وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منحة HL127711 ل أفك.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

و أكتين المشارك الترسيب الفحص هو تقنية واضحة التي يمكن أن تحدد بسرعة ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين. مع بعض التعديلات، ويمكن أيضا أن تستخدم تقنية لقياس تقارب التفاعل. بالإضافة إلى النقاط التي أثيرت في البروتوكول أعلاه، ينبغي النظر في القضايا التالية عند تصميم وإجراء وتفسير الفحص. بروتين الفائدة بروتين الطازجة أو المجمدة يمكن استخدامها في الفحص. إذا تم استخدام البروتين المجمد، فمن المستحسن أن تتم مقارنة النتائج مع الطازجة (أبدا المجمدة) البروتين لضمان أن التجميد لا يؤثر F- أكتين ملزمة. مصدر أكتين G العديد من التجارب التكوير استخدام G- أكتين معزولة عن العضلات بسبب وفرة النسبية. هناك ثلاثة أنماط أساسية أكتين في الثدييات - ألفا، بيتا وجاما - التي هي مشابهة بشكل ملحوظ (&gt; 90٪ تسلسل إيدنتيتي واي). ومع ذلك، هناك اختلافات وظيفية بين إيزوتيبس 12 ، 13 . إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن يكون إيزوتيب G- أكتين المستخدمة في فحص ملزمة تطابق النمط الظاهري في الجسم الحي . على سبيل المثال، إذا اختبار البروتين أعرب في العضلات والهيكل العظمي، ألفا أكتين هو الخيار الافضل. إذا فحص البروتين أعرب في الخلايا الليفية، ينصح بيتا أكتين. استخدام فالويدين منذ فالويدين يربط F- أكتين، فإنه يمكن أن تتدخل أو حتى منع ربط بعض البروتينات ملزم F- أكتين (على سبيل المثال، كتل فالويدين كوفيلين من ربط خيوط أكتين) 14 . وهكذا، فالويدين ينبغي أن تستخدم بحذر والنتائج مقارنة مع عينات غير فالويدين المعالجة عندما يكون ذلك ممكنا. خلفية عالية ليس من غير المألوف للبروتينات إلى الرواسب في غياب F- أكتين ( الشكل 1A ، لا F- أكتين بيليه عينةق). ومع ذلك، يمكن لمستويات عالية من الترسيب الخلفية أن تخفي ترسيب الأكتين المشترك الحقيقي وتجعل من الصعب، إن لم يكن من المستحيل، تحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين أو لقياس تقارب التفاعل. إضافة بوليديكانول إلى المخزن المؤقت رد فعل (الخطوة 4.1) يمكن أن تقلل بشكل كبير من الخلفية، وهو حل سهل. إذا كان هذا لا يقلل من الخلفية، وضبط المخزن المؤقت رد فعل، تركيز الملح، و / أو درجة حرارة الحضانة قد يساعد. منحنى ملزم لتوليد منحنى ملزمة، فمن الضروري أن تختلف تركيز إما البروتين من الفائدة أو F- أكتين على مدى سلسلة من ردود الفعل. في الممارسة العملية، فإنه من الأسهل والأفضل للحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت وتختلف تركيز البروتين من الفائدة. الحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت (على سبيل المثال، 2 ميكرومتر) في مقايسة تكوير حدود محاصرة غير محددة في تركيزات أعلى من F- أكتين ويمنعإزالة البلمرة في تركيزات أقل من (0.5 ميكرومتر) من F- أكتين. يمكن منع إزالة البلمرة باستخدام فالويدين، على الرغم من أن هذا يدخل عامل تعقيد محتمل في النظام (انظر الخطوة 3.3 وما فوق). كما أن الحفاظ على F-أكتين عند تركيز ثابت يسمح لمقارنة (وتطبيع) بيليه F- أكتين عبر العينات وتحديد التجارب الفاشلة ( أي حيث يكون بيليه F- أكتين متغير بدرجة كبيرة، مما يمنع التحليل عبر التركيزات). وأخيرا، والحفاظ على F- أكتين في تركيز ثابت يسمح واحد لتحديد ما إذا كان ملزم خيوط أكتين تعاونية ( الشكل 1C ). مشبعة ملزمة كما هو الحال في جميع التجارب ملزمة، فمن الأهمية بمكان أن الربط إلى F- الأكتين مشبعة وأن تركيز البروتين زائد الهضاب F- أكتين ( الشكل 1C ). دون هضبة، فإنه ليس من الممكن لحساب ثابت التفكك ثابت ثابت. وهكذا، فإنهمن المهم أن تخطط بعناية لسلسلة التخفيف ليتم اختبارها ودائما تشمل تركيزات أعلى من البروتين ( أي، على الأقل 5- إلى 10 أضعاف أعلى من المتوقع K د ). تحليل ملزم من أجل الثوابت التفكك قياس أن تكون حاسمة، وينبغي إجراء الفحص باستخدام تركيز F- الأكتين الذي يسمح لتركيز مواقع ملزمة على F- أكتين للبروتين من الفائدة لتكون أقل بكثير من تقارب. للتحقق من ما إذا تم استيفاء هذا المعيار، تقدير تركيز مواقع الربط من B ماكس . على سبيل المثال، إذا كان [F- أكتين] 2 ميكرومتر و B ماكس = 0.5، ثم [مواقع ملزمة] ≈ 1 ميكرومتر. وينبغي أن يكون K d على الأقل من 5 إلى 10 أضعاف أكبر من [المواقع الملزمة]. إذا كان المقياس K d من نفس الحجم من حيث [المواقع الملزمة]، فمن الممكن أن يمثل منحنى ملاحظ لوحظ معايرة من عالية تقارب ملزمة سيتيس بدلا من إيسوثرم ملزمة حقيقية. إذا لوحظ هذا، كرر الفحص باستخدام انخفاض 10 أضعاف تركيز F- الأكتين لقياس تقارب دقيق. للتفاعلات عالية تقارب، فالويدين الاستقرار (الخطوة 3.3) قد يكون ضروريا لتحقيق تركيز F- أكتين منخفضة بما فيه الكفاية لقياس تقارب بدقة. وأخيرا، هناك قيود أساسية مع الفحص المشترك الترسيب أن الباحثين يجب أن يكون على بينة من عند إجراء وتقييم الفحص. الأهم من ذلك، فإن مقايسة الترسيب المشترك لا تنتج ثابت التوازن الحقيقي. يتم فصل المنتجات من ملزمة ( أي البروتين زائد F- أكتين) من المواد المتفاعلة أثناء الطرد المركزي، وعندها يمكن للمنتجات ثم فصل لخلق توازن جديد. ونتیجة لذلك، یمکن أن یخطئ مقیاس الترسیب المشترك أو یخفق في الکشف عن التفاعلات المنخفضة الألفة. منذ العديد من البروتينات المرتبطة أكتين لديها تقارب منخفض ( أي، ميكرومولار) ل F- أكتين، نتيجة سلبية ( <eم&gt; أي، لا يمكن الكشف عنها ملزمة) في الفحص لا يعني بالضرورة أن البروتين لا ربط F- أكتين. كبديل، تيرف القائم على الفحص المجهري، وفحوصات واحدة خيوط ملزمة هي أكثر حساسية وأكثر دقة لتحديد ثابت التفكك (للاستعراضات على هذه التقنية، انظر المراجع 15،16 ). وعلى الرغم من هذه القيود، فإن فحص التكوير هو ضمن وسائل معظم الباحثين، وهو أداة فعالة لتحديد ما إذا كان البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل.

