وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مرض كرون والتهاب القولون مؤسسة من أمريكا، (CCFA، 3711) الوقاية من السرطان ومعهد بحوث من ولاية تكساس، مركز UT ساوث ويسترن الطبي (CPRIT RP160169)، ونظرا لMHZ

أجريت جميع التجارب وصفها هنا باستخدام الذكور من النوع البري (C57BL6 / J) الفئران 6-8 أسابيع من العمر الاحتفاظ بها في حر (SPF) منشأة الممرض محددة في مركز الثروة الحيوانية (ARC)، UT جنوب غرب المركز الطبي. تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC)، أو جرت وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC والمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. جمع وإعداد القولون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران مع CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش الفئران مع 70٪ من الإيثانول ويعلقون أطرافه إلى لوحة تعلق الحفاظ على الجانب الظهري الماوس لأسفل على متنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص وملقط قبل تعقيمها تشريح، وجعل شق خط منتصف في الغشاء البريتوني في البطن. فتح البطن عن طريق طي الصفاق بالملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأمعاء من واي تجويف البطنعشر تشريح ملقط ومقص. فصل القولون من الأمعاء الدقيقة عن طريق قطع في الجزء السفلي من الأعور والطرف الآخر في المستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القولون في طبق بتري معقمة تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. مسح محتويات تجويف القولون مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني باستخدام حقنة 20 مل عقد 20 G إبرة أو إبرة أنبوب تغذية عن طريق الفم حتى البراز داخل تجويف القولون هو إزالتها تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القولون مع مقص طوليا. غسل القولون عن طريق هز بقوة في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أنسجة القولون إلى قطع حوالي 1 سم باستخدام مشرط معقم أو المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل وزن القطع القولون. ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع الخطوات في القسم 1 سواء داخل أو خارج خزانة السلامة البيولوجية. مرة واحدة كولون جاهزة للثقافة، يجب تنفيذ جميع الخطوات داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية للحفاظ على عقم. </li></ol> 2. القولون المؤسسةوالثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية (100 ميكرون) على 6 جيدا وحة زراعة الخلايا. نقل جميع القطع القولون التي تم جمعها من فأر واحد في مصفاة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل المتوسطة DMEM / F12 تحتوي على 5٪ FBS، البنسلين، الستربتوميسين (1X)، وجنتاميسين (20 ميكروغرام / مل). تغطي كامل القطع القولون مع وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع مصفاة الخلية، ونضح وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية مرة أخرى على البئر وإضافة 5 مل وسائل الإعلام الجديدة دون أي المضادات الحيوية. رفع مصفاة الخلية، ونضح وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة أعلاه الغسيل (الخطوة 2.5) مرتين أكثر (3X الإجمالي) لإزالة كافة المضادات الحيوية المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل القطع القولون من مصفاة خلية واحدة في بئر واحدة على العقيمة 12-جيدا لوحة الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DMEM المتوسطة / F12 تحتوي على 5٪ FBS (بدون أي المضادات الحيوية). ضبط حجم المتوسط ​​مع weigحزب التحرير من القطع القولون، على سبيل المثال، 1 مل المتوسطة لمدة 100 ملغ من الأنسجة. احتضان لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة حقن 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف الثقافة في أنبوب 1.5 مل العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. فصل طاف في أنبوب 1.5 مل جديد للاستخدام في قتل البكتيريا فحص و / أو غيرها من المقايسات المناعية. طاف يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القطع القولون في أنبوب لعزل الحمض النووي الريبي. </li></ol> 3. كولاي قتل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم كولاي في 5 مل لوريا، Bertani (LB) مرق في أنبوب 15 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها. الحفاظ على الغطاء من أنبوب ثقافة فضفاضة قليلا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في 1200 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه البكتيرية في برنامج تلفزيوني 5 مل الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من جرثومةتعليق يريال إلى كفيت وقياس OD في 600 نانومتر. استخدام برنامج تلفزيوني كما فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب وحدة مستعمرة تشكيل (كفو) باستخدام منحنى معيار محدد سلفا. هنا، افترض أن 1 OD = 2 × 10 9 وت م / مل (تقريبا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق البكتيرية لجعل تعليق الاسهم 1 × 10 5 كفو / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ثقافة طاف القولون الجهاز (500 ميكرولتر / جيد) التي تم جمعها في القسم 2.10 في الآبار مكررة من لوحة الثقافة خلية 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر E. ثقافة القولونية (1000 