Name: the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies
Uploaded: 2017-02-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مرض كرون والتهاب القولون مؤسسة من أمريكا، (CCFA، 3711) الوقاية من السرطان ومعهد بحوث من ولاية تكساس، مركز UT ساوث ويسترن الطبي (CPRIT RP160169)، ونظرا لMHZ

أجريت جميع التجارب وصفها هنا باستخدام الذكور من النوع البري (C57BL6 / J) الفئران 6-8 أسابيع من العمر الاحتفاظ بها في حر (SPF) منشأة الممرض محددة في مركز الثروة الحيوانية (ARC)، UT جنوب غرب المركز الطبي. تمت الموافقة على جميع الدراسات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC)، أو جرت وفقا للمبادئ التوجيهية IACUC والمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1. جمع وإعداد القولون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الفئران مع CO 2 الخنق تليها خلع عنق الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رش الفئران مع 70٪ من الإيثانول ويعلقون أطرافه إلى لوحة تعلق الحفاظ على الجانب الظهري الماوس لأسفل على متنها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص وملقط قبل تعقيمها تشريح، وجعل شق خط منتصف في الغشاء البريتوني في البطن. فتح البطن عن طريق طي الصفاق بالملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأمعاء من واي تجويف البطنعشر تشريح ملقط ومقص. فصل القولون من الأمعاء الدقيقة عن طريق قطع في الجزء السفلي من الأعور والطرف الآخر في المستقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القولون في طبق بتري معقمة تحتوي على الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. مسح محتويات تجويف القولون مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني باستخدام حقنة 20 مل عقد 20 G إبرة أو إبرة أنبوب تغذية عن طريق الفم حتى البراز داخل تجويف القولون هو إزالتها تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع القولون مع مقص طوليا. غسل القولون عن طريق هز بقوة في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في طبق بتري معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع أنسجة القولون إلى قطع حوالي 1 سم باستخدام مشرط معقم أو المقص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سجل وزن القطع القولون. ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع الخطوات في القسم 1 سواء داخل أو خارج خزانة السلامة البيولوجية. مرة واحدة كولون جاهزة للثقافة، يجب تنفيذ جميع الخطوات داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية للحفاظ على عقم. </li></ol> 2. القولون المؤسسةوالثقافة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية (100 ميكرون) على 6 جيدا وحة زراعة الخلايا. نقل جميع القطع القولون التي تم جمعها من فأر واحد في مصفاة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل المتوسطة DMEM / F12 تحتوي على 5٪ FBS، البنسلين، الستربتوميسين (1X)، وجنتاميسين (20 ميكروغرام / مل). تغطي كامل القطع القولون مع وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية في حاضنة مع 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رفع مصفاة الخلية، ونضح وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مصفاة الخلية مرة أخرى على البئر وإضافة 5 مل وسائل الإعلام الجديدة دون أي المضادات الحيوية. رفع مصفاة الخلية، ونضح وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة أعلاه الغسيل (الخطوة 2.5) مرتين أكثر (3X الإجمالي) لإزالة كافة المضادات الحيوية المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ونقل القطع القولون من مصفاة خلية واحدة في بئر واحدة على العقيمة 12-جيدا لوحة الثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DMEM المتوسطة / F12 تحتوي على 5٪ FBS (بدون أي المضادات الحيوية). ضبط حجم المتوسط ​​مع weigحزب التحرير من القطع القولون، على سبيل المثال، 1 مل المتوسطة لمدة 100 ملغ من الأنسجة. احتضان لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة حقن 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع طاف الثقافة في أنبوب 1.5 مل العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 12000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. فصل طاف في أنبوب 1.5 مل جديد للاستخدام في قتل البكتيريا فحص و / أو غيرها من المقايسات المناعية. طاف يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية حتى الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القطع القولون في أنبوب لعزل الحمض النووي الريبي. </li></ol> 3. كولاي قتل الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم كولاي في 5 مل لوريا، Bertani (LB) مرق في أنبوب 15 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها. الحفاظ على الغطاء من أنبوب ثقافة فضفاضة قليلا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنبوب الطرد المركزي ثقافة البكتيرية في 1200 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف و resuspend بيليه البكتيرية في برنامج تلفزيوني 5 مل الجليد الباردة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 1 مل من جرثومةتعليق يريال إلى كفيت وقياس OD في 600 نانومتر. استخدام برنامج تلفزيوني كما فارغة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب وحدة مستعمرة تشكيل (كفو) باستخدام منحنى معيار محدد سلفا. هنا، افترض أن 1 OD = 2 × 10 9 وت م / مل (تقريبا). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع تعليق البكتيرية لجعل تعليق الاسهم 1 × 10 5 كفو / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ثقافة طاف القولون الجهاز (500 ميكرولتر / جيد) التي تم جمعها في القسم 2.10 في الآبار مكررة من لوحة الثقافة خلية 24 أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر E. ثقافة القولونية (1000 كفو) في واحدة تحتوي على 500 ميكرولتر جيدا القولون الجهاز طاف الثقافة. مغادرة البعض بشكل جيد دون أي كولاي E. التلقيح للتأكد من أن ثقافة طاف القولون الجهاز لا يحتوي على أي تلوث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان نفس العدد من البكتيريا (1000 كفو) في وسائل الإعلام الثقافة (DMEM / F12 بالإضافة إلى 5٪ FBS) دون أي المضادات الحيوية كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 50 ميكرولتر من كل عينة انخفاض وايحد ذاته على لوحات أجار ماكونكي. احتضان لوحات ماكونكي أجار عند 37 درجة مئوية خلال الليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من المستعمرات وحساب كفو / مل. </li></ol> 4. تأثير خارجي والعوامل الجوهرية في القولون مضادات الميكروبات المضيف الردود الدفاع ملاحظة: فحص قتل مضادات الميكروبات كما هو موضح هنا يمكن اعتمادها لدراسة تأثير العوامل المسببة للأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMPs) والسيتوكينات على النشاط جراثيم من طاف الثقافة الجهاز. يوصف مثال على هذه التجربة باستخدام IL-1β و IL-18 أدناه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع نقطتين من الفئران كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع القولون على منشفة ورقية معقمة. قطع القولون طوليا إلى ثلاثة أجزاء باستخدام مقص (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل كل جزء من القولون في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني كما هو موضح في القسم 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل جزء من القولون إلى قطع صغيرة وتزن جو معقم و مطهر. نقل قطع من كل جزءمن القولون إلى ثلاثة مصافى خلية منفصلة (100 ميكرون) وضعت على ثلاثة آبار ل6 جيدا وحة زراعة الخلايا (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل DMEM المتوسطة / F12 تحتوي على 5٪ FBS، البنسلين، الستربتوميسين (1X)، وجنتاميسين (20 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة حقن 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل قطع القولون كما هو موضح في 2،4-2،6. ونقل القطع القولون من مصفاة خلية واحدة في بئر واحدة على العقيمة 12-جيدا لوحة الثقافة الخلية. الآبار الثلاثة يحتوي على ثلاثة أجزاء من القولون من ماوس واحدة يجب أن توصف بأنها غير المعالجة، IL-1β، وIL-18 (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة DMEM المتوسطة / F12 تحتوي على 5٪ FBS (بدون أي المضادات الحيوية). ضبط حجم المتوسطة مع وزن القطع القولون، على سبيل المثال، 1 مل المتوسطة لمدة 100 ملغ من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحفيز الجهاز ثقافة القولون مع IL-1β (20 نانوغرام / مل) أو IL-18 (20 نانوغرام / مل) لمدة 12 ساعة. القولون غير المعالجة<html> تخدم الثقافة الجهاز عن السيطرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 12 ساعة حضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة حقن 5٪ CO 2 و 95٪ الجوية، وجمع طاف الثقافة في العقيمة 1.5 مل أنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل 500 ميكرولتر ثقافة طاف في الآبار مكررة من 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم كولاي (1000 كفو) في القولون الجهاز طاف الثقافة كما هو موضح في القسم 3. للحصول على كل حالة، تطعيم كولاي في بئر واحدة. سوف تحتوي على البعض جيدا نفس الجهاز ثقافة طاف دون كولاي بمثابة الرقابة على التلوث الجرثومي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان نفس كمية البكتيريا في وسائل الإعلام ثقافة دون أي المضادات الحيوية كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 50 ميكرولتر من كل عينة قطرة من الحكمة على لوحات ماكونكي أجار. احتضان لوحات ماكونكي أجار ليلا 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد من المستعمرات وحساب كفو / مل (الشكل 4). </li></ol>e_title &quot;&gt; 5. قياس التعبير عن الجينات مضادات الميكروبات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها (12 ساعة) من الثقافة الجهاز القولون كما هو موضح في أقسام 2 و 4، وغسل قطع القولون مع 2 مل الجليد الباردة PBS (2X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع القطع القولون إلى 2 مل ريبونوكلياز / الدناز أنبوب الحرة المسمار الحد الأقصى. وضع أنابيب على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل كاشف Trizol التجاري والناشر حبات مصفوفة داخل الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة الآلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المحللة الأنسجة في أنبوب microcentrifuge جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي باستخدام بروتوكول قياسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع RNA بشكل مناسب مع الماء منزوع الأيونات واستخدام 500 نانوغرام الحمض النووي الريبي لتجميع كدنا]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام كدنا] في الوقت الحقيقي تحليل RT-PCR من الجينات المستهدفة المضادة للميكروبات، السيتوكينات، كيموكينات، وغيرها من الجينات في المصالح. </li></ol>

