Name: isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
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The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

인간의 과목을 포함하여 모든 실험은 지역 윤리위원회 (승인없이. 3/2/14)에 의해 승인되었습니다. 환자의 선택을위한 그러한 성별, 나이, 현재 치료 요법 때문에 혈액 MV 조성물 영향과 수 많은 여러 요인 컬렉션 22,23 샘플링하기 전에 고려되어야한다는 것을 주목해야한다. 플라즈마 샘플 1. 준비 <ol><li> EDTA (1.6 ㎎ / ㎖의 혈액을)를 포함하는 vacutainer 혈액 수집 튜브에 21 게이지 나비 바늘을 통해 기증자 당 혈액이 튜브 - 1을 그립니다. 효율적인 혈액 응고를 보장하기 위해 관 (들)을 여러 번 반전해야합니다. 참고 : - 15 mL의 후속 유동 세포 계측법과 서양 얼룩 분석을위한 혈액의 권장 용량은 5입니다. MV 열화 및 손실을 방지하기 위하여 혈액 샘플을 30 분 혈액 회수 후에 &lt;취급되어야한다. </li><li> 1,200 XG에에서 15 분 동안 샘플을 원심 분리하여 혈장 샘플을 준비실온 (RT). </li><li> 혈액 세포 (= 하층) 잔류 플라즈마 (= 상층)의 분리를 돕기 위해 밸브 필터를 적용한다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 플라즈마를 전송합니다. </li><li> 1,500 XG에 15 분 동안 원심 분리, RT는 큰 세포 파편 펠렛 및 남은 혈소판을 제거합니다. </li><li> 15 ㎖의 튜브에 뜨는을 전송하고 직접 -20 ° C에서 최대 6 개월 MV 격리 또는 저장 샘플을 진행합니다. 주 : 제시된 프로토콜은 세포 배양 상청액에서 MV를 (그리고 EXOS)을 분리하는데 사용될 수있다. (24) 80 % 컨 플루 - -이를 위해, 60 ℃에서 세포를 배양 소포 고갈 FCS로 보충 된 배지에서 48 시간 후 상층 액을 수집한다. 750 XG에 5 분, 4 ° C를위한 원심 분리기, 잔류 떠있는 세포를 고갈 큰 세포 파편을 펠렛 1,500 XG, 4 ° C에서 5 분 동안 다시 새로운 15 mL의 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 채우기 위해. 이 상등액을 다음 조작량의 분리를 위해 사용될 수있다2.16 - 2.1 단계에 설명 된대로. </li></ol> MV를 2. 분리 <ol><li> 적절한 원심 관에 혈장 샘플을 옮긴다. 필요한 경우, 원심 분리 과정에서 박벽 관 붕괴 샘플을 희석 방지하기 위해 PBS로 관을 채운다. </li><li> 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 원심 분리기. </li><li> 가만히 따르다 뜨는, 튜브가 거꾸로 서서 종이 타월에 넣어 보관하십시오. 나머지 상층 액은 수건에 적셔하여 샘플에서 제거 될 때까지 5 분 - 3를 기다립니다. </li><li> 1000 μL PBS의 MV 펠렛을 재현 탁, 탁상 원심 분리기에서 14,000 XG, 4 ° C에서 35 분 동안 1.5 mL의 튜브와 원심 분리기에 전송합니다. </li><li> 기음 뜨는. </li><li> 펠렛의 크기에 따라, 500 μL PBS - 50에서 MV 펠렛을 재현 탁. 대안 적으로, RIPA 완충액 예를 Lyse 직접 MV를, (150 mM의 염화나트륨 / 0.1 % SDS / 0.5 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 - / 1 % 트리톤 X-100 / 50mM 트리스, pH를 7.2)이후 웨스턴 블롯 분석. -20 ° C에서 보관 MV를. 그들은 몇 달 동안 안정적으로 유지하지만, 반복 동결 - 해동 사이클을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 선택적 : MV 수율을 평가 또는 후속 실험 MVS를 투약하기 위해 단백질 분석과 MV 단백질 농도 (예를 들어, 브래드 포드 또는 로우리 법) 결정한다. </li><li> 추가 EXOS 플라즈마 샘플에서 분리 될 경우, 110,000 XG, 4 ° C에서 2 시간에 대한 초 원심 분리 튜브와 원심 분리기로 단계 2.3에서 뜨는을 가만히 따르다. 단계 2.3에 설명 된대로 뜨는을 가만히 따르다, 1,000 μL PBS에 출 펠렛을 재현 탁하고 작은 (1.5 mL)을 초 원심 튜브에 전송합니다. <ol><li> 75 μL PBS 또는 RIPA 버퍼 - 50 110,000 XG, 4 ° C, 기음 뜨는 및 재현 탁 출 펠릿에서 2 시간 동안 초 원심 분리기. </li></ol></li></ol> 유동 세포 계측법에 의해 MV를 3. 