 여에서 셀 하위 집합

Aberrant T-follicular helper (Tfh) cell activity is detectable in autoimmune conditions and their presence is associated with clinical outcomes when the ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

성인 심장 섬유 아세포 및 근섬유 아세포의 격리 및 특성화

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the isolation of these vesicles, including ultracentrifugation, ultrafiltration, and size exclusion chromatography. However, not all are suitable for large scale exosome purification and characterization. Outlined here is a protocol for establishing cultures of primary fibroblasts isolated from adult mouse skeletal muscles, followed by purification and characterization of exosomes from the culture media of these cells. The method is based on the use of sequential centrifugation steps followed by sucrose density gradients. Purity of the exosomal preparations is then validated by western blot analyses using a battery of canonical markers (i.e., Alix, CD9, and CD81). The protocol describes how to isolate and concentrate bioactive exosomes for electron microscopy, mass spectrometry, and uptake experiments for functional studies. It can easily be scaled up or down and adapted for exosome isolation from different cell types, tissues, and biological fluids.

This protocol illustrates the 1) the isolation and culture of primary fibroblasts from the adult mouse gastrocnemius muscle as well as 2) purification and characterization of exosomes using a differential ultracentrifugation method combined with sucrose density gradients followed by western blot analyses.

골격근 섬유아세포(Skeletal Muscle Fibroblast)에서 엑소좀의 분리 및 특성 분석(Isolation and Characterization of Exosomes from Skeletal Muscle Fibroblasts)

Exosomes are small extracellular vesicles released by virtually all cells and secreted in all biological fluids. Many methods have been developed for the ...

Isolation of Human Neutrophils from Whole Blood and Buffy Coats

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells recruited at the site of inflammation via rapid extravasation through vessels. There, neutrophils perform an array of functions to kill invading pathogens and mediate immune signaling. Freshly purified neutrophils from human blood are the model of choice for study, as no cell line fully replicates PMN functions and biology. However, neutrophils are short-lived, terminally differentiated cells and are highly susceptible to activation in response to physical (temperature, centrifugation speed) and biological (endotoxin, chemo- and cytokines) stimuli. Therefore, it is crucial to follow a standardized, reliable, and fast method to obtain pure and non-activated cells. This protocol presents an updated protocol combining density gradient centrifugation, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain high PMN purity and minimize cell activation. Furthermore, methods to assess neutrophil isolation quality, viability, and purity are also discussed.

This protocol details a method for the isolation of neutrophils from whole blood, buffy coats, or leukapheresis membranes, achieving good yield, high purity, and minimal cell activation. We utilize gradient purification, red blood cell (RBC) sedimentation, and RBC lysis to obtain a high-quality/purity neutrophil preparation.

전신 혈액과 버피 코트에서 인간의 호중구의 격리

Neutrophils (PMNs) are the most abundant leukocytes in human circulation, ranging from 40 to 70% of total blood leukocytes. They are the first cells ...