نود أن نشكر جونسون آند جونسون، تحالف السل، أسترا زينيكا، ريب-X و تريوس العلاجية لتوفير بيداكيلين، با-824 (بريتمانيد)، AZD5847، راديزوليد و تيديزوليد، على التوالي. بريندان بريدو، ماثيو زيمرمان، ستيفن جوزوين، إيما ري جورادو، نانسي راول، ليان لي و دانيال وينر قدمت الدعم مع تحليل مالدي، أساليب التحليلية البيولوجية، وإعداد بديل الكالسيوم، التركيب الكيميائي، وعزل الكالسيوم الأرنب. وقد تم هذا العمل بتمويل من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، وجائزة # OPP1044966 و OPP1024050 إلى V. دارتواز، المعاهد الوطنية للصحة تقاسم الأجهزة منحة S10OD018072، فضلا عن التمويل المشترك من مؤسسة بيل وميليندا غيتس و ويلكوم الثقة لمركز التميز لتحسين الرصاص لأمراض العالم النامي إلى P. وايت.

أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة مع موافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام نيد (نيه)، بيثيسدا، مد. أجريت جميع الدراسات التي شملت M. السل في مختبر مع مستوى السلامة الاحتواء 3 (بسل-3). 1. أرنب العدوى نموذج ومجموعة كاسوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة نيوزيلندا الأرانب البيضاء مع M. السل باستخدام نظام التعرض الهباء الأنف فقط كما هو موضح سابقا. 12 ، 13 السماح للعدوى إلى التقدم لمدة 12-16 أسابيع. يخدع الأرانب مع 35 ملغ / كغ من الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين العضل، الموت ببطء الأرانب مع 0.22 مل / كغ بينتوباربيتال الصوديوم والفينيتوين الصوديوم عن طريق الوريد والمضي قدما في نكروبسيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملاقط ومشرط، وإزالة الرئتين من الصدر كاليفورنياvity. من كل الفص الرئة، تشريح تجاويف الفردية والأورام الحبيبية نخرية كبيرة باستخدام مشرط. كشط بعناية من كاسوم من تجويف والجدران الورم الحبيبي. وزن وتسجيل وتخزين العينات في 2 مل أنابيب المسمار المغطاة في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غاما-إراديت عينات الكالسيوم المعدية في 3 ميغراد على الجليد الجاف لجعلها غير مأمونة وآمنة للاستخدام في مختبر بسل-2. </li></ol> 2. في المختبر جيل من كيسوم بديل من خلايا ثب-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثب-1 حيدات في رمي 1640 المتوسطة (2 ملي L- الجلوتامين و 10٪ مصل بقري جنيني) في T175 قوارير ثقافة الخلية (80 مل / قارورة). احتضان القوارير في 5٪ كو 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الثقافة من قارورة T175 في اثنين 50 مل أنابيب مخروطية في 150 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتعليق بيليه في 10 مل من رمي 1640 وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 5 ميكرولتر من هذه الثقافة إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 45 ميكرولتر من رالأزرق الأزرق. مزيج جيدا بيبتينغ. نقل 10 ميكرولتر إلى عدادة الكريات وعدد عدد من حيدات ثب-1 قابلة للحياة (غير ملوثين) باستخدام المجهر الضوئي (10X التكبير). حساب عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل من الثقافة. تمييع ذلك مع وسائل الإعلام رمي إلى الكثافة النهائية من 1.25 × 10 6 خلايا / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 40 مل من الثقافة على لوحة زراعة الخلايا الكبيرة (50 × 10 6 خلايا / لوحة). إضافة 40 ميكرولتر من 100 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية (فوربول 12-myristate13 أسيتات أعدت في الإيثانول) والسماح للخلايا على الالتزام بين عشية وضحاها في الحاضنة. ملاحظة: تركيز النهائي من سلطة النقد الفلسطينية هو 100 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع حمض الأوليك النقي (أوا) (0.89 غرام / مل) في الإيثانول إلى تركيز 0.1 M ( أي 31.7 ميكرولتر الزراعة العضوية في 968.3 ميكرولتر الإيثانول). تمييع هذا الحل في وسائل الإعلام رمبي قبل تحسنت جديدة إلى تركيز 10 ملم. تمييع هذا تعليق أوا إلى 0.4 ملم (تركيز العمل النهائي) في رمي المتوسطة قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الوسائط الموجودة وغيرخلايا -edhered من لوحات ثقافة الخلية وإضافة بلطف 40 مل من 0.4 مم الزراعة العضوية إلى الضامة ثب-1 (ثب-M). احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر الضوئي في التكبير 40X لتأكيد بصريا وجود العديد من الشحوم الجسم الدهون في كل ثب-M. إزالة جميع المتوسطة رمي من لوحات زراعة الخلايا وغسل بلطف الخلايا الملتصقة مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) باستخدام ماصة 50 مل المصلية. ملاحظة: تظهر الهيئات الدهنية هياكل صغيرة، واضحة، كروية في السيتوبلازم من ثب-M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 مل من 5 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) في برنامج تلفزيوني لكل لوحة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الضامة رغوي (فم) من قبل بيبتينغ مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا على سطح لوحة كاملة باستخدام ماصة 10 مل المصلية. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور باستمرار في 150 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من برنامج تلفزيوني (ثالث بس غسل) أونقل إلى أنابيب مخروطية قبل وزنها 15 مل. تدور باستمرار مرة أخرى في 150 x ج لمدة 5 دقائق. نضح بعناية طاف باستخدام ماصة المصلية وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع الكريات فم إلى 3 دورات تجميد ذوبان الجليد إلى ليز الخلايا واحتضان لهم في 75 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة لتفريق البروتينات في المصفوفة. تخزين الكريات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 3. السريع موازنة غسيل الكلى (الأحمر) الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ملي حلول الأسهم من جميع مركبات الاختبار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو). تمييع إلى 500 ميكرومتر حلول العمل في دمسو قبل كل فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن أنبوب يحتوي على الكالسيوم بديل بيليه. طرح وزن أنبوب فارغ لاستخلاص وزن بيليه وحده. إضافة 2-3 الخرز المعدنية لكل أنبوب، وذلك باستخدام الخالط الأنسجة في 1،200 السكتات الدماغية / دقيقة لمدة 1 دقيقة، وتعطيل كاسوم أو المصفوفة البديلة في برنامج تلفزيوني (1: 9 ث / ت) لتحقيق 10X تعليق المخفف من كل مصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع 6.5 ميكرولتر من 500محلول ميكرومتر من مجمع الاختبار إلى 643.5 ميكرولتر من جناسة لتحقيق تركيز النهائي من 5 ميكرومتر (≤1٪ دمسو) والدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج الأحمر في لوحة قاعدة. إضافة 200 ميكرولتر من المصفوفة المغطاة المخدرات في غرفة المانحة (حلقة حمراء) من كل إدراج الأحمر و 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل غرفة الاستقبال. إعداد 3 إدراج لكل مركب اختبار (ثلاث نسخ عينات). ختم لوحة مع ختم لوحة لاصقة واحتضان عند 37 درجة مئوية على ثيرموميكسر في 200 دورة في الدقيقة (1 زغ) لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وخلط بلطف محتويات غرف المانحين والمتلقي من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا 2-3 مرات. ماصة من 20 أليكوتس ميكرولتر من جناسة من غرف المانحة وإضافة إلى 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني نظيفة في أنبوب 1.5 مل (1: 1). وبالمثل، ماصة من 20 قسامة ميكرولتر من عينات بس من غرف الاستقبال وإضافة إلى 20 ميكرولتر من جناسة نظيفة (مطابقة مصفوفة). 8 ملاحظة: مصفوفة مطابقة يلغي نإد ل 2 منحنيات المعايرة منفصلة (في جناسة و بس) ليتم إجراؤها للتحليل الكمي. وقد تتسبب محتويات غرفة المانحين في الرواسب على مر الزمن. خلط بلطف محتويات بيبتينغ قبل إزالة أليكوتس. </li></ol> 4. لك-مس الكمي وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 160 ميكرولتر من 1: 1 الميثانول: أسيتونتريل تحتوي على 500 نانوغرام / مل ديكلوفيناك أو 10 نانوغرام / مل فيراباميل (معيار داخلي) إلى كل أنبوب ودوامة لترسيب البروتينات. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق لرسوبيات راسب ونقل سوبرناتانتس إلى 96 جيدا جيدا لوحات عميقة للتحليل اللوني السائل الطيف الكتلي (لمس) التحليل. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء منحنيات المعايرة من 1-1،000 نانومتر لكل مجمع اختبار مع الحفاظ على نفس تكوين المصفوفة كما العينات أعلاه. تحديد تركيز مركب الاختبار في عينات من غرف المانحين والمستقبلات باستخدام طريقة لك-مس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احسب الجزء غير المنضم ( f u ) oو المخدرات في المصفوفة المخففة باستخدام المعادلة 1. حساب و u في مصفوفة غير مخفف باستخدام المعادلة 2 ( D = عامل التخفيف من 10). 14 <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من الانتعاش (توازن الكتلة) من كل مركب باستخدام المعادلة 3 لتحديد المركبات مع الاستقرار / الأيض / قضايا ملزمة غير محددة. ملاحظة: الانتعاش عادة ما يتراوح بين 70٪ و 130٪. 15 <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy.">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li><li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis.">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions.">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li><li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding.">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li><li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Equilibrium+Dialysis+(RED):+an+In-vitro+High-Throughput+Screening+Technique+for+Plasma+Protein+Binding+using+Human+and+Rat+Plasma.">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid.">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li><li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+localization,+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat.">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+a+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li><li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

