Name: measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation
Uploaded: 2017-05-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
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Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant HL127711 para AVK.

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	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. 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Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O ensaio de co-sedimentação de actina é uma técnica direta que pode determinar rapidamente se uma proteína se liga à F-actina. Com algumas modificações, a técnica também pode ser usada para medir a afinidade da interação. Além dos pontos levantados no protocolo acima, as questões a seguir devem ser consideradas ao projetar, conduzir e interpretar o ensaio. Proteína de Interesse Pode utilizar-se uma proteína recentemente preparada ou congelada no ensaio. Se for utilizada proteína congelada, recomenda-se que os resultados sejam comparados com proteínas frescas (nunca congeladas) para assegurar que o congelamento não afecte a ligação da F-actina. G-actina Fonte Muitas experiï¿½cias de granulaï¿½o utilizam G-actina isolada do mï¿½culo devido ï¿½sua abundï¿½cia relativa. Existem três principais isotipos de actina em mamíferos - alfa, beta e gama - que são notavelmente semelhantes (&gt; 90%Ty). No entanto, existem diferenças funcionais entre os isotipos 12 , 13 . Se possível, o isotipo G-actina utilizado no ensaio de ligação deve corresponder ao isotipo in vivo . Por exemplo, se testar uma proteína expressa no músculo esquelético, alfa-actina é a melhor escolha; Se examinar uma proteína expressa em fibroblastos, beta-actina é recomendada. Uso de Phalloidin Uma vez que a faloidina se liga à F-actina, pode interferir ou mesmo bloquear a ligação de algumas proteínas de ligação a F-actina ( por exemplo, a faloidina bloqueia a cofilina da ligação a filamentos de actina) 14 . Assim, phalloidin deve ser usado com cautela e os resultados em comparação com não-phalloidin-tratados amostras quando possível. Fundo alto Não é raro que as proteínas se sedimentem na ausência de F-actina ( Figura 1A , nenhuma amostra de peletes de F-actinaS). No entanto, níveis elevados de sedimentação de fundo podem mascarar a verdadeira co-sedimentação de actina e tornar difícil, se não impossível, determinar se uma proteína se liga à F-actina ou medir a afinidade da interação. Adicionar polidicanol ao tampão de reacção (passo 4.1) pode reduzir significativamente o fundo e é uma solução fácil. Se isso não reduzir o fundo, o ajuste do tampão de reação, da concentração de sal e / ou da temperatura de incubação pode ajudar. Curva de encadernação Para gerar uma curva de ligação, é necessário variar a concentração quer da proteína de interesse quer da F-actina através de uma série de reacções. Na prática, é mais fácil e preferível manter F-actina numa concentração fixa e variar a concentração da proteína de interesse. A manutenção da F-actina numa concentração fixa ( por exemplo, 2 μM) no ensaio de peletização limita a captura não específica em concentrações mais elevadas de F-actina e impedeDepolimerização a concentrações mais baixas (&lt;0,5 μM) de F-actina. A despolimerização pode ser prevenida usando phalloidin, embora isto introduza um fator de complicação potencial no sistema (veja o passo 3.3 e acima). A manutenção da F-actina numa concentração fixa também permite comparar (e normalizar) a pastilha de actina F entre amostras e identificar experiências falhadas ( isto é, onde a pastilha de actina F é altamente variável, impedindo a análise entre concentrações). Finalmente, manter F-actina numa concentração fixa permite determinar se a ligação ao filamento de actina é cooperativa ( Figura 1C ). Ligação saturada Tal como em todas as experiências de ligação, é crítico que a ligação à F-actina esteja saturada e que a concentração de proteína mais platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sem um platô, não é possível calcular uma constante de equilíbrio de dissociação precisa. Assim,É importante planejar cuidadosamente a série de diluição a ser testada e sempre incluir concentrações mais altas de proteína ( ou seja, pelo menos 5- a 10 vezes maior do que o esperado K d ). Análise de ligação Para que as constantes de dissociação medidas sejam conclusivas, o ensaio deve ser realizado utilizando uma concentração de actina F que permita que a concentração dos locais de ligação na actina F para a proteína de interesse seja muito mais baixa do que a afinidade. Para verificar se este critério foi atingido, estimar a concentração de locais de ligação de B max . Por exemplo, se [F-actina] fosse 2 μM e Bmax = 0,5, então [locais de ligação] ≈ 1 μM. O Kd deve ser pelo menos 5- a 10 vezes maior do que [locais de ligação]. Se o Kd medido é da mesma ordem de grandeza que [locais de ligação], então é possível que a curva de ligação observada represente uma titulação de ligação de alta afinidade siEm vez de uma verdadeira isoterma de ligação. Se isto for observado, repetir o ensaio usando uma concentração de F-actina 10 vezes menor para medir uma afinidade precisa. Para interações de alta afinidade, a estabilização da faloidina (etapa 3.3) pode ser necessária para se obter uma concentração de F-actina suficientemente baixa para medir com precisão a afinidade. Finalmente, existem limitações fundamentais com o ensaio de co-sedimentação que os pesquisadores devem estar cientes de quando realizar e avaliar o ensaio. Mais importante ainda, o ensaio de co-sedimentação não produz uma verdadeira constante de equilíbrio. Os produtos de ligação ( isto é, proteína mais F-actina) são separados dos reagentes durante a centrifugação, após o que os produtos podem então dissociar-se para criar um novo equilíbrio. Como resultado, o ensaio de co-sedimentação pode calcular mal ou não detectar interacções de baixa afinidade. Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade baixa ( isto é, micromolar) para a actina F, um resultado negativo ( <eM&gt; isto é, nenhuma ligação detectável) no ensaio não significa necessariamente que uma proteína não se liga à F-actina. Como alternativa, os ensaios de ligação de filamento único com base em microscopia TIRF são mais sensíveis e mais precisos para determinar uma constante de dissociação (para revisões nesta técnica, ver referências 15 , 16 ). Apesar destas limitações, o ensaio de granulação está dentro dos meios da maioria dos investigadores e é uma ferramenta eficaz para determinar se uma proteína liga F-actina e para medir a afinidade da interacção.