أكتين هو بروتين الهيكل الخلوي الضروري الذي يلعب دورا حاسما في العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك الحركة، والانكماش، والتصاق، والتشكل 1 . أكتين موجود في شكلين: أكتين كروي أحادي (G- أكتين) وأكتين بلمرة خيطية (F- أكتين). داخل الخلايا، يتم التحكم في التنظيم F- أكتين من قبل مجموعة كبيرة من البروتينات التي تنظم تنوي، والنمو، عبر ربط وتفكيك شعيرات أكتين 2 ، 3 ، 4 . ومع ذلك، كيف العديد من البروتينات ملزمة أكتين تعمل في الحفل لتنظيم تنظيم شبكة أكتين لا يزال غير واضح إلى حد كبير. قياس التفاعلات البروتين البروتين هو نهج مهم لفهم كيفية بروتينات تمارس آثارها على السلوك الخلوي على مستوى الكيمياء الحيوية. العديد من المقايسات المختلفة يمكن استخدامها للكشف عن التفاعلات بين البروتينات المنقى.وتشمل النهج المشتركة للبروتينات القابلة للذوبان سحب المنسدلة، الاستقطاب مضان، كالوريمتري المعايرة متساوي الحرارة، والرنين بلاسمون السطح. الأهم من ذلك، كل هذه المقايسات تتطلب البروتينات لتكون قابلة للذوبان، وبالتالي من الصعب على التكيف للاستخدام مع البوليمرية، والخيطية البروتين مثل F- أكتين. هنا، نحن تصف تقنية - أكتين المشارك الترسيب، أو التكوير، فحص - لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل. مقايسة التكوير أكتين هي تقنية بسيطة نسبيا التي لا تتطلب معدات متخصصة، وبصرف النظر عن نابذة فائقة السرعة. ويمكن إجراء جميع الكواشف، على افتراض معرفة الكيمياء الحيوية الأساسية، أو شراؤها. مرة واحدة ملزمة ل F- أكتين يتم تأسيسها، ويمكن استخدام مقايسة لقياس تقارب واضح ( أي ثابت التفكك التوازن) 5 . أيضا، مرة واحدة يتم تأسيس تقارب، فحص التكويرهو أداة مفيدة لقياس كيفية التغيرات في البروتين من الفائدة ( أي التعديلات بعد متعدية، الطفرات، أو يجند ملزمة) تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين 6 . تقنية لديها قيود (انظر المناقشة ) أن الباحث يجب أن يكون على بينة من قبل محاولة الفحص.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