<ol>
	<li>Maloy, K. J., Powrie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+homeostasis+and+its+breakdown+in+inflammatory+bowel+disease.">Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease.</a> Nature. 474, 298-306 (2011).</li><li>Hooper, L. V., Macpherson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+adaptations+that+maintain+homeostasis+with+the+intestinal+microbiota.">Immune adaptations that maintain homeostasis with the intestinal microbiota.</a> Nat Rev Immunol. 10, 159-169 (2010).</li><li>Vaishnava, S., Behrendt, C. L., Ismail, A. S., Eckmann, L., Hooper, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+directly+sense+gut+commensals+and+maintain+homeostasis+at+the+intestinal+host-microbial+interface.">Paneth cells directly sense gut commensals and maintain homeostasis at the intestinal host-microbial interface.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 20858-20863 (2008).</li><li>Kamada, N., Chen, G. Y., Inohara, N., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+pathogens+and+pathobionts+by+the+gut+microbiota.">Control of pathogens and pathobionts by the gut microbiota.</a> Nat Immunol. 14, 685-690 (2013).</li><li>Wu, H. J., Wu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+gut+microbiota+in+immune+homeostasis+and+autoimmunity.">The role of gut microbiota in immune homeostasis and autoimmunity.</a> Gut Microbes. 3, 4-14 (2012).</li><li>Zimmerman, N. P., Vongsa, R. A., Wendt, M. K., Dwinell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors+in+mucosal+homeostasis+at+the+intestinal+epithelial+barrier+in+inflammatory+bowel+disease.">Chemokines and chemokine receptors in mucosal homeostasis at the intestinal epithelial barrier in inflammatory bowel disease.</a> Inflamm Bowel Dis. 14, 1000-1011 (2008).</li><li>Elliott, D. E., Siddique, S. S., Weinstock, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+in+disease.">Innate immunity in disease.</a> Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 749-755 (2014).</li><li>Chopra, D. P., Dombkowski, A. A., Stemmer, P. M., Parker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+epithelial+cells+in+vitro.">Intestinal epithelial cells in vitro.</a> Stem Cells Dev. 19, 131-142 (2010).</li><li>Autrup, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explant+culture+of+human+colon.">Explant culture of human colon.</a> Methods Cell Biol. 21, 385-401 (1980).</li><li>Qin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+gut+microbial+gene+catalogue+established+by+metagenomic+sequencing.">A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing.</a> Nature. 464, 59-65 (2010).</li><li>Wildenberg, M. E., vanden Brink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+advance+in+ex+vivo+intestinal+organ+culture.">A major advance in ex vivo intestinal organ culture.</a> Gut. 61, 961-962 (2012).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. 63, 1345-1354 (2014).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li><li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease:+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model.">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. 61, 1007-1015 (2012).</li><li>Haque, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+interactions+of+Salmonella+enterica+serovar+typhimurium+with+human+small+intestinal+epithelial+explants.">Early interactions of Salmonella enterica serovar typhimurium with human small intestinal epithelial explants.</a> Gut. 53, 1424-1430 (2004).</li><li>Hicks, S., Candy, D. C., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+enteroaggregative+Escherichia+coli+to+pediatric+intestinal+mucosa+in+vitro.">Adhesion of enteroaggregative Escherichia coli to pediatric intestinal mucosa in vitro.</a> Infect Immun. 64, 4751-4760 (1996).</li><li>Knutton, S., Lloyd, D. R., Candy, D. C., McNeish, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+adhesion+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli+to+human+intestinal+epithelial+cells+from+mucosal+biopsies.">In vitro adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli to human intestinal epithelial cells from mucosal biopsies.</a> Infect Immun. 44, 514-518 (1984).</li><li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture.">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J Anat. 134, 459-469 (1982).</li><li>Smollett, K., Shaw, R. K., Garmendia, J., Knutton, S., Frankel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+distribution+of+EspG2,+a+type+III+secretion+system+effector+of+enteropathogenic+Escherichia+coli.">Function and distribution of EspG2, a type III secretion system effector of enteropathogenic Escherichia coli.</a> Microbes Infect. 8, 2220-2227 (2006).</li><li>Bareiss, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+tissue+cultures+from+adult+murine+colon+as+an+in+vitro+model+of+intestinal+mucosa.">Organotypical tissue cultures from adult murine colon as an in vitro model of intestinal mucosa.</a> Histochem Cell Biol. 129, 795-804 (2008).</li><li>Tsilingiri, K., Sonzogni, A., Caprioli, F., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+the+culture+and+polarized+stimulation+of+human+intestinal+mucosa+explants.">A novel method for the culture and polarized stimulation of human intestinal mucosa explants.</a> J Vis Exp. , e4368 (2013).</li><li>Hu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+Sensor+AIM2+Maintains+Intestinal+Homeostasis+via+Regulation+of+Epithelial+Antimicrobial+Host+Defense.">The DNA Sensor AIM2 Maintains Intestinal Homeostasis via Regulation of Epithelial Antimicrobial Host Defense.</a> Cell Rep. 13, 1922-1936 (2015).</li><li>Moorghen, M., Chapman, M., Appleton, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ-culture+method+for+human+colorectal+mucosa+using+serum-free+medium.">An organ-culture method for human colorectal mucosa using serum-free medium.</a> J Pathol. 180, 102-105 (1996).</li><li>Dame, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+tissue+in+organ+culture:+preservation+of+normal+and+neoplastic+characteristics.">Human colon tissue in organ culture: preservation of normal and neoplastic characteristics.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 46, 114-122 (2010).</li><li>Grant, A. J., Woodward, J., Maskell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+organ+culture+model+using+human+gastro-intestinal+tissue+and+Campylobacter+jejuni.">Development of an ex vivo organ culture model using human gastro-intestinal tissue and Campylobacter jejuni.</a> FEMS Microbiol Lett. 263, 240-243 (2006).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