كفو) في واحدة تحتوي على 500 ميكرولتر جيدا القولون الجهاز طاف الثقافة. مغادرة البعض بشكل جيد دون أي كولاي E. التلقيح للتأكد من أن ثقافة طاف القولون الجهاز لا يحتوي على أي تلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان نفس العدد من البكتيريا (1000 كفو) في وسائل الإعلام الثقافة (DMEM / F12 بالإضافة إلى 5٪ FBS) دون أي المضادات الحيوية كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 50 ميكرولتر من كل عينة انخفاض وايحد ذاته على لوحات أجار ماكونكي. احتضان لوحات ماكونكي أجار عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من المستعمرات وحساب كفو / مل. </li></ol> 4. تأثير خارجي والعوامل الجوهرية في القولون مضادات الميكروبات المضيف الردود الدفاع ملاحظة: فحص قتل مضادات الميكروبات كما هو موضح هنا يمكن اعتمادها لدراسة تأثير العوامل المسببة للأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) والسيتوكينات على النشاط جراثيم من طاف الثقافة الجهاز. يوصف مثال على هذه التجربة باستخدام IL-1β و IL-18 أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع نقطتين من الفئران كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القولون على منشفة ورقية معقمة. قطع القولون طوليا إلى ثلاثة أجزاء باستخدام مقص (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل جزء من القولون في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل جزء من القولون إلى قطع صغيرة وتزن جو معقم و مطهر. نقل قطع من كل جزءمن القولون إلى ثلاثة مصافى خلية منفصلة (100 ميكرون) وضعت على ثلاثة آبار ل6 جيدا وحة زراعة الخلايا (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل DMEM المتوسطة / F12 تحتوي على 5٪ FBS، البنسلين، الستربتوميسين (1X)، وجنتاميسين (20 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة حقن 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل قطع القولون كما هو موضح في 2،4-2،6. ونقل القطع القولون من مصفاة خلية واحدة في بئر واحدة على العقيمة 12-جيدا لوحة الثقافة الخلية. الآبار الثلاثة يحتوي على ثلاثة أجزاء من القولون من ماوس واحدة يجب أن توصف بأنها غير المعالجة، IL-1β، وIL-18 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DMEM المتوسطة / F12 تحتوي على 5٪ FBS (بدون أي المضادات الحيوية). ضبط حجم المتوسطة مع وزن القطع القولون، على سبيل المثال، 1 مل المتوسطة لمدة 100 ملغ من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز الجهاز ثقافة القولون مع IL-1β (20 نانوغرام / مل) أو IL-18 (20 نانوغرام / مل) لمدة 12 ساعة. القولون غير المعالجة<html> تخدم الثقافة الجهاز عن السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 12 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة حقن 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية، وجمع طاف الثقافة في العقيمة 1.5 مل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 500 ميكرولتر ثقافة طاف في الآبار مكررة من 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم كولاي (1000 كفو) في القولون الجهاز طاف الثقافة كما هو موضح في القسم 3. للحصول على كل حالة، تطعيم كولاي في بئر واحدة. سوف تحتوي على البعض جيدا نفس الجهاز ثقافة طاف دون كولاي بمثابة الرقابة على التلوث الجرثومي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان نفس كمية البكتيريا في وسائل الإعلام ثقافة دون أي المضادات الحيوية كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 50 ميكرولتر من كل عينة قطرة من الحكمة على لوحات ماكونكي أجار. احتضان لوحات ماكونكي أجار ليلا 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من المستعمرات وحساب كفو / مل (الشكل 4). </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. قياس التعبير عن الجينات مضادات الميكروبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها (12 ساعة) من الثقافة الجهاز القولون كما هو موضح في أقسام 2 و 4، وغسل قطع القولون مع 2 مل الجليد الباردة PBS (2X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القطع القولون إلى 2 مل ريبونوكلياز / الدناز أنبوب الحرة المسمار الحد الأقصى. وضع أنابيب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل كاشف Trizol التجاري والناشر حبات مصفوفة داخل الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المحللة الأنسجة في أنبوب microcentrifuge جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول قياسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع RNA بشكل مناسب مع الماء منزوع الأيونات واستخدام 500 نانوغرام الحمض النووي الريبي لتجميع كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كدنا] في الوقت الحقيقي تحليل RT-PCR من الجينات المستهدفة المضادة للميكروبات، السيتوكينات، كيموكينات، وغيرها من الجينات في المصالح. </li></ol>

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

الخلايا الظهارية في الأمعاء حساسة جدا من حيث متطلبات نموها وبالتالي يصعب الثقافة. الخلايا الظهارية المعزولة عن طريق العلاج EDTA لا البقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التقليدية مثل DMEM 8. لذلك، ودراسات التفاعل المضيف الممرض باستخدام سرداب ?...

