Name: an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
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Desideriamo ringraziare Johnson &amp; Johnson, la TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X e Trius Therapeutics per la fornitura di bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid e tedizolid, rispettivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li e Danielle Weiner fornito supporto con analisi MALDI, metodi bioanalitici, preparazione del surrogato caseum, sintesi chimica, e l&#39;isolamento di coniglio caseum. Questo lavoro è stato condotto con il finanziamento del Fondazione Bill e Melinda, premio # OPP1044966 e OPP1024050 a V. Dartois, NIH Shared Strumentazione di Grant S10OD018072, così come il finanziamento congiunto da parte della Fondazione Bill e Melinda Gates e Wellcome Trust per un centro di eccellenza per l&#39;ottimizzazione di piombo per malattie del mondo in via di sviluppo di P. Wyatt.

Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Guida per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio degli Istituti Nazionali di Salute con l&#39;approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali della NIAID (NIH) di Bethesda, MD. Tutti gli studi riguardanti la M. tuberculosis sono stati eseguiti in un laboratorio con livello di contenimento della biosicurezza 3 (BSL-3). 1. Modello di infezione del coniglio e collezione di Caseum <ol><li> Infettare conigli bianchi della Nuova Zelanda con M. tuberculosis utilizzando un sistema di esposizione agli aerosol solo a naso come descritto in precedenza. 12 , 13 Lasciare che l&#39;infezione progredisca per 12-16 settimane. Sedate i conigli con 35 mg / kg di ketamina e 5 mg / kg di xilazina intramuscolare, eutanalizzare i conigli con 0,22 mL / kg di pentobarbital sodico e fenytoina sodico per via endovenosa e procedere con le necropsie. </li><li> Usando le pinzette e un bisturi, rimuovi i polmoni dalla cassa caVITY. Da ogni lobo del polmone, disseccare singole cavità e grandi granulomi necrotici utilizzando un bisturi. Raschiare correttamente il caseum dalla parete di cavità e granuloma. Pesare, registrare e conservare campioni in 2 mL tubi a vite a -20 ° C fino all&#39;uso pronto. </li><li> Gamma-irradia i campioni infetti di caso in 3 MegaRad su ghiaccio secco per renderli ininfluenti e sicuri per l&#39;uso in un laboratorio BSL-2. </li></ol> 2. In vitro generazione di Caseum Surrogate da cellule THP-1 <ol><li> Crescono monociti THP-1 nel mezzo RPMI 1640 (2 mM L-glutamina e 10% siero fetale bovino) in tazze di coltura T175 (80 mL / pallone). Incubare le fiasche in un&#39;atmosfera al 5% di CO 2 a 37 ° C per 3-4 giorni. </li><li> Centrifugare la coltura da una fiala T175 in due tubi conici da 50 mL a 150 xg per 5 min. Scartare il surnatante e sospendere il pellet in 10 ml di supporti RPMI 1640. </li><li> Pipettare 5 μL di questa coltura in un tubo da 1,5 mL contenente 45 μL di tblu rypan. Mescolare accuratamente pipettando. Trasferimento 10 microlitri ad un emocitometro e contare il numero di vitali THP-1 monociti (non colorati) utilizzando un microscopio ottico (ingrandimento 10X). Calcolare il numero di cellule vitali per ml della cultura. Diluire con mezzi RPMI alla densità finale di 1,25 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Carico 40 mL di coltura su una grande piastra di coltura cellulare (50 x 10 6 cellule / piastra). Aggiungere 40 ml di 100 mM PMA (forbolo 12-myristate13-acetato preparata in etanolo) e consentono alle cellule di aderire durante la notte in incubatrice. NOTA: concentrazione finale di PMA è 100 nm. </li><li> Diluire acido oleico puro (OA) (0,89 g / ml) in etanolo alla concentrazione di 0,1 M (cioè 31,7 microlitri OA a 968,3 ml di etanolo). Diluire questa soluzione in acqua dolce dei media RMPI pre-riscaldato a una concentrazione di 10 mm. Diluire questa sospensione OA di 0,4 mM (concentrazione finale di lavoro) in terreno RPMI pre-riscaldato a 37 ° C. </li><li> Rimuovere i media e non esistenticellule -adhered dalle piastre di coltura cellulare e delicatamente aggiungono 40 mL di 0,4 mM OA ai macrofagi THP-1 (THP-M). Incubare a 37 ° C in incubatore notte. </li><li> Utilizzare un microscopio ottico a 40 ingrandimenti per confermare visivamente la presenza di numerose inclusioni lipidiche corpo in ogni THP-M. Rimuovere tutti mezzo RPMI dalle piastre di coltura cellulare e lavare delicatamente le cellule aderenti due volte con tampone fosfato isotonico (PBS) usando una pipetta sierologica 50 mL. NOTA: corpi lipidici appaiono come piccole, chiare, strutture sferiche nel citoplasma della THP-M. </li><li> Aggiungere 40 ml di 5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in PBS per ciascuna piastra. Incubare per 15 minuti a 37 ° C. </li><li> Staccare i macrofagi schiumosi (FM) ripetutamente pipettando su e giù sulla superficie di tutta la piastra usando una pipetta sierologica 10 mL. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 ml e centrifugare a 150 xg per 5 min. </li><li> Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di PBS (terzo lavaggio PBS) unIl trasferimento in un tubo conico pre-pesato da 15 ml. Spin giù di nuovo a 150 xg per 5 minuti. Aspira attentamente il surnatante usando una pipetta sierologica e scartare. </li><li> Sostituire i pellet FM a 3 cicli di congelamento-scongelamento per liscivare le cellule e incubarle a 75 ° C per 20-30 min per denaturare proteine ​​nella matrice. Conservare i pellet a -20 ° C fino a quando non sarà pronto per l&#39;uso. </li></ol> 3. Analisi della dialisi rapida di equilibrazione (RED) <ol><li> Preparare soluzioni di 10 mM di tutti i composti di prova in dimetilsolfossido (DMSO). Diluire fino a 500 μM soluzioni di lavoro in DMSO prima di ogni dosaggio. </li><li> Pesare il tubo contenente il pellet surrogato di caso. Sottrai il peso del tubo vuoto per ottenere il peso del pellet da sola. Aggiungere 2-3 branelli metallici per tubo e, utilizzando un omogeneizzatore a 1,200 colpi / min per 1 min, interrompere il caso o la matrice surrogata in PBS (1: 9 w / v) per ottenere una sospensione diluita di 10 volte di ciascuna matrice. </li><li> Spike 6.5 μL del 500ΜM del composto in esame in 643,5 μL dell&#39;omogenato per ottenere la concentrazione finale di 5 μM (≤1% DMSO) e vortex. </li><li> Posizionare gli inserti ROSSI nella piastra di base. Aggiungere in una camera di ricevente 200 μL della matrice a spruzzo a farmaci nella camera donatrice (anello rosso) di ciascun inserto RED e 350 μL di PBS. Preparare 3 inserti per ciascun composto di prova (campioni triplicati). Piastra di tenuta con una guarnizione di piastra adesiva e incubare a 37 ° C sul termomexer a 200 giri / min (1 g) per 4 h. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, mescolare delicatamente il contenuto della camera donatore e ricevente pipettando su e giù 2-3 volte. Pipettare 20 μL aliquote di omogeneate dalle camere donatrici e aggiungere 20 μl di PBS pulito in un tubo da 1,5 ml (1: 1). Allo stesso modo, pipettare 20 μL aliquote di campioni PBS dalle camere ricevitore e aggiungere 20 μL di homogenate pulito (corrispondenza matrice). 8 NOTA: la corrispondenza matrice elimina il nePer 2 curve separate di calibrazione (in omogeneo e PBS) da effettuare per l&#39;analisi quantitativa. Il contenuto della camera donatrice può sedimentarsi nel tempo. Mescolare delicatamente il contenuto pipettando prima di rimuovere le aliquote. </li></ol> 4. Quantificazione LC-MS e analisi dei dati <ol><li> Aggiungere 160 μl di metanolo 1: 1: acetonitrile contenente 500 ng / ml diclofenac o 10 ng / mL verapamil (standard interno) ad ogni tubo e vortex per precipitare le proteine. Centrifugare a 10.000 xg per 5 minuti per sedimentare il precipitato e trasferire i supernatanti in piatti a pozzetto a 96 pozzetti per l&#39;analisi di spettrometria di massa cromatografica-massa (LCMS). 7 </li><li> Creare curve di calibrazione da 1-1.000 nM per ogni composto di prova mantenendo la stessa composizione della matrice come i campioni di cui sopra. Quantificare la concentrazione del composto di prova nei campioni provenienti dalle camere donatori e riceventi utilizzando un metodo LC-MS. </li><li> Calcola la frazione non legata ( f u ) of farmaco nella matrice diluito utilizzando l&#39;equazione 1. Calcolare il f u in matrice diluito con l&#39;equazione 2 (D = fattore di diluizione di 10). 14 <img alt="equazione 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="equazione 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Controllare il recupero (bilancio di massa) di ciascun composto usando l&#39;equazione 3 per identificare i composti con la stabilità / metabolismo / non specifici problemi vincolanti. NOTA: Il recupero di solito cade tra il 70% e il 130%. 15 <img alt="equazione 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