특성 <ol><li> 이전 15 μL PBS + 1 % 소포 고갈 소 태아 혈청 (F유동 세포 계측법 튜브 CS). 주 : 소포 고갈 된 FCS (24)는 이전에 설명 된 바와 같이 0.2 ㎛의 필터로 상청액을 110,000 XG에서 18 시간 동안 FCS (56 ° C에서 30 분) 열 - 불 활성화를 원심 분리 및 여과에 의해 제조된다. </li><li> PBS에서 MV를 (3 μg의도 적용 할 수있는 낮은 수율의 경우) 5 μg의 추가. </li><li> 조작량 표면에서 비특이적 결합 부위를 차단함으로써, 배경 얼룩을 감소시키기 위해 실온에서 30 분 동안 샘플을 인큐베이션. </li><li> 단백질의 관심에 대해 형광 표지 된 항체를 추가합니다. 낮은 신호 - 대 - 잡음비를 최적 농도를 결정하고 보장하기 위하여 사용하기 전에 염색에 사용 된 항체의 양을 적정한다. 또한 음성 대조군으로 염색 MV를 하나의 튜브 (항체의 1 μg의 사용하는 경우 예를 들어, 또한 이소 제어 1 μg의를 사용하는 것과 동일한 농도로 일치하는 이소 타입 대조군 항체로 염색 MV를 하나 튜브를 포함해야합니다tibody) 배경 염색을 정량화한다. 주 : 다른 형광 색소에 결합 된 다수의 항체를 첨가하여 세포 계측법 다색 플로우를 실행하는 것도 가능하다. </li><li> 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 품어. </li><li> 250 μL PBS를 추가하고 사이토 흐름을 사용하여 샘플의 측정을 진행합니다. <ol><li> 경우에 시료를 즉시 측정 할 수없는, 4 ° C에서 샘플 및 저장소를 해결하기 위해 150 μL PBS 50 μL 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)를 추가합니다. 주의 : PFA는 독성이다. 장갑과 적절한 개인 보호 장비를 사용합니다. </li></ol></li><li> 가능한 최저 값으로 흐름 cytometer의 임계 값을 줄이고 로그 스케일의 측면 산란 (SSC) 플롯 대 앞으로 분산 형 (FSC)를 사용하여 MV 인구를 검색합니다. 뮤직 비디오 인구에 게이트 및 해당 히스토그램에서 형광 신호를 평가합니다. </li></ol> 웨스턴 블로 팅에 의해 MV를 4. 특성 <ol><li> 에서 직접 MV 펠렛을 재현 탁적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액). <ol><li> 적합한 용해 완충액 (예, RIPA 완충액)에서 1 : MV 펠릿 이미 PBS에 재현 탁 된 경우에, 그것을 적어도 1 희석. </li></ol></li><li> 로우리 분석법에 의해 MV 샘플의 단백질 농도는, 예를 결정. </li><li> 22.5 μL RIPA 버퍼에 MV를 20 μg의 - (10)를 준비합니다. 그런 다음 95 ℃에서 5 분 동안 7.5 μL 배 램 믈리 로딩 버퍼와 열을 추가 할 수 있습니다. </li><li> 폴리 아크릴 아미드 겔에로드 샘플 및 표준 프로토콜에 따라 전기 영동 및 면역를 수행합니다. </li><li> 막에 단백질을 전송 한 후, 표준 프로토콜에 따라 부하 제어 등의 개양귀비 빛 염색을 수행합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 TBST에 Destain 막. </li><li> TBST에서 5 % BSA에서 실온에서 최대 1 시간 30 분 동안 차단 막. </li><li> 밤새 또는 실온에서 2 시간 동안 39 ° C에서 차 항체와 함께 막을 인큐베이션. </li><li> TBST 3 × 5 분으로 막을 씻으십시오.</li><li> 1의 희석에 HRP 결합 된 이차 항체와 멤브레인을 품어 : 10,000 5 %의 BSA를. 주 : 높은 배경 신호의 경우, 대신 BSA의 분유를 사용한다. </li><li> TBST 3 배 5 분에 막 씻으십시오. </li><li> ECL 검출 시약 막을 개발하고 화학 발광 필름 또는 화학 발광 이미징 시스템에서 신호를 검출한다. 참고 EXOS에서 MVS를 구별하기 위해, 튜 불린 등의 단백질이 사용될 수있다 4 티닌 또는 mitofilin 주로 16,25 조작량에 존재해야한다. EXOS 마커로서 사용되는 대부분의 tetraspanin 항체 (예, CD9, CD81)은, 환원 조건에서 작동하지 않으며, 따라서, 70 ° C에서 10 분 동안 가열 하였다 비 환원성 로딩 완충액을 제조한다주의. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