يمثل الأمعاء نظام ديناميكي يعمل كحاجز للالكائنات الدقيقة المتعايشة، وتحارب ضد مسببات الأمراض الغازية، وينظم تكوينه الميكروبي 1. الخلايا الظهارية في الأمعاء، ويتألف من المعوية والخلايا الكأسية، والخلايا بانيت والخلايا enteroendocrine، هي سكان الخلية الرئيسية التي توفر الردود دفاع المضيف ضد الجراثيم المعوية. الخلايا الكأسية تنتج mucins أن إنشاء منطقة منزوعة السلاح على الجزء العلوي من طبقة الطلائية 2. الخلايا بانيت والمعوية تنتج الببتيدات المضادة للميكروبات، السيتوكينات، والأكسجين والنيتروجين الأنواع المتفاعلة التي تشكل الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات والمساهمة في تشكيل وتكوين الجراثيم المعوية 3 و 4. بالإضافة إلى الخلايا الظهارية، والخلايا المناعية بما في ذلك الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا القاتلة الطبيعية، الخلايا الليمفاوية، واينا<html> الخلايا اللمفاوية الشركة المصرية للاتصالات في الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية تلعب دورا حاسما في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية من خلال إنتاج السيتوكينات، كيموكينات، وغيرها من الوسطاء 5-7. من أجل فهم كيف يمكن لنظام المناعة المخاطية ينظم الجراثيم ويوفر الحماية ضد العدوى الميكروبية، فمن المهم النظر في التفاعل المعقد للسكان الخلية غير متجانسة من القناة الهضمية. ومع ذلك، وهو نموذج في المختبر الذي يشمل جميع الميزات الموجودة في الأمعاء غير متوفر. لذلك، والدراسات الجزيئية على تفاعل المضيف الممرض في الأمعاء تشكل تحديا للغاية. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم تطوير عدة أنظمة نموذج التي تحاكي جوانب الغشاء المخاطي في الأمعاء عن التحقيق في العمليات الفيزيولوجية المرضية تشارك في الأمراض الالتهابية الأمعاء (IBD) وغيرها من اضطرابات الجهاز الهضمي 8 -= &quot;XREF&quot;&gt; 14. وغالبا ما تستخدم خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء خلد لدراسة الخلايا الظهارية استجابات محددة. ومع ذلك، لأن التعبير الجيني التفاضلية وظيفة في الخلايا خلد، حصلت على البيانات من استخدام هذه الخلايا غالبا ما لا تتطابق مع تلك التي لوحظت في الدراسات المجراة. سرداب الأمعاء عضي الثقافة برزت مؤخرا كأداة محتملة لتقييم استجابة ظهارة الأمعاء لمختلف المحفزات 13. في هذا النظام، ويسمح للخلايا الجذعية سرداب في النمو وتطوير هيكل عضوي الشكل 3D. في حين أن نظام الثقافة عضوي الشكل هو مفيد جدا لدراسة جوانب كثيرة من ظهارة الأمعاء، فإنه لا تحاكي التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والخلايا الظهارية والمنتجات الميكروبية. ثقافة فيفو السابقين من الأنسجة المعوية تقدم تمثيل أفضل للفي الجسم الحي الردود دفاع المضيف. في هذه الطريقة، وهي جزء من الأمعاء هو مثقف في لوحة الثقافة خلية خفة دمح وسائل الإعلام المناسبة السماح للأنواع المختلفة من السكان الخلية في الأمعاء وتكون نشطة عملية الأيض لمدة 48 ساعة على الأقل. وبالتالي، ثقافة فيفو السابقين من الجهاز يمكن استخدامها لقياس التعبير عن الجينات المضادة للميكروبات والردود دفاع المضيف من الأمعاء لحافز معين. وكان المحققون باستخدام نظام الجهاز ثقافة فيفو السابقين لدراسة الردود دفاع المضيف ضد العدوى الميكروبية في الأمعاء 15-21. اعتمدنا مؤخرا نظام الثقافة الجهاز لدراسة دور inflammasome في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في كولون الماوس 22. وinflammasome هي عبارة عن منصة الجزيئية لتفعيل كاسباس 1، وهو مطلوب لإنتاج نضجت IL-1β و IL-18. أظهرنا أن IL-1β و IL-18 حمل الببتيدات المضادة للميكروبات التي تقتل بشكل فعال pathobionts المتعايشة مثل كولاي </em&gt;. وكانت هذه الملاحظة بما يتفق مع زيادة عبء كولاي في كولون الماوس inflammasome معيب 22. هذا النظام وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة دور مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) وغيرها من الجزيئات المناعية الفطرية في ردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية وكذلك التسبب في اضطرابات الأمعاء مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطان القولون والمستقيم (CRC). هناك أكثر من 200 الجينات IBD قابلية، والطفرات في كثير من هذه الجينات ترتبط مع تكوين الجراثيم تغير في القناة الهضمية. ومن الأهمية السريرية كبيرة لتحديد الآلية الدقيقة التي من خلالها الجينات IBD-القابلية تنظم الجراثيم القناة الهضمية. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة لإدخال البروتوكول الأساسي من خارج الحي الثقافة الجهاز القولون وإظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدام الثقافة لدراسة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في الأمعاء.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/ F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &#38; Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-1b recombinan</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP10749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IL-18 recombinant</td>
			<td>Reprokine</td>
			<td>RKP70380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Luria-Bertani Broth&#160;</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>244620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD&#160;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0075-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Uded to measure RNA concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis Spectrophotometer</td>
			<td>BECKMAN</td>
			<td>DU 530</td>
			<td>Used to determine E. coli count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1725125&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing Matrix S (1/8&#34;), 2 mL Tube</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116925500</td>
			<td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastPrep-24 5G System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>116005500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 Petri Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate 6well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>5085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 micron cell strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>5698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall ST40R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific orbital shaker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

