이 연구는 National Institutes of Health Grant HL127711에 의해 AVK에 의해 지원되었습니다.

<ol>
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저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

액틴 동시 침강 분석은 단백질이 F- 액틴에 결합하는지 신속하게 결정할 수있는 직접적인 기술입니다. 약간의 변경을 가하면이 기법을 사용하여 상호 작용의 친 화성을 측정 할 수도 있습니다. 위의 프로토콜에서 제기 된 점 외에도 분석을 디자인, 실시 및 해석 할 때 다음 사항을 고려해야합니다. 관심있는 단백질 신선하게 준비되거나 동결 된 단백질을 분석에 사용할 수 있습니다. 동결 단백질이 사용되는 경우 동결이 F- 액틴 바인딩에 영향을 미치지 않는지 확인하기 위해 결과를 신선한 (결코 동결되지 않은) 단백질과 비교하는 것이 좋습니다. G- 액틴 소스 많은 pelleting 실험은 G-actin을 상대적으로 풍부하기 때문에 근육에서 분리하여 사용합니다. 포유류에서 알파, 베타 및 감마와 같은 세 가지 주된 액틴 이소 타입이 있습니다 (90 % 이상의 서열 식별 기호ty). 그럼에도 불구하고 isotypes 12 , 13 에는 기능적 차이가 있습니다. 가능한 경우, 결합 분석에서 사용되는 G- 액틴 이소 타입 은 생체 내 아이소 타입과 일치해야합니다. 예를 들어, 골격근에서 발현 된 단백질을 테스트 할 경우 알파 - 굴지가 최선의 선택입니다. 섬유 아세포에서 발현되는 단백질을 검사 할 경우 베타 - 액틴 (beta-actin)을 권장합니다. Phalloidin 사용 Phalloidin은 F-actin과 결합하기 때문에 일부 F-actin 결합 단백질 ( 예 : phalloidin 블록 cofilin과 actin 필라멘트의 결합) 14의 결합을 방해하거나 차단할 수 있습니다. 따라서, phalloidin은 조심해서 사용해야하며 가능한 경우 phalloidin으로 처리하지 않은 샘플과 비교합니다. 높은 배경 단백질이 F- 액틴의 부재하에 침전되는 것은 드문 일이 아닙니다 ( 그림 1A , F- 액틴 펠렛 샘플 없음에스). 그러나 높은 수준의 백그라운드 침전은 진정한 액틴 동시 침강을 가려 낼 수 있으며 불가능하지는 않더라도 단백질이 F- 액틴에 결합하는지 또는 상호 작용의 친화력을 측정 하는지를 결정하는 것을 어렵게 만듭니다. 폴리 디카 놀을 반응 완충액 (단계 4.1)에 첨가하면 배경을 상당히 감소시킬 수 있고 쉬운 해결책이다. 그것이 배경을 감소시키지 않는다면, 반응 완충액, 소금 농도 및 / 또는 배양 온도를 조정하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 제본 곡선 결합 곡선을 생성하기 위해서는, 일련의 반응에 대해 관심있는 단백질 또는 F- 악틴의 농도를 변화시키는 것이 필요하다. 실제로, 고정 농도에서 F- 액틴을 유지하고 관심있는 단백질의 농도를 변화시키는 것이 더 쉽고 바람직하다. pelleting 분석에서 고정 농도 ( 예 : 2 μM)에서 F-actin을 유지하면 고농도의 F-actin 농도에서 비특이적 트래핑이 제한되어 예방됩니다F-actin 농도가 낮은 (&lt;0.5 μM) 경우 해중합. Phalloidin을 사용하여 해중합을 막을 수는 있지만, 이것은 시스템에 잠재적 인 복잡 요인을 유발합니다 (3.3 단계 이상 참조). 고정 농도에서 F - 굴지 유지는 또한 샘플을 통해 F - 액틴 펠렛을 비교 (그리고 정상화)하고 실패한 실험 ( 즉, F - 액틴 펠렛은 매우 가변적이어서 농도에 따른 분석을 막음)을 식별 할 수 있습니다. 마지막으로, 고정 농도에서 F- 굴지를 유지하면 액틴 필라멘트에 대한 결합이 협동인지를 결정할 수 있습니다 ( 그림 1C ). 포화 바인딩 모든 결합 실험에서와 같이, F- 액틴에 대한 결합이 포화되어 있고 단백질 + F- 액틴 플러스의 농도가 중요합니다 ( 그림 1C ). 고원이 없으면 정확한 해리 평형 상수를 계산할 수 없습니다. 따라서,시험 할 희석 시리즈를주의 깊게 계획하고 항상 더 높은 농도의 단백질을 포함하는 것이 중요합니다 ( 예 : 예상 Kd보다 적어도 5 ~ 10 배 이상). 바인딩 분석 측정 된 해리 상수가 결정적이기 위해서는, 관심 단백질에 대한 F-actin상의 결합 부위의 농도가 친 화성보다 훨씬 낮아지는 F- 액틴 농도를 사용하여 분석을 수행해야합니다. 이 기준이 충족되었는지 여부를 확인하려면 Bmax에서 결합 사이트의 농도를 추정하십시오. 예를 들어 [F- 액틴]이 2 μM이고 Bmax = 0.5 인 경우 [결합 부위]는 약 1 μM입니다. K d 는 [결합 부위]보다 적어도 5 내지 10 배 더 커야한다. 측정 된 K d 가 [결합 부위]와 동일한 정도의 크기라면, 관찰 된 결합 곡선은 고친 화성 결합 si의 적정을 나타내는 것이 가능하다tes보다는 진정한 구속 isotherm. 이것이 관찰되면 정확한 친화도를 측정하기 위해 10 배 낮은 F-actin 농도를 사용하여 분석을 반복하십시오. 고친 화성 상호 작용의 경우, phalloidin 안정화 (단계 3.3)는 정확하게 친화도를 측정 할만큼 충분히 낮은 F- 액틴 농도를 달성하는 데 필요할 수 있습니다. 마지막으로, 분석을 수행하고 평가할 때 연구자가 알아야 할 공동 침강 분석의 근본적인 한계가 있습니다. 가장 중요한 것은 공 침강 분석이 진정한 평형 상수를 생성하지 않는다는 것입니다. 원심 분리 과정에서 결합 생성물 ( 즉, 단백질 + F- 액틴)이 반응물과 분리되면 생성물은 해리되어 새로운 평형을 생성 할 수 있습니다. 결과적으로, co-sedimentation assay는 낮은 친화도의 상호 작용을 오산하거나 잘못 검출 할 수 있습니다. 많은 액틴 결합 단백질은 F- 액틴에 대해 낮은 ( 즉, 마이크로 몰러) 친화력을 가지므로, 부정적인 결과 ( <e즉, 검출 할 수없는 결합)이 반드시 단백질이 F- 액틴에 결합하지 않는다는 것을 의미하는 것은 아니다. 대안으로, TIRF 현미경 기반의 단일 필라멘트 결합 분석법은 해리 상수를 결정할 때보다 민감하고 정확합니다 (이 기술에 대한 리뷰, 참고 자료 15,16 참조). 이러한 제한에도 불구하고, pelleting 분석은 대부분의 연구자의 수단에 속하며 단백질이 F-actin에 결합하는지 여부와 상호 작용의 친 화성을 측정 할 수있는 효과적인 도구입니다.