<html> 혈액에서 전기 자동차에 대한 최근의 연구는 EV 조성 및 계산은 여러 질병의 원인 중에 변경할 것을 증명하고있다. 따라서 이러한 전기 자동차의 분석 및 추가 특성 추가 진단 및 예후에 대한 질병 바이오 마커로서의 사용 가능성을 평가하거나 치료 반응을 평가하기 위해 높은 관심입니다. 우리가 여기에 제시 프로토콜은 모든 세포 소기관을 포함하지 않는 최대 600 nm의 직경 소포의 분리를 할 수 있습니다. 이러한 관측 된 MV의 현재의 정의에 부합하며, 세포 자멸 소체 (2)의 존재를 배제. 종종 엑소 마커로서 사용되는 tetraspanins CD9 및 CD81 발현 약간만 동안 웨스턴 블로 팅을 사용하여, 우리는 상기 격리 된 MV는 튜 불린의 높은 발현을 표시 함을 입증 할 수 있었다. 이 MVS가 EXOS 차이가 있음을 확인하고 프로테오믹스 (25)에 의해 최근 심도있는 특성 모두 EV 인구의 비교에 적합합니다. 혈액 샘플을 수집하는 동안 콘텐츠 &quot;&gt;는 MV 저하를 방지하기 위해 짧은 가능한 정맥 천자 혈장 제제 사이의 시간을 유지하기 위해 중요하다. 또한, 혈액 샘플의 장기간 보관이 향상 MV를 일으키는 혈액 세포의 활성화를 초래할 수도 궁극적으로 세포 사멸 기관의 발표 결과 세포 사멸을 발산합니다. MV 격리를위한 또 다른 중요한 고려 사항은 따라서, 아래로 회전 후 가능한 한 상층 액만큼을 제거하는 것이 중요하다. 혈장 단백질 이하 EXOS와 MV 준비의 오염을 방지하는 것입니다 펠렛 정상적으로 볼 단단히 튜브의 벽에 부착되어 있기 때문에 14,000 × g에서 조작량이. 상등액 용이 피펫 팁으로 제거 될 수있다. EXOS 달리 고속 초 원심 분리에 의해 제조시 응집체를 형성하는 경향이있는 자주 재현 탁하기 어려운이 문제가 MV를 발생하지 않습니다. 본 연구는 possi 것을 보여준다유동 세포 계측법에 의해 혈액에 존재하는 MV의 소집단의 특성에 상상력. 대부분의 유동 세포 계측기의 검출 한계는 200이지만 - 300 nm의 조작량이 재현 명확 배경 신호로부터 자신의 구별을 허용 동일한 분석 파라미터들 및 게이트들과 도너뿐만 아니라 세포 배양 샘플에서 측정 하였다. 이는 PBS가 유동 세포 계측법 (도 3) 중 높은 배경을 일으킬 수있는 오염 입자를 포함하지 않는 분석에 사용한 측정에 앞서 확인하는 것이 중요하다. 일부 작은 MV를가 유세포 방식에서 캡처되지 않을 수 있지만, 우리는 모든 주요 혈액 세포 집단 (예, 혈소판, 적혈구, 백혈구, 내피 세포)에서 MVS를 발견했습니다. 29 - 우리의 분석에서 우리는 이전에 MV를 26 일에 발견 된 다른 혈액 세포에 대한 표준 마커를 사용했다. 또한 주목해야한다, t 유동 세포 계측법에 의해 최적의 결과를 얻기 위해서는그 금액과 모든 항체의 농도는 관심의 항원을 발현하는 MV 샘플에 적정해야한다. 혈액에서 특정 MV의 소집단이 높은 특이성으로 식별되어야한다 경우, 각각의 MV를에 두 개의 서로 다른 항원 존재에 대해 이중 염색을 수행하고 이후 23 분석에만 모든 더블 긍정적 인 MVS를 고려하는 것이 가능하다. 현재 건강한 사람 23,30의 혈액에 MV의 개체군의 표준 범위를 정의하기위한 노력이있다. 이 연구는 이미 혈소판 유래 MVS가 우리의 관찰과 대응에 혈액의 MV를 가장 큰 인구를 구성하는 것으로 나타났습니다. MV 샘플의 특성을 유동 세포 계측법의 하나의 장점은이 방법은 이미 잘 일상적인 임상 진단에서 바이오 마커 등의 MV를의 가능한 사용을 허용하는 대부분의 임상 센터에서 진단 목적으로 설립된다는 점이다. 주로 초점을 혈액에서 전기 자동차에 대한 이전의 연구작은 EXOS에 에드 선택적 원하는 엑소 목표 인구 (31, 32)를 분석하는 특정 분류 절차 중 하나에 의존하거나 분석 18 일 전에 비드 라텍스 EXOS의 커플 링 시간 소모적 (2 일) 분리 공정을 필요로한다. 우리의 관찰되지 않은 전혈 제제의 조작량의 유세포 분석은 심지어 그러한 선택 과정없이 종양 유래의 MV와 같은 조작량의 검출을 허용하는 것이 제안한다. 여기에 제시된 프로토콜은 표준 실험실 장비와 말초 혈액 샘플에서 MV를의 빠른 분리를 허용하고 그 이후의 특성은 유동 세포 계측법과 서양 블로 팅하여, 함께. 전체 프로세스는 질병 표지자로서 조작량의 전위를 평가하는 데 필요한 환자의 혈액 MV 프로파일에 미래 연구를 용이하게 약 2 시간 동안 수행 될 수있다.