Non ci sono interessi finanziari concorrenti.

lesioni necrotiche polmonari e cavità in pazienti infettati tuberculosis contengono sottopopolazioni di batteri che sono recalcitranti al trattamento farmacologico. I nuclei caseosi di queste strutture sono particolarmente responsabili per ospitare queste persistenti in un ambiente extracellulare. 16 la distribuzione favorevole di agenti anti-batterici in questi luoghi remoti si crede di essere un importante determinante di efficacia della tubercolosi farmaco. Prima della convalida di questo pro...

Il trattamento della malattia della tubercolosi polmonare richiede una distribuzione efficace di farmaci in diversi tipi di lesioni. Le lesioni e le cavità nocrotiche contengono centri caseosi che ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti o &quot;persistenti&quot;. 1 , 2 La malattia cavitaria è associata a tassi di cura inferiori e prognosi scarsa. 3 , 4 Precedenti studi hanno mostrato, utilizzando tecniche quantitative e di imaging, che la capacità di penetrare nel caso è significativamente diversa da una classe di medicinali all&#39;altra. 5 , 6 Questi metodi richiedono tuttavia l&#39;uso di modelli di infezione animale che sono lenti e noiosi. È stato progettato un dosaggio in vitro che misura il legame di farmaci al caso caso ex vivo . Questo legame è stato trovato a correlare inversamente con la penetrazione di farmaci nei granulomi casiosi e, di conseguenza, èUtilizzato come strumento predittivo. 7 La dialisi di equilibrio è considerata come l&#39;approccio standard gold standard per studi di legame proteico plasmatico. Il dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) fornisce un sistema veloce, facile da usare e affidabile per eseguire tali analisi. 8 Il dispositivo è costituito da due componenti: inserti monouso, monouso composti da due camere separate da un cilindro verticale di membrana semipermeabile; E piastre base riutilizzabili che possono contenere fino a 48 inserti alla volta. La membrana di dialisi ha un cut-off di peso molecolare di 8 kDa (MWCO) che è l&#39;ideale per studi di legame con farmaci e macromolecole. L&#39;elevato rapporto superficie / volume del compartimento della membrana consente una rapida dialisi e un equilibratura. Sia gli inserti che la piastra di base sono stati convalidati per un minimo legame non specifico. La combinazione del dispositivo RED con tecniche bioanalitiche fornisce accurate stime delle frazioni non legate di farmaci in pLasma. 8, 9 Sebbene originariamente progettato per misurare proteine ​​plasmatiche, il dispositivo RED è stato utilizzato in vari tessuti studi di binding utilizzando omogenati. 10, 11 In questo protocollo, si misurano farmaco legame caseum, i detriti necrotici asportato dalle lesioni necrotiche e cavità di conigli tubercolosi infettati. La natura acellulare e non vascolare di materiale caseoso è facilissimo omogeneizzare in una sospensione omogenea che è compatibile con il saggio. Dato che caseum è noioso da produrre e difficili da trovare, il protocollo è anche stato convalidato per l&#39;uso con una matrice surrogata che viene preparato da macrofagi schiumosi. THP-1 derivate da monociti macrofagi vengono indotte con acido oleico di accumulare più corpi lipidiche che conferiscono loro aspetto &#39;schiumosa&#39;. Queste cellule lipidiche-caricati vengono raccolte eelaborati per produrre una matrice che usiamo come surrogato caseum. Questo studio ha dimostrato che farmaci legame a questa matrice surrogata correla bene con legame caseum, mimando efficacemente il processo in vivo che ostacola la penetrazione farmaco nel nucleo caseosa di granulomi e cavità.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