لا توجد مصالح مالية متنافسة.

الآفات الميتة الرئوية والتجويف في المرضى المصابين بالسل تحتوي على مجموعات سكانية فرعية من البكتيريا التي تعاد إلى العلاج من تعاطي المخدرات. النوى الحلقية لهذه الهياكل هي المسؤولة بشكل خاص عن إيواء هذه بيرسيسترس في بيئة خارج الخلية. ويعتقد أن التوزيع المواتي لعوامل ...

علاج مرض السل الرئوي يتطلب التوزيع الفعال للأدوية إلى أنواع مختلفة من الآفات. آفات الميتة وتجاويف تحتوي على مراكز الجبني التي تأوي مجموعات سكانية فرعية من البكتيريا &#39;دائمة&#39; أو متسامحة المخدرات. ويرتبط 1، 2 مرض جوفي مع معدلات الشفاء متدنية وسوء أحوال الطقس. وقد أظهرت 3 و 4 دراسات سابقة، وذلك باستخدام التقنيات الكمية والتصوير، أن القدرة على اختراق caseum تختلف بشكل كبير من الطبقة دواء واحد إلى آخر. 5، 6 هذه الطرق، ومع ذلك، تتطلب استخدام نماذج العدوى الحيوانية التي تكون بطيئة ومملة. وقد تم تصميم مقايسة في المختبر الذي يقيس المخدرات ملزمة لخارج الحي caseum. هذا الربط وجدت لربط عكسيا مع انتشار المخدرات في حبيبية الجبني، وبالتالي، هوتستخدم كأداة تنبؤية. 7 ويعتبر التوازن غسيل الكلى نهج الذهب القياسية لبروتينات البلازما الدراسات ملزمة. يوفر جهاز غسيل الكلى السريع (ريد) نظام سريع وسهل الاستخدام وموثوق به لإجراء مثل هذه المقايسات. 8 يتكون الجهاز من مكونين: واحد-- استخدام، المتاح إدراج تتألف من 2 غرف مفصولة اسطوانة عمودية من غشاء شبه-- نفاذية؛ و لوحات قاعدة يمكن إعادة استخدامها التي يمكن أن تعقد ما يصل إلى 48 إدراج في وقت واحد. غشاء غسيل الكلى لديه 8 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (موكو) التي هي مثالية للدراسات ملزمة جزيء المخدرات. ارتفاع نسبة مساحة إلى حجم وحدة من غشاء مقصورة يسمح الغسيل السريع و موازنة. وقد تم التحقق من كل من إدراج ولوحة قاعدة للحد الأدنى ملزمة غير محددة. الجمع بين الجهاز الأحمر مع تقنيات بيواناليتيكال يوفر تقديرات دقيقة للكسور غير منضم من المخدرات في صlasma. 8 ، 9 على الرغم من أن أصلا مصممة لقياس بروتين البلازما ملزمة، وقد تم استخدام الجهاز الأحمر في العديد من الدراسات ملزمة الأنسجة باستخدام التجانس. 10 ، 11 في هذا البروتوكول، نقيس المخدرات ملزمة لكاسيوم، الحطام نخرية استئصال من الآفات نخر وتجويف الأرانب المصابة بالسل. طبيعة خلوية وغير الأوعية الدموية من المواد الكاجي يجعل من السهل التجانس في تعليق متجانسة التي تتوافق مع الفحص. وبالنظر إلى أن كاسيوم مملة لإنتاج ويصعب أن تأتي من قبل، كما تم التحقق من صحة البروتوكول لاستخدامها مع مصفوفة بديلة التي يتم إعدادها من البلاعم رغوي. وتتسبب الضامة المستمدة من خلية واحدة من ثب-1 بحمض الأوليك لتراكم أجسام دهنية متعددة تعطيها مظهرها &quot;الرغوي&quot;. يتم حصاد هذه الخلايا محملة الدهون ومعالجتها لإنتاج مصفوفة التي نستخدمها كبديل ل كاسوم. وقد أظهرت هذه الدراسة أن المخدرات ملزمة لهذه المصفوفة البديلة يرتبط بشكل جيد مع ملزم إلى الكالسيوم، محاكاة على نحو فعال في عملية الجسم الحي الذي يعيق اختراق المخدرات في جوهر الكاحل من حبيبي وتجويف.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="960">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">New Zealand White Rabbits</td>
			<td style="width:203px;">Covance</td>
			<td style="width:147px;">-</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">HN878 Mycobacterium tuberculosis</td>
			<td style="width:203px;">BEI Resources</td>
			<td style="width:147px;">NR-13647&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Ketathesia (Ketamine) 100mg/mL C3N</td>
			<td style="width:203px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:147px;">56344</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Anased (Xylazine) 100mg/mL</td>
			<td style="width:203px;">Henry Schein Animal Health</td>
			<td style="width:147px;">33198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Virbac</td>