يعرض الأمعاء بنية هياكل سرداب المتكررة التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية، propia الصفيحة التي تحتوي على الخلايا المناعية، وسدى. كل من هذه الخلايا غير متجانسة تساهم في التوازن المعوي والمشاركة في دفاع المضيف مضادات الميكروبات. لذلك، وتحديد نموذج بديل لدراسة الاستجابة المناعية والنشاط المضادة للميكروبات الأمعاء في الإعداد في المختبر هي صعبة للغاية. في الدراسات المختبرية باستخدام خلد خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء أو سرداب حتى الابتدائي عضي الثقافة لا تمثل علم وظائف الأعضاء الدقيق الأمعاء الطبيعي والمكروية لها. هنا، نحن نناقش طريقة لزراعة الأنسجة الماوس القولون في طبق ثقافة، وكيف يمكن تنفيذ هذا المجراة سابقا نظام الجهاز ثقافة في الدراسات المتعلقة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات. في التجارب التمثيلية، أظهرنا أن كولون في الثقافة الجهاز تعبر عن الببتيدات المضادة للميكروبات في التنonse إلى دخيلة IL-1β و IL-18. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات المستجيب المضادة للميكروبات التي تنتجها الأنسجة القولون في الثقافة الجهاز تقتل بكفاءة القولونية في المختبر. هذا النهج، وبالتالي، يمكن استخدامها لتشريح دور أنماط الجزيئية pathogen- ويرتبط خطر والمستقبلات الخلوية في تنظيم المعوية الاستجابات المناعية الفطرية والاستجابات دفاع المضيف مضادات الميكروبات.

وأظهرت صورة تمثيلية لكولون في الثقافة الجهاز في الشكل 1. لا تزال القطع القولون في الثقافة عملية الأيض والنشطة من الناحية الفسيولوجية. أنها تستجيب بكفاءة للمؤثرات الخارجية إضافة إلى وسائل الإعلام والثقافة. وتدفق العمل التخطيطي للإعداد للأ?...

Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; القولون ثقافة الجهاز واستخدامه في الدراسات الدفاعية المضيف مضادات الميكروبات

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

13.9K Views.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

Video: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most common forms of disease are visceral leishmaniasis (VL) and cutaneous leishmaniasis (CL). Mouse models of leishmaniasis are widely used, but quantification of parasite burdens during murine disease requires mice to be euthanized at various times after infection. Parasite loads are then measured either by microscopy, limiting dilution assay, or qPCR amplification of parasite DNA. The in vivo imaging system (IVIS) has an integrated software package that allows the detection of a bioluminescent signal associated with cells in living organisms. Both to minimize animal usage and to follow infection longitudinally in individuals, in vivo models for imaging Leishmania spp. causing VL or CL were established. Parasites were engineered to express luciferase, and these were introduced into mice either intradermally or intravenously. Quantitative measurements of the luciferase driving bioluminescence of the transgenic Leishmania parasites within the mouse were made using IVIS. Individual mice can be imaged multiple times during longitudinal studies, allowing us to assess the inter-animal variation in the initial experimental parasite inocula, and to assess the multiplication of parasites in mouse tissues. Parasites are detected with high sensitivity in cutaneous locations. Although it is very likely that the signal (photons/second/parasite) is lower in deeper visceral organs than the skin, but quantitative comparisons of signals in superficial versus deep sites have not been done. It is possible that parasite numbers between body sites cannot be directly compared, although parasite loads in the same tissues can be compared between mice. Examples of one visceralizing species (L. infantum chagasi) and one species causing cutaneous leishmaniasis (L. mexicana) are shown. The IVIS procedure can be used for monitoring and analyzing small animal models of a wide variety of Leishmania species causing the different forms of human leishmaniasis.

In vivo Imaging of Transgenic Leishmania Parasites in a Live Host

An in vivo imaging system is used to generate quantitative measurements of murine infection with the Trypanosomatid protozoan Leishmania. This is a non-invasive and non-lethal method for detecting parasites expressing luciferase within many tissues throughout the course of chronic Leishmania spp. infection.

في الجسم الحي التصوير الطفيليات الليشمانية المعدلة وراثيا في مضيف لايف

Distinct species of Leishmania, a protozoan parasite of the family Trypanosomatidae, typically cause different human disease manifestations. The most ...

Use of the EpiAirway Model for Characterizing Long-term Host-pathogen Interactions

Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory mucosa 1; 2. To study the mechanisms by which these organisms survive on and inside respiratory tissues, a model in which successful long-term co-culture of bacteria and human cells can be performed is required. We use primary human respiratory epithelial tissues raised to the air-liquid interface, the EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). These are non-immortalized, well-differentiated, 3-dimensional tissues that contain tight junctions, ciliated and nonciliated cells, goblet cells that produce mucin, and retain the ability to produce cytokines in response to infection. 
This biologically relevant in vitro model of the human upper airway can be used in a number of ways; the overall goal of this method is to perform long-term co-culture of EpiAirway tissues with NTHi and quantitate cell-associated and internalized bacteria over time. As well, mucin production and the cytokine profile of the infected co-cultures can be determined. This approach improves upon existing methods in that many current protocols use submerged monolayer or Transwell cultures of human cells, which are not capable of supporting bacterial infections over extended periods3. For example, if an organism can replicate in the overlying media, this can result in unacceptable levels of cytotoxicity and loss of host cells, arresting the experiment. The EpiAirway model allows characterization of long-term host-pathogen interactions. Further, since the source for the EpiAirway is normal human tracheo-bronchial cells rather than an immortalized line, each is an excellent representation of actual human upper respiratory tract tissue, both in structure and in function4.
For this method, the EpiAirway tissues are weaned off of anti-microbial and anti-fungal compounds for 2 days prior to delivery, and all procedures are performed under antibiotic-free conditions. This necessitates special considerations, since both bacteria and primary human tissues are used in the same biosafety cabinet, and are co-cultured for extended periods.

This method allows characterization of extended bacterial co-culture with EpiAirways, primary human respiratory epithelial tissue grown at the air-liquid interface, a biologically relevant in vitro model. The approach can be used with any microbe that is amenable to long-term co-culture.

استخدام نموذج لوصف EpiAirway طويل الأجل المضيف الممرض التفاعلات

Nontypeable Haemophilus influenzae  (NTHi) are human-adapted Gram-negative bacteria that can cause recurrent and chronic infections of the respiratory ...