وينظم تنظيم أكتين الخيطية (F- أكتين) داخل الخلايا من قبل عدد كبير من البروتينات ملزمة أكتين التي تتحكم في تنوي الأكتين، والنمو، عبر ربط و / أو التفكيك. يصف هذا البروتوكول تقنية - الترسيب المشارك أكتين، أو التكوير، فحص - لتحديد ما إذا كان بروتين أو مجال البروتين يربط F- أكتين وقياس تقارب التفاعل ( أي ثابت التفكك التوازن). في هذه التقنية، يتم تحضين بروتين من الفائدة لأول مرة مع F- أكتين في الحل. ثم، يتم استخدام الطرد المركزي التفاضلي لترسيب خيوط أكتين، ويتم تحليل المواد بيليتد بواسطة سدز-بادج. إذا كان البروتين من الفائدة يربط F- أكتين، وسوف يشارك في الرواسب مع خيوط أكتين. ويمكن قياس المنتجات من رد فعل ملزمة ( أي F- أكتين والبروتين من الفائدة) لتحديد مدى تقارب التفاعل. المقايسة أكتين التكوير هو تقنية واضحة لتحديدإذا كان بروتين من الفائدة يربط F- أكتين ولتقييم كيفية التغييرات في هذا البروتين، مثل يجند ملزمة، تؤثر على تفاعلها مع F- أكتين.