지난 몇 년 동안 시험 관내 연구에 많은 세포 소낭은 EVS (는) 간 통신에있어서 중요한 역할을한다는 것을 보여 주었다. 살아있는 세포는 지속적으로 크기, 콘텐츠 및 생합성에 차이가 소포를 흘렸다. 가장 좋은 공부 전기 자동차는이 multivesicular 몸에서 관내 소포로 저장되는 위치 엔도 좀의 시스템에서 발생하는 엑소 좀 있습니다. 세포막과 후자 퓨즈되면 함유 소포는 엑소 좀으로 방출된다 (EXOS 직경이 30-100 nm 인 1). 세포막이 직접 오프 꽃 봉오리 - 지난 몇 년 동안 증가 관심을 얻고있다 EV의 두 번째 인구는 큰 마이크로 소포 (1,000 nm의 MV를, 직경 100)이다. 5, 이들이 인접하는 C로 전송할 수있는 단백질의 과다 - 소포 두 유형, 예를 들어, DNA, mRNA의 또는 miRNA의 3 지질 이중층에 의해 둘러싸인 핵산이 포함되어있다ELL 학생. 일반적으로 소포의 단백질 조성물은 원래 셀의 상태를 반영하면서, 일부 단백질은 선택적 타겟팅 및 전기 자동차 (1)에 농축 된 것으로 보인다. 주요 연구 관심은 신규 한 바이오 마커로서 전기차의 사용을 허용 할 수 특정 EV 서명을 정의하기 위해 이상 및 질병 세포로부터 전기차의 특성이다. 특히 종종 종양 자체가 쉽게 액세스하지 않는 암에서 혈액 종양 특이 전기차 타겟팅 액체 생검 치료 반응의 모니터링을 허용하거나 침습적 6 없이도 일차 종양 특성화 도울 것이다. 실제로, 전기 자동차는 이미 성공적으로 소변 7, CSF 8, 모유 (9) 또는 혈액 (10) 등 다양한 체액에서 분리되었다. 몇몇 연구는 다른 인간의 질병에 EV 계수의 변화와 구성을 확인했다. 예를 들어, 패혈증 환자 프로 응집제 조작량의 수이다상당히 건강한 사람 (11)에 비해 증가했다. 또한 심각한 뇌 말라리아 환자에서 혈중 총 조작량의 증가가 관찰 될 수 있고, 혈소판 유래 된 MV의 수는 코마 깊이 감소증 (12)과 상관 관계. 다른 연구는이 심혈 13,14 높은 확률과 상관, 전신성 홍 반성 루푸스 또는 심부전 환자에서, 후자의 경우는 내피 - 유래 소체의 상승 된 수치를보고한다. 특히 암, 혈액의 전기 자동차는 현재 진단 및 예후 가치와 새로운 바이오 마커로 설명합니다. 이러한 MUC1, EGFR 또는 FAK 같은 종양 관련 단백질을 발현하는 MV를의 수준은 유방암 환자 (15, 16)의 혈액에서 증가 할 것으로 보인다. 또한 EXOS를 들어, 최근의 연구는 Glypican-1 초기 질병 드를 허용 유방암 췌장암 또는 델-1과 같은 종양 특이 항원을 운반하는 혈액 유래 EXOS을 보여 주었다높은 특이성과 감도 (17, 18)와 tection. 게다가, 혈청 - 유래 종양 EXOS는 KRAS 및 치료 예측 19의 사용을 제안 p53과 같은 돌연변이의 검출에 사용할 수있는 DNA를 포함 할 수있다. 최근 진보는 특정 마이크로 유체 칩을 사용하여 아교 모세포종 환자의 혈액에서 EXOS의 분석 요법 (20)의 감시를 허용 보여 주었다. 함께 찍은, 이러한 결과는 소포의 질병 별 소집단의 분석은 진단, 예후뿐만 아니라 치료 옵션과 성공에 대한 유용한 정보를 제공하는 것을 의미한다. 그러나, 혈액 EXOS의 분리 및 분석은 시간 소모적이다 특별한 실험 장비를 필요로하기 때문에 아직 일상적인 임상 진단에 적합하지 않다. 대조적으로, 조작량은 EXOS (18)에 필요로 계측법 라텍스 비드에 결합을 할 필요없이 쉽게 흐르지 의해 분석 될 수 있고, 그들의 큰 크기에 훨씬 빨리 격리 될 수21. 따라서, 우리가 혈액 샘플의 조작량의 표준 단리 및 유동 세포 계측법에 의해 MV의 개체군의 후속 특성화에 사용될 수있는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 추가 연구와 일상적인 임상 진단을위한 MVS를 사용하기 위해 필요합니다 큰 환자 그룹의 MV 프로파일의 깊이 특성에 허용됩니다.