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the analysis of immune mediators in fluid eluates for the study of the airway topical immune signature, without the need for stimulation procedures (often used by other techniques). The mucosal lining fluid is sampled on a strip of filter paper placed at the anterior part of the inferior turbinate and left for 2 min of absorption. Analytes are eluted from the filter papers, and the extracted protein-based eluates are analyzed by an electrochemiluminescence-based immunoassay, allowing for the high-sensitivity quantification of low- and high-level analytes in the same sample. We measured the in vivo levels of 20 preselected immune mediators related to specific immune signaling pathways in the upper airway mucosa, but the technique is not limited to that specific panel or sampling site. The technique was first implemented in 7-year-old children from the Copenhagen Prospective Studies on Asthma in Childhood2000 (COPSAC2000) cohort with allergic rhinitis. It was thereafter used in the longitudinal COPSAC2010 birth cohort, sampled at 1 month, 2 years, and 6 years of age and at instances of acute respiratory symptoms. We successfully obtained and analyzed samples from 620 (89%) of 700 1-month-old children; a few samples were below the assay detection limit (reported as the median (Inter-Quartile Range (IQR)). The number of samples below the detection limit (i.e.&#160;from 0 to the set point for the lower limit of detection) for each mediator was 29 (7.25 - 119.5). This technique enables the quantification of the in vivo airway mucosal immune profile from birth, can be applied longitudinally, and can be applied to studies on the effect of genetics and early-life environmental exposures, pathophysiology, endotyping, and monitoring of respiratory diseases, and development and evaluation of novel therapeutics.

Noninvasive Sampling of Mucosal Lining Fluid for the Quantification of In Vivo Upper Airway Immune-mediator Levels

This protocol describes a noninvasive technique for the sampling of undisturbed mucosal lining fluid from the upper airways. It can be used to perform the quantification of in vivo levels of protein mediators, such as cytokines and chemokines, in subjects of all ages.

موسع لأخذ العينات من السوائل البطانة المخاطية للتحديد الكمي للمناعة-الوسيط في فيفو مجرى الهواء العلوي في مستويات

This protocol describes noninvasive sampling of undisturbed upper airway mucosal lining fluid. It also details the extraction procedure used prior to the ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, mortality, and immunosuppression in infected birds. In this study, we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with IBDV, and the quantification of viral replication. The addition of chicken CD40 ligand significantly increased cell proliferation fourfold over six days of culture and significantly enhanced cell viability. Two strains of IBDV, a cell-culture adapted strain, D78, and a very virulent strain, UK661, replicated well in the ex vivo cell cultures. This model will be of use in determining how cells respond to IBDV infection and will permit a reduction in the number of infected birds used in IBDV pathogenesis studies. The model can also be expanded to include other viruses and could be applied to different species of birds.

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Here we describe the isolation of chicken primary bursal cells from the bursa of Fabricius, the culture and infection of the cells with infectious bursal disease virus, and the quantification of viral replication.

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Optimization of the Cuff Technique for Murine Heart Transplantation

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to improve surgical efficiency. In our lab, we have optimized the cuff technique with two major steps. First, we used the inner tube technique to insert a temporary inner tube into the external jugular vein and carotid artery blood vessel to facilitate eversion of the vessel over the cuff. Second, we performed complete heterotopic cardiac transplantation through the collaboration of two experienced surgeons. These modifications effectively reduced the operation time to 25 minutes, with a success rate of 95%. In this report, we describe these procedures in detail and provide a supplemental video. We believe that this report on the improved cuff technique will offer practical guidance for murine heterotopic heart transplantation and will enhance the utility of this mouse model for basic research.

We introduce an inner tube approach to the cuff technique for mouse cervical heterotopic heart transplantation to help evert the vessel over the cuff. We found that cooperation between two experienced surgeons markedly shortens the operation time.

تحسين تقنية الكفة لزراعة القلب مورين

Murine cardiac transplantation has been performed for more than 40 years. With advancements in microsurgery, certain new techniques have been used to ...

Establishing a Porcine Ex Vivo Cornea Model for Studying Drug Treatments against Bacterial Keratitis

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to animal infections in vivo. The existing in vitro tests typically overestimate antimicrobial efficacy as the presence of host tissue as a diffusion barrier is not accounted for. To overcome this bottleneck, we have developed an ex vivo porcine corneal model of bacterial keratitis using Pseudomonas aeruginosa as a prototypic organism. This article describes the preparation of the porcine cornea and protocol for establishment of the infection. Bespoke glass molds enable straightforward setup of the cornea for infection studies. The model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue. Establishment of infection is verified as an increase in the number of colony forming units assessed via viable plate counts. The results demonstrate that infection can be established in a highly reproducible fashion in the ex vivo corneas using the method described here. The model can be extended in the future to mimic keratitis caused by microorganisms other than P. aeruginosa. The ultimate aim of the model is to investigate the effect of antimicrobial chemotherapy on the progress of bacterial infection in a scenario more representative of in vivo infections. In so doing, the model described here will reduce the use of animals for testing, improve success rates in clinical trials and ultimately enable rapid translation of novel antimicrobials to the clinic.