فحصنا αE- كاتينين هوموديمر ملزمة ل F- أكتين في الفحص المشترك الترسيب. منذ التجارب السابقة أظهرت أن تقارب هوموديمير αE- كاتينين ل F- أكتين حوالي 1 ميكرومتر و B ماكس بالقرب 1 11 ، أجرينا الفحص مع تركيز منخفض من F- أكتين (0.2 ميكرومتر بدلا من 2 ميكرومتر، انظر المناقشة). منذ 0.2 ميكرومتر أقل من التركيز الحرج، وأضاف فالويدين لتحقيق الاستقرار في F- أكتين بلمرة من أرنب العضلات والهيكل العظمي G- أكتين (الخطوة 3.3). تم تحضين زيادة تركيزات هوموديمر αE- كاتينين (0.125-12.0 ميكرومتر) في وجود أو غياب 0.2 ميكرومتر F- أكتين. تم طرد العينات، وتم تحليل الكريات الناتجة ( الشكل 1A ). كما هو متوقع، هوموديمر αE- كاتينين المشارك الرسوبي مع F- أكتين فوق الخلفية ( الشكل 1A ، مقارنة عينات بيليه F- أكتين إلى لا F- أسالقصدير بيليه عينات). تم تشغيل بسا كسيطرة سلبية ( الشكل 1B ). تم قياس كمية البروتين وتآمر على البروتين الحر لحساب تقارب التفاعل ( الشكل 1C ). البيانات تآمر أفضل تناسب معادلة هيل. وكان K د المحسوب 2.9 ميكرومتر، وكان B ماكس 0.2، وكان معامل هيل (ح) 4.8. وهكذا، αE- كاتينين هوموديمر يربط F- أكتين بشكل تعاوني مع تقارب ميكرومولار منخفضة، بما يتفق مع العمل السابق (K د من 2.9 ميكرومتر مقابل ~ 1.0 ميكرومتر) 11 . <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> الشكل 1: عالية السرعة F- أكتين المشارك الترسيب الفحص. ( أ ) زيادة التركيز (0.125-12.0 ميكرومتر) من هوموديمر αE- كاتينين مع (لوحات اليسار) أو بدون (لوحات اليمنى) 0.2 ميكرومتر F- أكتين استقرت مع فالويدين. تم احتضانهم لمدة 30 دقيقة في رت والطرد المركزي. تم فصل مجموع (7.5٪ من المواد بدءا) والمواد بيليتد (50٪ من المواد بيليه) من قبل سدز-بادج وملطخة صبغ كوماسي. ( B ) تم تشغيل 4 ميكرومتر بسا كسيطرة سلبية. تم فصل مجموع وبيليه العينات، مع (+) أو بدون (-) F- أكتين، سدز-بادج وملطخة صبغ كوماسي. ( C ) ملزمة αE- كاتينين (μM / ميكرومتر أكتين) من A تم تآمر ضد αE- كاتينين الحرة (μM)، والبيانات تناسب معادلة هيل (الخط الأحمر). يتم سرد K د ، B ماكس ، ومعامل هيل (ح). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> الشكل 2: أكتين التكوير الكمي </sترونغ&gt; - الرسم البياني. ويوضح هذا التخطيطي الخطوات الرئيسية في القسم 5، مع أمثلة من عينات توتال وبيليه ( A ، سي) والمنحنى القياسي ( B ) المستخدمة في القياس الكمي. 5.13 الخطوات: 1 ) قياس كمية البروتين من الفائدة في مجموع العينات (A). 2 ) توليد منحنى القياسية عن طريق التآمر كثافة الفرقة مقابل كتلة البروتين (B). 3 ) قياس كمية البروتين من الفائدة التي شاركت في الرسوبيات مع F- أكتين ( C ). 4 ) قياس كمية البروتين من الفائدة التي بيليتد في غياب F- أكتين ( D ). 5 ) طرح D من C لتحديد كمية البروتين ملزمة F- أكتين. 6 ) قياس كمية F- أكتين في كل بيليه (E)، وحساب متوسط ​​كمية F- أكتين لكل عينة، وتقسيم كل عينة حسب المتوسط ​​(الأرقام أدناه تظهر النسبة). 7 )لكل عينة، وتقسيم كمية البروتين ملزمة (المحسوبة في الخطوة 5) من قبل F- أكتين بيليه نسبة (المحسوبة في الخطوة 6) لضبط الاختلافات في بيليه. 8 ) استخدام منحنى القياسية ( B ) لحساب كمية (كتلة) من البروتين ملزمة تطبيع في كل عينة (الخطوة 7). 9 ) تحديد تركيز البروتين الحرة والبروتين ملزمة لخلق منحنى ملزمة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation at JoVE.com

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

يصف هذا البروتوكول طريقة لاختبار قدرة البروتين للمشاركة في الرواسب مع أكتين الخيطية (F- أكتين)، وإذا لوحظ ملزم، لقياس تقارب التفاعل.

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K Views.  University of Pittsburgh School of Medicine.  يصف هذا البروتوكول طريقة لاختبار قدرة البروتين للمشاركة في الرواسب مع أكتين الخيطية (F- أكتين)، وإذا لوحظ ملزم، لقياس تقارب التفاعل. 

Video: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

تباين الخواص مضان كأداة لدراسة التفاعلات البروتين البروتين

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

الترسيب التوازن من البروتين غشاء صغير قليل وحدات تشكيل: تأثير الحامض الأميني إضافة بروتون على Pentameric الاستقرار

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Chemistry

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biology

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

من بقعة 2DE جل لوظيفة البروتين: الدرس المستفاد من HS1 في سرطان الدم الليمفاوي المزمن

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medicine

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

التقييم السريع لجودة البروتين الغشائي بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد حجم الفلورسنت

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

إعادة تكوين الحركة القائمة على الأكتين مع البروتينات المتاحة تجاريا

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Bioengineering

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ البلمرة فحوصات: بروتوكولات بسيطة واعتبارات

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

القياس الكمي القائم على التصوير أحادي الجزيء للخلية الحية لتفاعلات البروتين

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

تسليط الضوء على المؤلف: تقييم ديناميكيات مكثفات البروتين في الخلايا البشرية الحية

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

قياس جزيء واحد لديناميكيات تفاعل البروتين داخل المكثفات الجزيئية الحيوية

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...