<table><tbody><tr><td>butterfly needle (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust pH to 7.6</td></tr><tr><td colspan="4">For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and add 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>use 0.8 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>use 0.1 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD81 antibody</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers for blood collection</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated (30 min, 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuge SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S staining solution</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valve filter Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

작은 엔도 좀 유래 엑소 좀 (EXOS, 직경 &lt;100 ㎚) 및 대형 플라즈마 막 유래 마이크로 소포 (MV를, 직경&gt; 100 ㎚)를 포함하는 세포 외 소포 (전기 자동차)의 방출은 모든 살아있는 세포에서 발생하는 근본적인 세포 과정이다. 원산지 자신의 휴대 및 시험 관내 연구에서 특정이 소포 수송 단백질, 지질 및 핵산은 세포 간 의사 소통의 매개체로 자신의 중요성을 강조했다. 전기차 성공적 다양한 체액으로부터 분리 된 혈액에서 특히 전기차 암 또는 감염성 질병에 대한 생체 유망한 것으로 확인되었다. 혈액 MV의 개체군 연구를 허용하기 위해, 우리는 말초 혈액에서 조작량의 표준 단리 및 특성화를위한 프로토콜을 제시한다. MV를 차동 원심 분리하여 EDTA-항 응고 혈장 샘플에서 펠렛 일반적으로 (100)의 직경을 가지고있다 - 600 nm의. 그들의 더 큰 크기로, 그들은 수쉽게 유동 세포 계측법, 정기적으로 임상 진단에 사용되는 대부분의 실험실에서 사용할 수있는 기술에 의해 연구 될 수있다. 격리 된 MV의 품질 관리 분석을위한 여러 실시 예를 설명한다 혈액 다른 MV 개체군의 판정에 사용할 수있는 마커를 제공한다.