A actina é uma proteína essencial do citoesqueleto que desempenha um papel crítico em múltiplos processos celulares, incluindo motilidade, contração, adesão e morfologia 1 . A actina existe em duas formas: actina globular monomérica (G-actina) e actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro das células, a organização da F-actina é controlada por uma grande coleção de proteínas que regulam a nucleação, crescimento, reticulação e desmontagem dos filamentos de actina 2 , 3 , 4 . No entanto, como múltiplas proteínas de ligação de actina funcionam em conjunto para regular a organização da rede de actina ainda não está bem esclarecida. A medição das interações proteína-proteína é uma abordagem importante para entender como as proteínas exercem seus efeitos sobre o comportamento celular ao nível bioquímico. Muitos ensaios diferentes podem ser utilizados para detectar interacções entre proteínas purificadas.Abordagens comuns para proteínas solúveis incluem pull-downs, polarização de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica e ressonância de plasmão de superfície. É importante notar que todos estes ensaios requerem que as proteínas sejam solúveis e são, portanto, difíceis de adaptar para utilização com uma proteína polimérica, filamentosa tal como F-actina. Aqui, descrevemos uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou granulação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio se liga F-actina e para medir a afinidade da interação. O ensaio de peletização de actina é uma técnica relativamente simples que não requer equipamento especializado, além de uma ultracentrífuga. Todos os reagentes podem ser feitos, assumindo conhecimentos de bioquímica básica, ou adquiridos. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, o ensaio pode ser utilizado para medir a afinidade aparente ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação) 5 . Além disso, uma vez estabelecida a afinidade, o ensaio de peletizaçãoÉ uma ferramenta útil para medir como alterações na proteína de interesse ( isto é , modificações pós-translacionais, mutações, ou ligação de ligando) afetam sua interação com F-actina 6 . A técnica tem limitações (ver a Discussão ) que o pesquisador deve estar ciente antes de tentar o ensaio.

<table><tbody><tr><td>Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46960</td><td></td></tr><tr><td>S100-AT3 rotor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45585</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge tubes - 0.2 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45233</td><td></td></tr><tr><td>Actin, rabbit skeletal muscle</td><td>Cytoskeleton</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A8531</td><td></td></tr><tr><td>Polidicanol (Thesit)&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>88315</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3457</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0862</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine triphosphate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride (MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol-bis(&amp;beta;-aminoethyl ether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>Sigma</td><td>3779</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey CLx Imaging System</td><td>LI-COR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal Blue Staining Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC6025</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