الخلايا الظهارية في الأمعاء حساسة جدا من حيث متطلبات نموها وبالتالي يصعب الثقافة. الخلايا الظهارية المعزولة عن طريق العلاج EDTA لا البقاء على قيد الحياة في وسائل الإعلام ثقافة الخلية التقليدية مثل DMEM 8. لذلك، ودراسات التفاعل المضيف الممرض باستخدام سرداب ?...

يمثل الأمعاء نظام ديناميكي يعمل كحاجز للالكائنات الدقيقة المتعايشة، وتحارب ضد مسببات الأمراض الغازية، وينظم تكوينه الميكروبي 1. الخلايا الظهارية في الأمعاء، ويتألف من المعوية والخلايا الكأسية، والخلايا بانيت والخلايا enteroendocrine، هي سكان الخلية الرئيسية التي توفر الردود دفاع المضيف ضد الجراثيم المعوية. الخلايا الكأسية تنتج mucins أن إنشاء منطقة منزوعة السلاح على الجزء العلوي من طبقة الطلائية 2. الخلايا بانيت والمعوية تنتج الببتيدات المضادة للميكروبات، السيتوكينات، والأكسجين والنيتروجين الأنواع المتفاعلة التي تشكل الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات والمساهمة في تشكيل وتكوين الجراثيم المعوية 3 و 4. بالإضافة إلى الخلايا الظهارية، والخلايا المناعية بما في ذلك الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا القاتلة الطبيعية، الخلايا الليمفاوية، واينا<html> الخلايا اللمفاوية الشركة المصرية للاتصالات في الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية تلعب دورا حاسما في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية من خلال إنتاج السيتوكينات، كيموكينات، وغيرها من الوسطاء 5-7. من أجل فهم كيف يمكن لنظام المناعة المخاطية ينظم الجراثيم ويوفر الحماية ضد العدوى الميكروبية، فمن المهم النظر في التفاعل المعقد للسكان الخلية غير متجانسة من القناة الهضمية. ومع ذلك، وهو نموذج في المختبر الذي يشمل جميع الميزات الموجودة في الأمعاء غير متوفر. لذلك، والدراسات الجزيئية على تفاعل المضيف الممرض في الأمعاء تشكل تحديا للغاية. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد تم تطوير عدة أنظمة نموذج التي تحاكي جوانب الغشاء المخاطي في الأمعاء عن التحقيق في العمليات الفيزيولوجية المرضية تشارك في الأمراض الالتهابية الأمعاء (IBD) وغيرها من اضطرابات الجهاز الهضمي 8 -= &quot;XREF&quot;&gt; 14. وغالبا ما تستخدم خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء خلد لدراسة الخلايا الظهارية استجابات محددة. ومع ذلك، لأن التعبير الجيني التفاضلية وظيفة في الخلايا خلد، حصلت على البيانات من استخدام هذه الخلايا غالبا ما لا تتطابق مع تلك التي لوحظت في الدراسات المجراة. سرداب الأمعاء عضي الثقافة برزت مؤخرا كأداة محتملة لتقييم استجابة ظهارة الأمعاء لمختلف المحفزات 13. في هذا النظام، ويسمح للخلايا الجذعية سرداب في النمو وتطوير هيكل عضوي الشكل 3D. في حين أن نظام الثقافة عضوي الشكل هو مفيد جدا لدراسة جوانب كثيرة من ظهارة الأمعاء، فإنه لا تحاكي التفاعل المعقد بين الخلايا المناعية والخلايا الظهارية والمنتجات الميكروبية. ثقافة فيفو السابقين من الأنسجة المعوية تقدم تمثيل أفضل للفي الجسم الحي الردود دفاع المضيف. في هذه الطريقة، وهي جزء من الأمعاء هو مثقف في لوحة الثقافة خلية خفة دمح وسائل الإعلام المناسبة السماح للأنواع المختلفة من السكان الخلية في الأمعاء وتكون نشطة عملية الأيض لمدة 48 ساعة على الأقل. وبالتالي، ثقافة فيفو السابقين من الجهاز يمكن استخدامها لقياس التعبير عن الجينات المضادة للميكروبات والردود دفاع المضيف من الأمعاء لحافز معين. وكان المحققون باستخدام نظام الجهاز ثقافة فيفو السابقين لدراسة الردود دفاع المضيف ضد العدوى الميكروبية في الأمعاء 15-21. اعتمدنا مؤخرا نظام الثقافة الجهاز لدراسة دور inflammasome في الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في كولون الماوس 22. وinflammasome هي عبارة عن منصة الجزيئية لتفعيل كاسباس 1، وهو مطلوب لإنتاج نضجت IL-1β و IL-18. أظهرنا أن IL-1β و IL-18 حمل الببتيدات المضادة للميكروبات التي تقتل بشكل فعال pathobionts المتعايشة مثل كولاي </em&gt;. وكانت هذه الملاحظة بما يتفق مع زيادة عبء كولاي في كولون الماوس inflammasome معيب 22. هذا النظام وبالتالي يمكن استخدامها لدراسة دور مستقبلات التعرف على الأنماط (PRRs) وغيرها من الجزيئات المناعية الفطرية في ردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات المعوية وكذلك التسبب في اضطرابات الأمعاء مثل مرض التهاب الأمعاء (IBD) وسرطان القولون والمستقيم (CRC). هناك أكثر من 200 الجينات IBD قابلية، والطفرات في كثير من هذه الجينات ترتبط مع تكوين الجراثيم تغير في القناة الهضمية. ومن الأهمية السريرية كبيرة لتحديد الآلية الدقيقة التي من خلالها الجينات IBD-القابلية تنظم الجراثيم القناة الهضمية. ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة لإدخال البروتوكول الأساسي من خارج الحي الثقافة الجهاز القولون وإظهار كيف أن هذا الأسلوب يمكن استخدام الثقافة لدراسة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات في الأمعاء.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/ F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline, modified, w/o Calcium chloride &amp;amp; Magnesium chloride</td><td>Sigma</td><td>5634</td><td></td></tr><tr><td>FBS, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F4135</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin solution</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-1b recombinan</td><td>Reprokine</td><td>RKP10749</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-18 recombinant</td><td>Reprokine</td><td>RKP70380</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Difco Luria-Bertani Broth&amp;nbsp;</td><td>BD Bioscience</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Difco Dehydrated Culture Media: MacConkey Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0075-17-1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Uded to measure RNA concentration</td></tr><tr><td>UV/Vis Spectrophotometer</td><td>BECKMAN</td><td>DU 530</td><td>Used to determine E. coli count</td></tr><tr><td>iScript RT Supermix, 100 rxns</td><td>Bio-Rad</td><td>1708841</td><td></td></tr><tr><td>iTaq Univer SYBR Green Supermix&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1725125&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lysing Matrix S (1/8&quot;), 2 ml Tube</td><td>MP Biomedicals</td><td>116925500</td><td>Used to homgenize colon organ for RNA isolation</td></tr><tr><td>FastPrep-24 5G System</td><td>Bio-Rad</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm Petri Dish</td><td>Falcon</td><td>5687</td><td></td></tr><tr><td>Plate 6 well ps TC CS100, Cellstar, 6w, tc, F-bottom (Flat), w/lid, sterile</td><td>Cellstar</td><td>5085</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>5698</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST40R Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific orbital shaker</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the ex vivo colon organ culture and its use in antimicrobial host defense studies