전술 한 프로토콜에 따라 단리 될 수 조작량의 수율을 정량화하기 위해, 우리는 열 도너의 혈액으로부터 분리 된 MV의 양을 계산 하였다. 라 단백질 분석에서 평가 된 MV 수율은 mL의 혈액 당 19.2 μg의 MV를 (표 1)의 평균과 μg의 30까지 10에서였다. 나노 추적 분석 (NTA)에 의해 결정되는 입자의 농도가 1.66 × 109 mL의 플라즈마에서 샘플 당 5.9 × 109 입자 (표 2)의 평균이 2.36 × 106 (10)이었다. 투과 전자 현미경에 의한 MV를의 추가 특성은 지질 이중층에 의해 포위하고있는 세포 소기관 (그림 1A)를 포함하지 않은 직경&gt; 100 nm의와 소포의 인구를 한 것으로 밝혀졌습니다. NTA는 절연 조작량의 크기가 600 나노 미터 (도 1b) 및 MV 평균 크기 100 원거리에서 확인되었다 201나노 미터 (도 1C). 웨스턴 블로 팅에 의한 전형적인 MV 및 출 마커 염색하면 격리 MVS가 tubulin에 양성이었고, EXOS는 튜 불린에 대한 부정적이었고, CD9 및 CD81 (그림 2) 풍부한 동안 만, CD9 및 CD81의 약간의 표현을 보여 주었다 보여 주었다. 유동 세포 계측법 (도 3a)에 의해 격리 된 MV의 분석은 일반적으로 세포 배양 상청액에서 분리 된 MV들에 사용 된 것과 동일한 파라미터를 이용하여 게이팅 될 수있는 정의 소낭 집단을 계시하고는 PBS의 측정에 의해 얻어진 배경 신호로부터 명확히 달랐다 + 1 %의 조작량 (도 3b)을 첨가하지 않은 FCS를 소포 고갈. 혈액 중에 존재하는 다른 MV 개체군을 분석하기 위해, MV들은 예 CD62P 혈소판 유래 MV를 들어, CD45, 백혈구 유래 MV를 들면, CD235a 들어, 다른 혈액 세포 집단 확립 마커 염색적혈구 내피 세포 유래 MV를 (그림 4)에 대한 MV를하고 CD62E을 세포 유래. 이 특성은 MV를 대부분의 모든 샘플에서 혈소판에 의해 흘릴 듯하면서 MV의 개체군의 비율은 조사 기증자의 혈액 샘플 사이에 차이가 있음을 보여 주었다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> 그림 1 : 말초 혈액에서 분리 된 MV의 크기 분포. A, 격리 된 MV는 투과 전자 현미경에 의해 가시화 하였다. B, 소포의 크기 분포를 나타낸 조작량의 대표적인 나노 추적 분석 (NTA). C (10)로부터 독립적으로 제제의 평균 MV 크기 NTA (평균)을 측정 하였다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">알을 보려면 여기를 클릭하십시오</a>이 그림의 arger 버전입니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> 그림 2 : 웨스턴 블로 팅에 의해 고립 된 MV의 특성. 두 기증자로부터 격리 된 MV들과 EXOS에 차등 단백질 발현은 웨스턴 블로 팅에 의해 가시화되었다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> 그림 3 : 유동 세포 계측법에 의해 MV를 분석. A, MV를 먼저 각각의 MV 인구에 게이트에 sidescatter (SSC) 플롯 대 앞으로 (FSC)에 시각화된다. 그 후,이 MV를가 관심의 항원에 의한에 대한 특징<html> 항원에 대해 지시 형광 표지 된 항체를 사용. B, 두 기증자의 혈장에서 분리 MV를위한 SSC 플롯 대 일반적인 FSC. 비교 만 PBS + 1 % 소포 고갈 조작량없이 FCS를 사용하여 세포 배양액뿐 아니라 음성 대조군으로부터 격리 A549 폐암 세포의 종양 세포 유래 MV를위한 전형적인 플롯은 오른쪽에 표시된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> 그림 4 : 유동 세포 계측법에 의해 고립 된 MV의 특성. 세 기증자 MV를 유동 세포 계측법에 의해 설립 된 혈액 세포 마커 (적색)의 발현을 특징으로 하였다. 각각의 아이소 타입 컨트롤은 회색으로 표시됩니다.