Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant HL127711 para AVK.

<ol>
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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

O ensaio de co-sedimentação de actina é uma técnica direta que pode determinar rapidamente se uma proteína se liga à F-actina. Com algumas modificações, a técnica também pode ser usada para medir a afinidade da interação. Além dos pontos levantados no protocolo acima, as questões a seguir devem ser consideradas ao projetar, conduzir e interpretar o ensaio. Proteína de Interesse Pode utilizar-se uma proteína recentemente preparada ou congelada no ensaio. Se for utilizada proteína congelada, recomenda-se que os resultados sejam comparados com proteínas frescas (nunca congeladas) para assegurar que o congelamento não afecte a ligação da F-actina. G-actina Fonte Muitas experiï¿½cias de granulaï¿½o utilizam G-actina isolada do mï¿½culo devido ï¿½sua abundï¿½cia relativa. Existem três principais isotipos de actina em mamíferos - alfa, beta e gama - que são notavelmente semelhantes (&gt; 90%Ty). No entanto, existem diferenças funcionais entre os isotipos 12 , 13 . Se possível, o isotipo G-actina utilizado no ensaio de ligação deve corresponder ao isotipo in vivo . Por exemplo, se testar uma proteína expressa no músculo esquelético, alfa-actina é a melhor escolha; Se examinar uma proteína expressa em fibroblastos, beta-actina é recomendada. Uso de Phalloidin Uma vez que a faloidina se liga à F-actina, pode interferir ou mesmo bloquear a ligação de algumas proteínas de ligação a F-actina ( por exemplo, a faloidina bloqueia a cofilina da ligação a filamentos de actina) 14 . Assim, phalloidin deve ser usado com cautela e os resultados em comparação com não-phalloidin-tratados amostras quando possível. Fundo alto Não é raro que as proteínas se sedimentem na ausência de F-actina ( Figura 1A , nenhuma amostra de peletes de F-actinaS). No entanto, níveis elevados de sedimentação de fundo podem mascarar a verdadeira co-sedimentação de actina e tornar difícil, se não impossível, determinar se uma proteína se liga à F-actina ou medir a afinidade da interação. Adicionar polidicanol ao tampão de reacção (passo 4.1) pode reduzir significativamente o fundo e é uma solução fácil. Se isso não reduzir o fundo, o ajuste do tampão de reação, da concentração de sal e / ou da temperatura de incubação pode ajudar. Curva de encadernação Para gerar uma curva de ligação, é necessário variar a concentração quer da proteína de interesse quer da F-actina através de uma série de reacções. Na prática, é mais fácil e preferível manter F-actina numa concentração fixa e variar a concentração da proteína de interesse. A manutenção da F-actina numa concentração fixa ( por exemplo, 2 μM) no ensaio de peletização limita a captura não específica em concentrações mais elevadas de F-actina e impedeDepolimerização a concentrações mais baixas (&lt;0,5 μM) de F-actina. A despolimerização pode ser prevenida usando phalloidin, embora isto introduza um fator de complicação potencial no sistema (veja o passo 3.3 e acima). A manutenção da F-actina numa concentração fixa também permite comparar (e normalizar) a pastilha de actina F entre amostras e identificar experiências falhadas ( isto é, onde a pastilha de actina F é altamente variável, impedindo a análise entre concentrações). Finalmente, manter F-actina numa concentração fixa permite determinar se a ligação ao filamento de actina é cooperativa ( Figura 1C ). Ligação saturada Tal como em todas as experiências de ligação, é crítico que a ligação à F-actina esteja saturada e que a concentração de proteína mais platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sem um platô, não é possível calcular uma constante de equilíbrio de dissociação precisa. Assim,É importante planejar cuidadosamente a série de diluição a ser testada e sempre incluir concentrações mais altas de proteína ( ou seja, pelo menos 5- a 10 vezes maior do que o esperado K d ). Análise de ligação Para que as constantes de dissociação medidas sejam conclusivas, o ensaio deve ser realizado utilizando uma concentração de actina F que permita que a concentração dos locais de ligação na actina F para a proteína de interesse seja muito mais baixa do que a afinidade. Para verificar se este critério foi atingido, estimar a concentração de locais de ligação de B max . Por exemplo, se [F-actina] fosse 2 μM e Bmax = 0,5, então [locais de ligação] ≈ 1 μM. O Kd deve ser pelo menos 5- a 10 vezes maior do que [locais de ligação]. Se o Kd medido é da mesma ordem de grandeza que [locais de ligação], então é possível que a curva de ligação observada represente uma titulação de ligação de alta afinidade siEm vez de uma verdadeira isoterma de ligação. Se isto for observado, repetir o ensaio usando uma concentração de F-actina 10 vezes menor para medir uma afinidade precisa. Para interações de alta afinidade, a estabilização da faloidina (etapa 3.3) pode ser necessária para se obter uma concentração de F-actina suficientemente baixa para medir com precisão a afinidade. Finalmente, existem limitações fundamentais com o ensaio de co-sedimentação que os pesquisadores devem estar cientes de quando realizar e avaliar o ensaio. Mais importante ainda, o ensaio de co-sedimentação não produz uma verdadeira constante de equilíbrio. Os produtos de ligação ( isto é, proteína mais F-actina) são separados dos reagentes durante a centrifugação, após o que os produtos podem então dissociar-se para criar um novo equilíbrio. Como resultado, o ensaio de co-sedimentação pode calcular mal ou não detectar interacções de baixa afinidade. Uma vez que muitas proteínas de ligação à actina têm uma afinidade baixa ( isto é, micromolar) para a actina F, um resultado negativo ( <eM&gt; isto é, nenhuma ligação detectável) no ensaio não significa necessariamente que uma proteína não se liga à F-actina. Como alternativa, os ensaios de ligação de filamento único com base em microscopia TIRF são mais sensíveis e mais precisos para determinar uma constante de dissociação (para revisões nesta técnica, ver referências 15 , 16 ). Apesar destas limitações, o ensaio de granulação está dentro dos meios da maioria dos investigadores e é uma ferramenta eficaz para determinar se uma proteína liga F-actina e para medir a afinidade da interacção.