			<td style="width:147px;">710101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">THP-1 monocytic cell line</td>
			<td style="width:203px;">ATCC</td>
			<td style="width:147px;">ATCC TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">175cm&#178; TC-Treated Flask (T175)</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>T-3400-175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 media w/o glutamine</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>MT-15-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SH3091003IR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hyclone L-glutamine, 200mM</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>SH3003401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellstar TC dish, 145x20mm, vented</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>T-2881-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Phorbol 12-myristate13-acetate (PMA)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP685-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oleic acid&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>ICN15178101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce RED Device Reusable Base Plate</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce RED Device Inserts, 50/box&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>PI-89809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce RED insert removal tool&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>89812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Adhesive plate seal</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>08-408-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS, pH7.4, 10 X 500 mL (Gibco)&#160;</td>
			<td style="width:203px;">Life Technologies&#160;</td>
			<td>10010-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">DMSO</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Acetonitrile</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>34998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Methanol</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Verapamil hydrochloride</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>V4629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Diclofenac sodium salt</td>
			<td style="width:203px;">Sigma</td>
			<td>93484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15-250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">2010 Geno/Grinder</td>
			<td style="width:203px;">SPEX SamplePrep</td>
			<td style="width:147px;">2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td>15-340-158</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">484R Cobalt 60 Irradiator</td>
			<td style="width:203px;">JL Shepard</td>
			<td style="width:147px;">7810-484-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">INCYTO&#160;C-Chip Disposable Hemacytometers</td>
			<td style="width:203px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:147px;">22-600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Upright Light Microscope</td>
			<td style="width:203px;">Leica</td>
			<td style="width:147px;">DM1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Binary Liquid Chromatography system</td>
			<td style="width:203px;">Agilent</td>
			<td style="width:147px;">1260</td>
			<td>Multi-compenent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:443px;">Mass spectrometer</td>
			<td style="width:203px;">AB Sciex</td>
			<td>4000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