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> MVS / mL의 혈액 [μg의] </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> #삼 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> 표 1 : 말초 혈액 샘플에서 MV 단백질 수율. </str옹&gt; 표시됨 10 기증자에서 도출 된 mL의 말초 혈액 당 MV를의 양입니다. MV 수익률은 로리의 분석에 의해 정량화 하였다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 견본 </td><td> MVS / ㎖의 혈장 [입자 수] </td></tr><tr><td> #1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> #삼 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> 표 2 : 말초 혈액 샘플에서 MV 입자 항복. </st룽&gt; MV 10 공여자 입자 계수는 나노 추적 분석에 의해 측정 하였다 혈장 샘플로부터 분리 하였다. 세 독립적 인 측정의 평균치가 도시.

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Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.9K 조회수.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

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Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

나노-추적 분석 인 혈에 있는 단일 Extracellular Vesicles의 빠른 형광 기반 특성

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

연구

생화학

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

전사 프로파일링을 위해 세자리 증후군 환자로부터 인간 말초 혈액 단핵 세포 및 CD4+ T 세포 분리

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

암 연구학

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

생체공학

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1 양성 개인의 플라즈마에서 엑소 좀의 분리

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

면역학 및 감염병학

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

의학

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

철분 제한 마이코박테리아에 의해 생성된 세포외 소포의 격리 및 특성화

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

생물학

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

혈장 및 고형 조직에서 추적 가능하고 기능화된 세포외 소포의 분리 및 분석

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

<meta charset="utf8"></head><body>Plasma Extracellular Vesicle Proteome을 사용한 심혈관 바이오마커 연구

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: 심혈관 바이오마커 연구를 위한 혈장 세포외 소포 단백질체 분석 발전

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

심혈관 바이오마커 발견을 위한 혈장 유래 세포외 소포체의 분리, 특성화 및 단백질체 분석

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...