A actina é uma proteína essencial do citoesqueleto que desempenha um papel crítico em múltiplos processos celulares, incluindo motilidade, contração, adesão e morfologia 1 . A actina existe em duas formas: actina globular monomérica (G-actina) e actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro das células, a organização da F-actina é controlada por uma grande coleção de proteínas que regulam a nucleação, crescimento, reticulação e desmontagem dos filamentos de actina 2 , 3 , 4 . No entanto, como múltiplas proteínas de ligação de actina funcionam em conjunto para regular a organização da rede de actina ainda não está bem esclarecida. A medição das interações proteína-proteína é uma abordagem importante para entender como as proteínas exercem seus efeitos sobre o comportamento celular ao nível bioquímico. Muitos ensaios diferentes podem ser utilizados para detectar interacções entre proteínas purificadas.Abordagens comuns para proteínas solúveis incluem pull-downs, polarização de fluorescência, calorimetria de titulação isotérmica e ressonância de plasmão de superfície. É importante notar que todos estes ensaios requerem que as proteínas sejam solúveis e são, portanto, difíceis de adaptar para utilização com uma proteína polimérica, filamentosa tal como F-actina. Aqui, descrevemos uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou granulação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio se liga F-actina e para medir a afinidade da interação. O ensaio de peletização de actina é uma técnica relativamente simples que não requer equipamento especializado, além de uma ultracentrífuga. Todos os reagentes podem ser feitos, assumindo conhecimentos de bioquímica básica, ou adquiridos. Uma vez estabelecida a ligação à F-actina, o ensaio pode ser utilizado para medir a afinidade aparente ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação) 5 . Além disso, uma vez estabelecida a afinidade, o ensaio de peletizaçãoÉ uma ferramenta útil para medir como alterações na proteína de interesse ( isto é , modificações pós-translacionais, mutações, ou ligação de ligando) afetam sua interação com F-actina 6 . A técnica tem limitações (ver a Discussão ) que o pesquisador deve estar ciente antes de tentar o ensaio.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

A organização de actina filamentosa (F-actina) dentro das células é regulada por um grande número de proteínas de ligação à actina que controlam a nucleação, crescimento, reticulação e / ou desmontagem da actina. Este protocolo descreve uma técnica - a co-sedimentação de actina, ou sedimentação, ensaio - para determinar se uma proteína ou proteína domínio liga F-actina e medir a afinidade da interação ( isto é, a constante de equilíbrio de dissociação). Nesta técnica, uma proteína de interesse é primeiro incubada com F-actina em solução. Em seguida, utiliza-se a centrifugação diferencial para sedimentar os filamentos de actina, e o material peletizado é analisado por SDS-PAGE. Se a proteína de interesse se liga à F-actina, co-sedimentará com os filamentos de actina. Os produtos da reacção de ligação ( isto é, F-actina e a proteína de interesse) podem ser quantificados para determinar a afinidade da interacção. O ensaio de peletização de actina é uma técnica simples para determinarSe uma proteína de interesse se liga a F-actina e para avaliar como as alterações a essa proteína, tais como a ligação do ligando, afectam a sua interacção com F-actina.