يعرض الأمعاء بنية هياكل سرداب المتكررة التي تتكون من أنواع مختلفة من الخلايا الظهارية، propia الصفيحة التي تحتوي على الخلايا المناعية، وسدى. كل من هذه الخلايا غير متجانسة تساهم في التوازن المعوي والمشاركة في دفاع المضيف مضادات الميكروبات. لذلك، وتحديد نموذج بديل لدراسة الاستجابة المناعية والنشاط المضادة للميكروبات الأمعاء في الإعداد في المختبر هي صعبة للغاية. في الدراسات المختبرية باستخدام خلد خطوط الخلايا الظهارية في الأمعاء أو سرداب حتى الابتدائي عضي الثقافة لا تمثل علم وظائف الأعضاء الدقيق الأمعاء الطبيعي والمكروية لها. هنا، نحن نناقش طريقة لزراعة الأنسجة الماوس القولون في طبق ثقافة، وكيف يمكن تنفيذ هذا المجراة سابقا نظام الجهاز ثقافة في الدراسات المتعلقة الردود دفاع المضيف مضادات الميكروبات. في التجارب التمثيلية، أظهرنا أن كولون في الثقافة الجهاز تعبر عن الببتيدات المضادة للميكروبات في التنonse إلى دخيلة IL-1β و IL-18. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات المستجيب المضادة للميكروبات التي تنتجها الأنسجة القولون في الثقافة الجهاز تقتل بكفاءة القولونية في المختبر. هذا النهج، وبالتالي، يمكن استخدامها لتشريح دور أنماط الجزيئية pathogen- ويرتبط خطر والمستقبلات الخلوية في تنظيم المعوية الاستجابات المناعية الفطرية والاستجابات دفاع المضيف مضادات الميكروبات.

وأظهرت صورة تمثيلية لكولون في الثقافة الجهاز في الشكل 1. لا تزال القطع القولون في الثقافة عملية الأيض والنشطة من الناحية الفسيولوجية. أنها تستجيب بكفاءة للمؤثرات الخارجية إضافة إلى وسائل الإعلام والثقافة. وتدفق العمل التخطيطي للإعداد للأ?...

Watch this Scientific Journal Video about The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies at JoVE.com

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; القولون ثقافة الجهاز واستخدامه في الدراسات الدفاعية المضيف مضادات الميكروبات

The intestine displays an architecture of repetitive crypt structures consisting of different types of epithelial cells, lamina propia containing immune ...

the-ex-vivo-colon-organ-culture-its-use-antimicrobial-host-defense

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

14.0K Views.  UT Southwestern Medical Center. The ex vivo organ culture allows investigation of biological processes in the context of the intact tissue architecture. Here, we introduce a method of ex vivo culture of the mouse colon, which can be used to study innate immunity and antimicrobial host defense in the intestine. 