A organização de actina filamentosa (F-actina) dentro das células é regulada por um grande número de proteínas de ligação à actina que controlam a nucleação, crescimento, reticulação e / ou desmontagem da actina. Este protocolo descreve uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou sedimentação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio liga F-actina e medir a afinidade da interação ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação). Nesta técnica, uma proteína de interesse é primeiro incubada com F-actina em solução. Em seguida, utiliza-se a centrifugação diferencial para sedimentar os filamentos de actina, e o material peletizado é analisado por SDS-PAGE. Se a proteína de interesse se liga à F-actina, co-sedimentará com os filamentos de actina. Os produtos da reacção de ligação ( isto é, F-actina e a proteína de interesse) podem ser quantificados para determinar a afinidade da interacção. O ensaio de peletização de actina é uma técnica simples para determinarSe uma proteína de interesse se liga a F-actina e para avaliar como as alterações a essa proteína, tais como a ligação do ligando, afectam a sua interacção com F-actina.

Examinámos a ligação do homodímero de αE-catenina à actina F no ensaio de co-sedimentação. Uma vez que experiências anteriores demonstraram que a afinidade do homodímero de αE-catenina para a actina F é de cerca de 1 μM e do B max próximo de 11 , realizámos o ensaio com uma concentração baixa de actina F (0,2 μM em vez de 2 μM; a discussão). Uma vez que 0,2 μM está abaixo da concentração crítica, a faloidina foi adicionada para estabilizar a F-actina polimerizada a partir da G-actina de músculo esquelético de coelho (passo 3.3). Incubaram-se concentrações crescentes de homodímero de cE-catenina (0,125-12,0 uM) na presença ou na ausência de actina F 0,2 uM. As amostras foram centrifugadas, e as pastilhas resultantes foram analisadas ( Figura 1A ). Conforme esperado, o homodímero de αE-catenina co-sedimentado com F-actina acima do fundo ( Figura 1A , compara as amostras de pastilhas de F-actina com o não-F-acAmostras de pellet de estanho). A BSA foi executada como um controlo negativo ( Figura 1B ). A proteína ligada foi quantificada e plotada sobre proteína livre para calcular a afinidade da interacção ( Figura 1C ). Os dados traçados correspondem melhor a uma equação de Hill. O Kd calculado foi 2,9 μM, o Bmax foi 0,2, eo coeficiente de Hill (h) foi 4,8. Assim, o homodímero de αE-catenina liga F-actina cooperativamente com uma baixa afinidade micromolar, consistente com o trabalho anterior (um Kd de 2,9 μM contra ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Ensaio de co-sedimentação de F-actina de alta velocidade. ( A ) Concentrações crescentes (0,125-12,0 μM) de homodímero de αE-catenina foram incubadas com (painéis esquerdos) ou sem (painéis direitos) F-actina 0,2 μM estabilizada com phalloidiN. Incubaram-se durante 30 min à RT e centrifugaram-se. O total (7,5% do material de partida) e o material peletizado (50% do material peletizado) foram separados por SDS-PAGE e corados com corante de Coomassie. ( B ) 4 μM BSA foi executado como um controlo negativo. As amostras totais e em pellets, com (+) ou sem (-) F-actina, foram separadas por SDS-PAGE e coradas com corante de Coomassie. ( C ) Ligou-se αE-catenina (μM / μM de actina) a partir de A contra cE-catenina livre (μM), e os dados encaixam-se numa equação de Hill (linha vermelha). Os coeficientes Kd, Bmax e Hill (h) estão listados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação de peletização de actina </sTrong&gt; - fluxograma. Este esquema descreve as etapas chave na seção 5, com exemplos de amostras de Total e Pellet ( A , CE ) e a curva padrão ( B ) usada para quantificação. 5.13 etapas: 1 ) Medir a quantidade de proteína de interesse nas amostras totais (A). 2 ) Gerar uma curva padrão, traçando a intensidade da banda versus a massa da proteína (B). 3 ) Meça a quantidade de proteína de interesse co-sedimentada com F-actina ( C ). 4 ) Meça a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina ( D ). 5 ) Subtrair D de C para determinar a quantidade de proteína ligada a F-actina. 6 ) Medir a quantidade de F-actina em cada pellet (E), calcular a quantidade média de F-actina por amostra e dividir cada amostra pela média (os números abaixo mostram a razão). 7 )Para cada amostra, divida-se a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5) pela razão de peletes de F-actina (calculada no passo 6) para ajustar as diferenças no grânulo. 8 ) Utilizar a curva padrão ( B ) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada em cada amostra (passo 7). 9 ) Determine a concentração de proteína livre e proteína ligada para criar uma curva de ligação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção.