Examinámos a ligação do homodímero de αE-catenina à actina F no ensaio de co-sedimentação. Uma vez que experiências anteriores demonstraram que a afinidade do homodímero de αE-catenina para a actina F é de cerca de 1 μM e do B max próximo de 11 , realizámos o ensaio com uma concentração baixa de actina F (0,2 μM em vez de 2 μM; a discussão). Uma vez que 0,2 μM está abaixo da concentração crítica, a faloidina foi adicionada para estabilizar a F-actina polimerizada a partir da G-actina de músculo esquelético de coelho (passo 3.3). Incubaram-se concentrações crescentes de homodímero de cE-catenina (0,125-12,0 uM) na presença ou na ausência de actina F 0,2 uM. As amostras foram centrifugadas, e as pastilhas resultantes foram analisadas ( Figura 1A ). Conforme esperado, o homodímero de αE-catenina co-sedimentado com F-actina acima do fundo ( Figura 1A , compara as amostras de pastilhas de F-actina com o não-F-acAmostras de pellet de estanho). A BSA foi executada como um controlo negativo ( Figura 1B ). A proteína ligada foi quantificada e plotada sobre proteína livre para calcular a afinidade da interacção ( Figura 1C ). Os dados traçados correspondem melhor a uma equação de Hill. O Kd calculado foi 2,9 μM, o Bmax foi 0,2, eo coeficiente de Hill (h) foi 4,8. Assim, o homodímero de αE-catenina liga F-actina cooperativamente com uma baixa afinidade micromolar, consistente com o trabalho anterior (um Kd de 2,9 μM contra ~ 1,0 μM) 11 . <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Ensaio de co-sedimentação de F-actina de alta velocidade. ( A ) Concentrações crescentes (0,125-12,0 μM) de homodímero de αE-catenina foram incubadas com (painéis esquerdos) ou sem (painéis direitos) F-actina 0,2 μM estabilizada com phalloidiN. Incubaram-se durante 30 min à RT e centrifugaram-se. O total (7,5% do material de partida) e o material peletizado (50% do material peletizado) foram separados por SDS-PAGE e corados com corante de Coomassie. ( B ) 4 μM BSA foi executado como um controlo negativo. As amostras totais e em pellets, com (+) ou sem (-) F-actina, foram separadas por SDS-PAGE e coradas com corante de Coomassie. ( C ) Ligou-se αE-catenina (μM / μM de actina) a partir de A contra cE-catenina livre (μM), e os dados encaixam-se numa equação de Hill (linha vermelha). Os coeficientes Kd, Bmax e Hill (h) estão listados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Quantificação de peletização de actina </sTrong&gt; - fluxograma. Este esquema descreve as etapas chave na seção 5, com exemplos de amostras de Total e Pellet ( A , CE ) e a curva padrão ( B ) usada para quantificação. 5.13 etapas: 1 ) Medir a quantidade de proteína de interesse nas amostras totais (A). 2 ) Gerar uma curva padrão, traçando a intensidade da banda versus a massa da proteína (B). 3 ) Meça a quantidade de proteína de interesse co-sedimentada com F-actina ( C ). 4 ) Meça a quantidade de proteína de interesse que sedimentou na ausência de F-actina ( D ). 5 ) Subtrair D de C para determinar a quantidade de proteína ligada a F-actina. 6 ) Medir a quantidade de F-actina em cada pellet (E), calcular a quantidade média de F-actina por amostra e dividir cada amostra pela média (os números abaixo mostram a razão). 7 )Para cada amostra, divida-se a quantidade de proteína ligada (calculada no passo 5) pela razão de peletes de F-actina (calculada no passo 6) para ajustar as diferenças no grânulo. 8 ) Utilizar a curva padrão ( B ) para calcular a quantidade (massa) de proteína ligada normalizada em cada amostra (passo 7). 9 ) Determine a concentração de proteína livre e proteína ligada para criar uma curva de ligação. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção.

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K visualizações.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Este protocolo descreve um método para testar a capacidade de uma proteína co-sedimentar com actina filamentosa (F-actina) e, se for observada ligação, para medir a afinidade da interacção. 

Vídeo: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Bioquímica

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Medindo e interpretando a taxas de consumo de oxigênio em toda a cabeça segmentos de voar

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...