Video: The Ex Vivo Colon Organ Culture and Its Use in Antimicrobial Host Defense Studies

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Biochemistry

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

Several human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical polarity, ability to differentiate, and anoikis are not maintained in colon cancer derived cell lines. The present study demonstrates a method for culturing primary mouse colon tumor organoids adapted from Sato T et al. 1, which retains important physiologic features of colon tumors. This method consists of mouse colon tumor tissue collection, adjacent normal colon epithelium dissociation, colon tumor cells digestion into single cells, embedding colon tumor cells into matrigel, and selective culture based on the principle that tumor cells maintain growth on limiting nutrient conditions compared to normal epithelial cells.
The primary tumor organoids if isolated from genetically modified mice provide a very useful system to assess tumor autonomous function of specific genes. Moreover, the tumor organoids are amenable to genetic manipulation by virus meditated gene delivery; therefore signaling pathways involved in the colon tumorigenesis could also be extensively investigated by overexpression or knockdown. Primary tumor organoids culture provides a physiologic relevant and feasible means to study the mechanisms and therapeutic modalities for colon tumorigenesis.

In vitro Organoid Culture of Primary Mouse Colon Tumors

A simple method to establish primary murine colon tumor organoid is described. This method utilizes the feature that colon tumor cells survive and grow into organoids in media containing limited growth factors, whereas normal colon epithelial do not.

في المختبر الثقافة عضوي من أورام القولون ماوس

Several  human and murine colon cancer cell lines have been established, physiologic  integrity of colon tumors such as multiple cell layers, basal-apical ...

Medicine

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of the crypt region. IESCs include active stem cells, which self-renew and differentiate into various epithelial cell types, and quiescent stem cells, which serve as the reserve stem cells in the case of injury. Regeneration of the intestinal epithelium is controlled by the self-renewing and differentiating capabilities of these active IESCs. In addition, the balance of the crypt stem cell population and maintenance of the stem cell niche are essential for intestinal regeneration. Organoid culture is an important and attractive approach to studying proteins, signaling molecules, and environmental cues that regulate stem cell survival and functions. This model is less expensive, less time-consuming, and more manipulatable than animal models. Organoids also mimic the tissue microenvironment, providing in vivo relevance. The present protocol describes the isolation of colonic crypts, embedding these isolated crypt cells into a three-dimensional gel matrix system and culturing crypt cells to form colonic organoids capable of self-organization, proliferation, self-renewal, and differentiation. This model allows one to manipulate the environment-knocking out specific proteins such as claudin-7, activating/deactivating signaling pathways, etc.-to study how these effects influence the functioning of colonic stem cells. Specifically, the role of tight junction protein claudin-7 in colonic stem cell function was examined. Claudin-7 is vital for maintaining intestinal homeostasis and barrier function and integrity. Knockout of claudin-7 in mice induces an inflammatory bowel disease-like phenotype exhibiting intestinal inflammation, epithelial hyperplasia, weight loss, mucosal ulcerations, epithelial cell sloughing, and adenomas. Previously, it was reported that claudin-7 is required for intestinal epithelial stem cell functions in the small intestine. In this protocol, a colonic organoid culture system is established to study the role of claudin-7 in the large intestine.

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

The present protocol describes establishing a murine colonic organoid system to study the activity and functioning of colonic stem cells in a claudin-7 knockout model.

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

Cancer Research

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

ال<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الثقافة والتعرف على الأنماط مستقبلات تحفيز ماوس المعوية Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

طريقة مبتكرة لثقافة الاستقطاب وتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Biology

An Intestinal Gut Organ Culture System for Analyzing Host-Microbiota Interactions