액틴은 운동성, 수축, 접착 및 형태학을 포함한 여러 세포 과정에서 중요한 역할을하는 필수적인 세포 골격 단백질입니다 1 . 액틴은 단구 구형 액틴 (G- 액틴)과 중합 된 사상 액틴 (F- 액틴)의 두 가지 형태로 존재합니다. 세포 내에서 F- 액틴 조직은 액틴 필라멘트 2 , 3 , 4 의 핵 형성, 성장, 가교 결합 및 분해를 조절하는 많은 단백질 모음에 의해 제어됩니다. 그러나 액틴 네트워크 구성을 조절하기 위해 여러 가지 액틴 결합 단백질이 함께 작용하는 방식은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 단백질 - 단백질 상호 작용의 측정은 단백질이 생화학 적 수준에서 세포 행동에 미치는 영향을 이해하는 중요한 접근법입니다. 많은 다른 assays는 정제 된 단백질 간의 상호 작용을 감지하는 데 사용할 수 있습니다.가용성 단백질에 대한 일반적인 접근법에는 풀다운, 형광 편광, 등온 적정 열량계 및 표면 플라스 몬 공명이 포함됩니다. 중요한 것은, 이들 모든 분석법은 단백질이 용해 될 것을 요구하기 때문에, F- 굴지와 같은 고분자 필라멘트 단백질을 사용하기에 적응하기가 어렵습니다. 여기서 우리는 단백질 또는 단백질 도메인이 F- 액틴에 결합하는지 여부를 결정하고 상호 작용의 친화도를 측정하기위한 기술인 액틴 동시 침강 (actin co-sedimentation) 또는 펠렛 (pelleting) 분석을 설명합니다. 액틴 펠릿 법은 초 원심 분리기를 제외하고 특수 장비가 필요없는 비교적 간단한 기술입니다. 모든 시약은 기본 생화학 지식을 전제로하여 만들거나 구입할 수 있습니다. F - 굴지에 바인딩되면, 분석은 겉보기 친화력 ( 즉, 해리 평형 상수) 5 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 일단 친화력이 확립되면, 펠릿 화 분석법는 관심 단백질 ( 예 : 번역 후 변형, 돌연변이 또는 리간드 결합)이 F- 액틴 6 과 어떻게 상호 작용 하는지를 측정하는 유용한 도구입니다. 이 기법은 분석을 시도하기 전에 연구자가 알아야 할 한계가 있습니다 (토론 참조).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