ويتطلب القضاء على مرض السل وجود نظم أدوية يمكن أن تخترق الطبقات المتعددة من الآفات الرئوية المعقدة. توزيع المخدرات في النوى الكاحل من تجاويف والآفات هو أمر بالغ الأهمية خاصة لأنها تؤوي مجموعات فرعية من البكتيريا المتسامحة للدواء أيضا يشار إليها عادة باسم بيرسيسترس. الطرق الحالية لقياس اختراق المخدرات في الآفات السل تنطوي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا في الدراسات الدوائية الحيوي إلى جانب تقنيات بيواناليتيكال أو التصوير. واقترح في المختبر قياس المخدرات ملزمة لجزيئات كاسيوم كبديل لهذه التقنيات منذ هذا الربط يعيق الانتشار السلبي لجزيئات الدواء من خلال الكالسيوم. التوازن السريع غسيل الكلى هو نظام سريع وموثوق بها لأداء بروتين البلازما والدراسات ملزمة الأنسجة. في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز غسيل الكلى السريع (ريد) لقياس المخدرات ملزمة لمجانسة من الكالسيوم وهذا هو زيسمن آفات وتجويف الأرانب المصابة بالسل. يصف البروتوكول أيضا كيفية إنشاء مصفوفة بديلة من الدهون تحميل ثب-1 الضامة لاستخدامها بدلا من الكالسيوم. هذا فحص الكالسيوم / البديل ملزمة هو أداة هامة في اكتشاف المخدرات السل ويمكن تكييفها للمساعدة في دراسة توزيع المخدرات في الآفات أو الخراجات الناجمة عن أمراض أخرى.

باستخدام هذا البروتوكول، قمنا باختبار مئات من مركبات تطوير المخدرات السل للكفاءة المتوقعة في اختراق الكالسيوم. الشكل 1 يتصور المفاهيم الأساسية للمقايسة الحمراء. غشاء غسيل الكلى من إدراج الأحمر يسمح للجزيئات الصغيرة غير منضم إلى منتشر من ?...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions at JoVE.com

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

نحن هنا تصف طريقة التوازن السريع (ريد) غسيل الكلى لقياس المخدرات ملزمة لكازيوم من آفات السل الرئوي والتجويف. يستخدم البروتوكول أيضا مع مصفوفة مستمدة بلعم رغوي الذي هو بديل فعال ل كاسوم.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; كاسيم ملزمة الفحص الذي يتنبأ اختراق المخدرات في الآفات السل

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

11.6K Views.  Rutgers.  نحن هنا تصف طريقة التوازن السريع (ريد) غسيل الكلى لقياس المخدرات ملزمة لكازيوم من آفات السل الرئوي والتجويف. يستخدم البروتوكول أيضا مع مصفوفة مستمدة بلعم رغوي الذي هو بديل فعال ل كاسوم. 

Video: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. Biofilms are community-associated bacteria attached to a surface and encased in a matrix. The role of the extracellular matrix is multifaceted, including facilitating nutrient acquisition, and offers significant protection against environmental stresses (e.g. host immune responses). In an effort to acquire a better understanding as to how the bacteria within a biofilm respond to environmental stresses we have used a protocol wherein we visualize bacterial biofilms which have formed in an 8-well chamber slide. The biofilms were stained with the BacLight Live/Dead stain and examined using a confocal microscope to characterize the relative biofilm size, and structure under varying incubation conditions. Z-stack images were collected via confocal microscopy and analyzed by COMSTAT. This protocol can be used to help elucidate the mechanism and kinetics by which biofilms form, as well as identify components that are important to biofilm structure and stability.