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for maintaining local and systemic homeostasis; changes to gut microbiota composition (dysbiosis) associate with a wide array of human diseases. Methods for dissecting host-microbiota interactions encompass an inherent tradeoff among preservation of physiological tissue structure (when using in vivo animal models) and the level of control over the experiment factors (as in simple in vitro cell culture systems). To address this tradeoff, Yissachar et al. recently developed an intestinal organ culture system. The system preserves a naive colon tissue construction and cellular mechanisms and it also permits tight experimental control, facilitating experimentations that cannot be readily performed in vivo. It is optimal for dissecting short-term responses of various gut components (such as epithelial, immunological and neuronal elements) to luminal perturbations (including anaerobic or aerobic microbes, whole microbiota samples from mice or humans, drugs and metabolites). Here, we present a detailed description of an optimized protocol for organ culture of multiple gut fragments using a custom-made gut culture device. Host responses to luminal perturbations can be visualized by immunofluorescence staining of tissue sections or whole-mount tissue fragments, fluorescence in-situ hybridization (FISH), or time-lapse imaging. This system supports a wide array of readouts, including next-generation sequencing, flow cytometry, and various cellular and biochemical assays. Overall, this three-dimensional organ culture system supports the culture of large, intact intestinal tissues and has broad applications for high-resolution analysis and visualization of host-microbiota interactions in the local gut environment.

This article presents a unique method for analyzing host-microbiome interactions using a novel gut organ culture system for ex vivo experiments.

نظام ثقافة الجهاز الأمعاء المعوية لتحليل التفاعلات المضيف الميكروبيوتا

The structure of the gut tissue facilitates close and mutualistic interactions between the host and the gut microbiota. These cross-talks are crucial for ...

الآثار الظهارية للالتهاب المعوي على القولون الفئران الثابتة

Studying the Epithelial Effects of Intestinal Inflammation In Vitro on Established Murine Colonoids

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic cell layer provides the first line of defense between microbial and immune populations and helps to modulate the intestinal immune response. Disruption of the epithelial barrier is a hallmark of inflammatory bowel disease (IBD) and is of interest for therapeutic targeting. The 3-dimensional colonoid culture system is an extremely useful in vitro model for studying intestinal stem cell dynamics and epithelial cell physiology in IBD pathogenesis. Ideally, establishing colonoids from the inflamed epithelial tissue of animals would be most beneficial in assessing the genetic and molecular influences on disease. However, we have shown that in vivo epithelial changes are not necessarily retained in colonoids established from mice with acute inflammation. To address this limitation, we have developed a protocol to treat colonoids with a cocktail of inflammatory mediators that are typically elevated during IBD. While this system can be applied ubiquitously to various culture conditions, this protocol emphasizes treatment on both differentiated colonoids and 2-dimensional monolayers derived from established colonoids. In a traditional culture setting, colonoids are enriched with intestinal stem cells, providing an ideal environment to study the stem cell niche. However, this system does not allow for an analysis of the features of intestinal physiology, such as barrier function. Further, traditional colonoids do not offer the opportunity to study the cellular response of terminally differentiated epithelial cells to proinflammatory stimuli. The methods presented here provide an alternative experimental framework to address these limitations. The 2-dimensional monolayer culture system also offers an opportunity for therapeutic drug screening ex vivo. This polarized layer of cells can be treated with inflammatory mediators on the basal side of the cell and concomitantly with putative therapeutics apically to determine their utility in IBD treatment.

تسليط الضوء على المؤلف: دراسة الآثار الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران المنشأة  

We describe a protocol detailing the isolation of murine colonic crypts for the development of 3-dimensional colonoids. The established colonoids can then be terminally differentiated to reflect the cellular composition of the host epithelium prior to receiving an inflammatory challenge or being directed to establish an epithelial monolayer.

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

The intestinal epithelium plays an essential role in human health, providing a barrier between the host and the external environment. This highly dynamic ...

ال

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تقييم جدوى اتحاد البكتيرية الاصطناعية على واجهة المضيف-ميكروب القناة الهضمية في المختبر

في المختبر الثقافة عضوي من أورام القولون ماوس

ثقافة ثلاثية الأبعاد لخبايا القولون الفئران لدراسة وظيفة الخلايا الجذعية المعوية خارج الجسم الحي

ال

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

طريقة مبتكرة لثقافة الاستقطاب وتحفيز من explants الإنسان مخاطية الأمعاء

نظام ثقافة الجهاز الأمعاء المعوية لتحليل التفاعلات المضيف الميكروبيوتا

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ

دراسة التأثيرات الظهارية للالتهاب المعوي في المختبر على القولون الفئران الراسخ