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.4K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção. 

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropia de fluorescência como uma ferramenta para estudar as interações proteína-proteína

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Bioquímica

Sedimentation Equilibrium of a Small Oligomer-forming Membrane Protein: Effect of Histidine Protonation on Pentameric Stability

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and under physiological conditions. This makes AUC a method of choice to quantitatively assess stoichiometry and thermodynamics of homo- and hetero-association that are transient and reversible in biochemical processes. In the modality of sedimentation equilibrium (SE), a balance between diffusion and sedimentation provides a profile as a function of radial distance that depends on a specific association model. Herein, a detailed SE protocol is described to determine the size and monomer-monomer association energy of a small membrane protein oligomer using an analytical ultracentrifuge. AUC-ES is label-free, only based on physical principles, and can be used on both water soluble and membrane proteins. An example is shown of the latter, the small hydrophobic (SH) protein in the human respiratory syncytial virus (hRSV), a 65-amino acid polypeptide with a single &#945;-helical transmembrane (TM) domain that forms pentameric ion channels. NMR-based structural data shows that SH protein has two protonatable His residues in its transmembrane domain that are oriented facing the lumen of the channel. SE experiments have been designed to determine how pH affects association constant and the oligomeric size of SH protein. While the pentameric form was preserved in all cases, its association constant was reduced at low pH. These data are in agreement with a similar pH dependency observed for SH channel activity, consistent with a lumenal orientation of the two His residues in SH protein. The latter may experience electrostatic repulsion and reduced oligomer stability at low pH. In summary, this method is applicable whenever quantitative information on subtle protein-protein association changes in physiological conditions have to be measured.&#160;&#160;

Sedimentation equilibrium (SE) can be used to study protein-protein interactions in a physiological environment. This manuscript describes the use of this technique to determine the effect of pH on the stability of a homo-pentamer formed by the small hydrophobic (SH) protein encoded by the human syncytial respiratory virus (hRSV).

A sedimentação de equilíbrio de uma proteína de membrana de formação de oligómero pequeno: Efeito de Histidina A protonação em pentamérica Estabilidade

Analytical ultracentrifugation (AUC) can be used to study reversible interactions between macromolecules over a wide range of interaction strengths and ...

Química

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Ensaio Co Sedimentação; para a Análise da proteína de ligação a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Biologia

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Um ensaio de espectroscopia de flutuação de fluorescência das interações da proteína-proteína em contatos do celular

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

From a 2DE-Gel Spot to Protein Function: Lesson Learned From HS1 in Chronic Lymphocytic Leukemia

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a consequence, for the clinical management of patients. In the present work we will describe an optimized proteomic approach for the identification of molecules involved in the progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). In detail, leukemic cell lysates are resolved by 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and visualized as &#8220;spots&#8221; on the 2DE gels. Comparative analysis of proteomic maps allows the identification of differentially expressed proteins (in terms of abundance and post-translational modifications) that are picked, isolated and identified by Mass Spectrometry (MS). The biological function of the identified candidates can be tested by different assays (i.e. migration, adhesion and F-actin polymerization), that we have optimized for primary leukemic cells.

Here we describe a protocol that couples two proteomic techniques, namely 2-dimensional Electrophoresis (2DE) and Mass Spectrometry (MS), to identify differentially expressed/post-translational modified proteins among two or more groups of primary samples. This approach, together with functional experiments, allows the identification and characterization of prognostic markers/therapeutic targets.

A partir de um ponto 2DE-Gel para a função da proteína: lição aprendida com HS1 em leucemia linfocítica crônica

The identification of molecules involved in tumor initiation and progression is fundamental for understanding disease&#8217;s biology and, as a ...

Medicina

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Avaliação Rápida da Qualidade de Proteínas de Membrana por Cromatografia de Exclusão de Tamanho Fluorescente

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Concanavalin A-Based Sedimentation Assay to Measure Substrate Binding of Glucan Phosphatases

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals and starch in plants. The crystal structures of glucan phosphatase with model glucan substrates reveal distinct glucan-binding interfaces made of DSP and carbohydrate-binding domains. However, quantitative measurements of glucan-glucan phosphatase interactions with physiologically relevant substrates are fundamental to the biological understanding of the glucan phosphatase family of enzymes and the regulation of energy metabolism. This manuscript reports a Concanavalin A (ConA)-based in vitro sedimentation assay designed to detect the substrate binding affinity of glucan phosphatases against different glucan substrates.&#160;As a proof of concept, the dissociation constant (KD) of glucan phosphatase Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) and amylopectin was determined. The characterization of SEX4 mutants and other members of the glucan phosphatase family of enzymes further demonstrates the utility of this assay to assess the differential binding of protein- carbohydrate interactions. These data demonstrate the suitability of this assay to characterize a wide range of starch and glycogen interacting proteins.