세포 내에서 필라멘트 액틴 (F- 굴지) 조직은 액틴 핵 생성, 성장, 가교 결합 및 / 또는 분해를 조절하는 다수의 액틴 결합 단백질에 의해 조절된다. 이 프로토콜은 단백질 또는 단백질 도메인이 F- 액틴에 결합하는지 여부를 결정하고 상호 작용의 친 화성 ( 즉, 해리 평형 상수)을 측정하는 기술 - 액틴 동시 침강, 또는 펠렛 화 - 분석을 설명합니다. 이 기술에서 관심 단백질은 먼저 용액 내 F- 굴지와 함께 배양됩니다. 이어서, 차동 원심 분리를 사용하여 액틴 필라멘트를 침전시키고, 펠릿 화 된 물질을 SDS-PAGE로 분석한다. 해당 단백질이 F- 액틴에 결합하면 액틴 필라멘트와 함께 침강합니다. 결합 반응의 생성물 ( 즉, F- 액틴 및 관심 단백질)은 상호 작용의 친화력을 결정하기 위해 정량화 될 수있다. 액틴 펠릿 화 분석법은관심 단백질이 F- 액틴에 결합하고 리간드 결합과 같은 단백질의 변화가 F- 액틴과 어떻게 상호 작용하는지 평가할 수 있습니다.