In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide

This article describes the procedure for the formation and visualization of a bacterial biofilm grown within an 8-well chamber slide

تشكيل بيوفيلم في المختبر في غرفة الشرائح 8 جيد

The chronic nature of many diseases is attributed to the formation of bacterial biofilms which are recalcitrant to traditional antibiotic therapy. ...

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

تسهيل اكتشاف المخدرات: مؤتمتة فحص التهاب عالية المحتوى في الزرد

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

نموذج تجريبي لدراسة الملاريا والسل عدوى مرافقة على انتقال الطبيعية السل المتفطرة و المتصورة berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a prerequisite for pneumococcal infections such as pneumonia and otitis media. In vitro adherence assays can be used to study the attachment of pneumococci to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions, such as the use of probiotics, to inhibit pneumococcal&#160;colonization.&#160;The protocol described here is used to investigate the effects of the probiotic Streptococcus salivarius on the adherence of pneumococci to the human epithelial cell line CCL-23 (sometimes referred to as HEp-2 cells). The assay involves three main steps: 1) preparation of epithelial and bacterial cells, 2) addition of bacteria to epithelial cell monolayers, and 3) detection of adherent pneumococci by viable counts (serial dilution and plating) or quantitative real-time PCR (qPCR). This technique is relatively straightforward and does not require specialized equipment other than a tissue culture setup. The assay can be used to test other probiotic species and/or potential inhibitors of pneumococcal colonization and can be easily modified to address other scientific questions regarding pneumococcal adherence and invasion.

Investigating the Effects of Probiotics on Pneumococcal Colonization Using an In Vitro Adherence Assay

In vitro adherence assays can be used to study the attachment of Streptococcus pneumoniae to epithelial cell monolayers and to investigate potential interventions such as the use of probiotics for inhibiting pneumococcal colonization.

التحقيق في آثار البروبيوتيك على المكورات الرئوية الاستعمار باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; الالتزام الفحص

Adherence of Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) to the epithelial lining of the nasopharynx can result in colonization and is considered a ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

مما يدل على متعدد المخدرات مقاومة<em&gt; السل المتفطرة</em&gt; التضخيم ميكروأري

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

مرجع مرق الطريقة Microdilution لDalbavancin<em&gt; في المختبر</em&gt; حساسية اختبار من البكتيريا التي تنمو هوائيا

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

إنشاء إعداد إنتاجية عالية لفحص الجزيئات الصغيرة التي تعدل ج-دي-GMP في اشارة<em&gt; الزائفة الزنجارية</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by pharmaceutical companies is a market opportunity, but it is also a strategy to increase drug accessibility and reduce therapy-associated costs. The protocols detailed here describe the evaluation of target binding and CDC induction by rituximab in Daudi cells. These two functions require different structural regions of the antibody and are relevant to the clinical effect induced by rituximab. The protocols allow the side-to-side comparison of a reference rituximab and a marketed rituximab biosimilar. The evaluated products showed differences both in target binding and CDC induction, suggesting that there are underlying physicochemical differences and highlighting the need to analyze the impact of those differences in the clinical setting. The methods reported here constitute simple and inexpensive in vitro models for the evaluation of the activity of rituximab biosimilars. Thus, they can be useful during biosimilar development, as well as for quality control in biosimilar production. Furthermore, the presented methods can be extrapolated to other therapeutic mAbs.

In Vitro Methods for Comparing Target Binding and CDC Induction Between Therapeutic Antibodies: Applications in Biosimilarity Analysis

This protocol describes the in vitro comparison of two key functional characteristics of rituximab: target binding and complement-dependent cytotoxicity (CDC) induction. The methods were employed for a side-to-side comparison between reference rituximab and a rituximab biosimilar. These assays can be employed during biosimilar development or as a quality control in their production.

في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are relevant to the treatment of different pathologies, including cancers. The development of biosimilar mAbs by ...