This method describes a lectin-based in vitro sedimentation assay to quantify the binding affinity of glucan phosphatase and amylopectin. This co-sedimentation assay is reliable for measuring glucan phosphatase substrate binding and can be applied to various solubilized glucan substrates.

Ensaio de Sedimentação à Base de Concanavalina A para Medir a Ligação ao Substrato de Fosfatases Glucanas

Glucan phosphatases belong to the larger family of dual specificity phosphatases (DSP) that dephosphorylate glucan substrates, such as glycogen in animals ...

Reconstitution of Actin-Based Motility with Commercially Available Proteins

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a dynamic network at the surface of the cell, organelle, or bacterium. The biochemical and mechanical basis of force production during this process can be studied by reproducing actin-based movement in an acellular manner on inert surfaces such as beads that are functionalized and incubated with a controlled set of components. Under the appropriate conditions, an elastic actin network assembles at the bead surface and breaks open due to the stress generated by network growth, forming an "actin comet" that propels the bead forward. However, such experiments require the purification of a host of different actin-binding proteins, often putting them beyond the reach of non-specialists. This article details a protocol for reproducibly obtaining actin comets and motility of beads using commercially available reagents. Bead coating, bead size, and motility mixture can be altered to observe the effect on bead speed, trajectories, and other parameters. This assay can be used for testing the biochemical activities of different actin-binding proteins, and for performing quantitative physical measurements that shed light on active matter properties of actin networks. This will be a useful tool for the community, enabling the study of in vitro actin-based motility without expert knowledge in actin-binding protein purification.

This protocol describes how to produce actin comets on the surfaces of beads using commercially available protein ingredients. Such systems mimic the protrusive structures found in cells, and can be used to examine physiological mechanisms of force production in a simplified way.

Reconstituição da Motilidade à Base de Actina com Proteínas Comercialmente Disponíveis

Many cell movements and shape changes and certain types of intracellular bacterial and organelle motility are driven by the biopolymer actin that forms a ...

Bioengenharia

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long filaments in the presence of GTP in vitro, and polymerization is regulated by several accessory proteins. FtsZ polymerization has been extensively studied in vitro using basic methods including light scattering, sedimentation, GTP hydrolysis assays and electron microscopy. Buffer conditions influence both the polymerization properties of FtsZ, and the ability of FtsZ to interact with regulatory proteins. Here, we describe protocols for FtsZ polymerization studies and validate conditions and controls using Escherichia coli and Bacillus subtilis FtsZ as model proteins. A low speed sedimentation assay is introduced that allows the study of the interaction of FtsZ with proteins that bundle or tubulate FtsZ polymers. An improved GTPase assay protocol is described that allows testing of GTP hydrolysis over time using various conditions in a 96-well plate setup, with standardized incubation times that abolish variation in color development in the phosphate detection reaction. The preparation of samples for light scattering studies and electron microscopy is described. Several buffers are used to establish suitable buffer pH and salt concentration for FtsZ polymerization studies. A high concentration of KCl is the best for most of the experiments. Our methods provide a starting point for the in vitro characterization of FtsZ, not only from E. coli and B. subtilis but from any other bacterium. As such, the methods can be used for studies of the interaction of FtsZ with regulatory proteins or the testing of antibacterial drugs which may affect FtsZ polymerization.

Polymerization of FtsZ is essential for bacterial cell division. In this report, we detail simple protocols to monitor FtsZ polymerization activity and discuss the influence of buffer composition. The protocols can be used to study the interaction of FtsZ with regulatory proteins or antibacterial drugs that affect FtsZ polymerization.

FtsZ Polimerização Ensaios: protocolos simples e Considerações

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Quantificação baseada em imagens de moléculas únicas de células vivas de interações proteicas

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Autor em destaque: Avaliação da dinâmica proteína-condensado em células humanas vivas

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Medição de molécula única da dinâmica de interação de proteínas em condensados biomoleculares

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...