우리는 co-sedimentation assay에서 F-actin에 결합하는 α-catenin homodimer를 검사했다. 과거의 실험은 F - 굴지에 대한 αE - catenin 동종 이합체의 친화도가 약 ​​1 μM이고 Bmax가 1 11 근처임을 보여 주었기 때문에, 우리는 낮은 농도의 F- 액틴 (0.2 μM보다는 2 μM; 토론). 0.2 μM이 임계 농도보다 낮기 때문에 phalloidin을 첨가하여 토끼 골격근 G-actin (단계 3.3)에서 중합 된 F-actin을 안정화시켰다. 증가하는 농도의 α-catenin homodimer (0.125-12.0 μM)를 0.2 μM F-actin의 존재 또는 부재 하에서 배양 하였다. 샘플을 원심 분리하고 결과물 인 펠렛을 분석 하였다 ( 그림 1A ). 예상대로 α-catenin 동종 이합체가 배경 위에 F- 액틴과 함께 침강 ( 그림 1A , F- 액틴 펠렛 샘플을 F-AC와 비교 함)주석 펠릿 샘플). BSA는 음성 대조군으로 수행되었다 ( 그림 1B ). 바운드 단백질을 정량하고 자유 단백질에 플롯하여 상호 작용의 친 화성을 계산했습니다 ( 그림 1C ). 플롯 된 데이터는 Hill 방정식에 가장 잘 맞습니다. 계산 된 Kd는 2.9 μM, Bmax는 0.2, Hill 계수 (h)는 4.8이었다. 따라서, αE - catenin 동종 이합체는 이전의 연구 (~ 1.0 μm의 대 2.9 μm의)와 일치, 낮은 micromolar 친화력과 협조 F - 굴지에 바인딩 11 . <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> 그림 1 : 고속 F- 액틴 동시 침전 분석. ( A ) 증가하는 농도 (0.125-12.0 μM)의 αE-catenin homodimer를 phalloidi로 안정화 된 0.2 μM F-actin (왼쪽 패널) 또는없는 (오른쪽 패널) 배양 하였다엔. 그들은 RT에서 30 분 동안 배양하고 원심 분리시켰다. 총 (출발 물질의 7.5 %) 및 펠릿 화 된 물질 (펠릿 화 된 물질의 50 %)을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염료로 염색 하였다. ( B ) 4 μM BSA를 음성 대조군으로 사용 하였다. F- 악틴이있는 (+) 또는없는 (-) 총 및 펠릿 샘플을 SDS-PAGE로 분리하고 쿠마시 염료로 염색 하였다. ( C ) 자유 αE - catenin (μM)에 대해 A로부터 결합 된 αE-catenin (μM / μM actin)을 나타내었고, Hill 방정식 (적색선)에 적합 하였다. K d , B max 및 Hill 계수 (h)가 나열됩니다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> 그림 2 : 액틴 펠릿 화 정량화 </strong&gt; - 순서도. 이 도식은 총계 및 펠렛 샘플 ( A , CE ) 및 정량화에 사용되는 표준 곡선 ( B )의 예와 함께 섹션 5의 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 5.13 단계 : 1 ) 총 시료 (A)에서 관심 단백질의 양을 측정합니다. 2 ) 단백질 강도 (B) 대 밴드 강도를 플로팅하여 표준 곡선을 생성합니다. 3 ) F - 굴지 ( C )와 함께 침전 된 관심 단백질의 양을 측정합니다. 4 ) F - 굴지 ( D )의 부재에서 pelleted 관심 단백질의 양을 측정합니다. 5 ) F를 액틴에 결합하는 단백질의 양을 결정하기 위해 C에서 D를 뺍니다. 6 ) 각 펠렛 (E)에서 F- 액틴의 양을 측정하고, 샘플 당 F- 액틴의 평균 양을 계산하고, 평균으로 각 샘플을 나눕니다 (아래 숫자는 비율을 나타냄). 7 )각 샘플에 대해 펠렛의 차이를 조정하기 위해 결합 된 단백질의 양 (단계 5에서 계산)을 F- 액틴 펠릿 비율 (단계 6에서 계산)로 나눕니다. 8 ) 표준 곡선 ( B )를 사용하여 각 샘플에서 표준화 된 결합 단백질의 양 (질량)을 계산합니다 (단계 7). 9 ) 결합 곡선을 만들기 위해 유리 단백질과 결합 단백질의 농도를 결정하십시오. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

이 프로토콜은 필라멘트 액틴 (F - 굴지)과 함께 공동 침강하는 단백질의 능력을 테스트하는 방법을 설명하고, 바인딩이 관찰되면 상호 작용의 친화력을 측정하는 방법을 설명합니다.

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K 조회수.  University of Pittsburgh School of Medicine.  이 프로토콜은 필라멘트 액틴 (F - 굴지)과 함께 공동 침강하는 단백질의 능력을 테스트하는 방법을 설명하고, 바인딩이 관찰되면 상호 작용의 친화력을 측정하는 방법을 설명합니다. 

비디오: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

연구

생화학

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

생체 외에서 F-말라 초기 Endosomes에의 합

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

측정 및 해석의 전체 산소 소비 속도 비행 머리 세그먼트

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...