This article describes a step-by-step protocol to set up an ex vivo porcine model of bacterial keratitis. Pseudomonas aeruginosa is used as a prototypic organism. This innovative model mimics in vivo infection as bacterial proliferation is dependent on the ability of the bacterium to damage corneal tissue.

إنشاء نموذج بورسين السابقين فيفو القرنية لدراسة العلاجات الدوائية ضد التهاب القرنية البكتيرية

When developing novel antimicrobials, the success of animal trials is dependent on accurate extrapolation of antimicrobial efficacy from in vitro tests to ...

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important role in the dissemination and pathogenesis of this opportunistic fungal pathogen. However, methods to visualize fungal hyphae in the GI tract in vivo are challenging which limits the understanding of environmental signals in controlling this morphogenesis process. The protocol described here demonstrates a novel ex vivo method for visualization of hyphal morphogenesis in gut homogenate extracts. Using an ex vivo assay, this study demonstrates that cecal contents from antibiotic treated mice, but not from untreated control mice, promote C. albicans hyphal morphogenesis in the gut content. Further, adding back specific groups of gut metabolites to the cecal contents from antibiotic-treated mice differentially regulates hyphal morphogenesis ex vivo. Taken together, this protocol represents a novel method to identify and investigate the environmental signals that control C. albicans hyphal morphogenesis in the GI tract.

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

The ex vivo assay described in this study using gut homogenate extracts and immunofluorescence staining represents a novel method to examine the hyphal morphogenesis of Candida albicans in the GI tract. This method can be utilized to investigate the environmental signals regulating morphogenetic transition in the gut.

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a poor correlation between antibiotic susceptibility testing (AST) results using standard diagnostic methods (e.g., broth microdilution, disk diffusion, or Etest) and clinical outcomes after antibiotic treatment. Attempts to improve AST by the use of off-the-shelf biofilm growth platforms show little improvement in results. The limited ability of in vitro biofilm systems to mimic the physicochemical environment of the CF lung and, therefore bacterial physiology and biofilm architecture, also acts as a brake on the discovery of novel therapies for CF infection. Here, we present a protocol to perform AST of CF pathogens grown as mature, in vivo-like biofilms in an ex vivo CF lung model comprised of pig bronchiolar tissue and synthetic CF sputum (ex vivo&#160;pig lung, EVPL).
Several in vitro&#160;assays exist for biofilm susceptibility testing, using either standard laboratory medium or various formulations of synthetic CF sputum in microtiter plates. Both growth medium and biofilm substrate (polystyrene plate vs. bronchiolar tissue) are likely to affect biofilm antibiotic tolerance. We show enhanced tolerance of clinical Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus isolates in the ex vivo model; the effects of antibiotic treatment of biofilms is not correlated with the minimum inhibitory concentration (MIC) in standard microdilution assays or a sensitive/resistant classification in disk diffusion assays.
The ex vivo platform could be used for bespoke biofilm AST of patient samples and as an enhanced testing platform for potential antibiofilm agents during pharmaceutical research and development. Improving the prescription or acceleration of antibiofilm drug discovery through the use of more in vivo-like testing platforms could drastically improve health outcomes for individuals with CF, as well as reduce the costs of clinical treatment and discovery research.

Antibiotic Efficacy Testing in an Ex vivo Model of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Biofilms in the Cystic Fibrosis Lung

This workflow can be used to perform antibiotic susceptibility testing using an established&#160;ex vivo model of bacterial biofilm in the lungs of individuals with cystic fibrosis. Use of this model could enhance the clinical validity of MBEC (minimal biofilm eradication concentration) assays.

اختبار فعالية المضادات الحيوية في نموذج الجسم الحي السابق من Pseudomonas aeruginosa والمكورات العنقودية أوريوس بيو فيلمز في الرئة التليف الكيسي

The effective prescription of antibiotics for the bacterial biofilms present within the lungs of individuals with cystic fibrosis (CF) is limited by a ...