L&#39;eradicazione della malattia di tubercolosi richiede regimi farmacologici che possono penetrare negli strati multipli di lesioni polmonari complesse. La distribuzione dei farmaci nei corpi caseosi delle cavità e delle lesioni è particolarmente cruciale perché ospitano sottopopolazioni di batteri tolleranti ai farmaci comunemente indicati come persistenti. I metodi esistenti per la misura della penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi comportano costi costosi e che richiedono molto tempo gli studi farmacocinetici in vivo accoppiati a tecniche bioanalitiche o di imaging. La misura in vitro della legame di farmaci a macromolecole di caso è stata proposta come un&#39;alternativa a tali tecniche in quanto tale legame ostacola la diffusione passiva delle molecole di farmaco attraverso il caso. La dialisi di equilibrio rapido è un sistema veloce e affidabile per eseguire studi di legame tra proteine ​​plasmatiche e tessuti. In questo protocollo abbiamo usato un dispositivo rapido di dialisi di equilibrio (RED) per misurare il legame dei farmaci a homogenati del casoDalle lesioni e dalle cavità dei conigli infetti da tubercolosi. Il protocollo descrive anche come generare una matrice surrogata da macrofagi THP-1 caricati da lipidi da utilizzare in sostituzione del caso. Questo test di associazione di caso / surrogato è uno strumento importante nella scoperta di droga della tubercolosi e può essere adattato per aiutare a studiare la distribuzione dei farmaci nelle lesioni o negli ascessi causati da altre malattie.

Usando questo protocollo, abbiamo testato centinaia di composti di sviluppo della droga della tubercolosi per la loro efficacia prevista a penetrare nel caso. La figura 1 mostra i concetti base del test RED. La membrana di dialisi degli inserti RED permette alle piccole molecole non legate di diffondere dal pozzo del donatore al pozzo del ricevitore, raggiungendo infine un equilibrio tra i due compartimenti. Piccole molecole che sono legate a macromolecole come proteine ...

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An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Qui si descrive un metodo rapido equilibrio di dialisi (RED) per misurare farmaco legame caseum da lesioni tubercolosi polmonare e cavità. Il protocollo viene utilizzato anche con una matrice macrofagi derivato schiumosa che è un surrogato efficace caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

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11.6K Views.  Rutgers.  Qui si descrive un metodo rapido equilibrio di dialisi (RED) per misurare farmaco legame caseum da lesioni tubercolosi polmonare e cavità. Il protocollo viene utilizzato anche con una matrice macrofagi derivato schiumosa che è un surrogato efficace caseum. 

Video: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

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Immunologia e infezioni

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Medicina

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>Saggio di screening ad alto rendimento per Mycobacterium abscessus utilizzando doppi reporter

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Protocollo scalabile di screening farmacologico per la scoperta efficiente dei trattamenti con M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

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Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Spaziali quantificazione delle droghe nelle lesioni di tubercolosi polmonare di Laser Capture Microdissection liquido cromatografia spettrometria di massa (LCM-LC/MS)

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

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