Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Grant HL127711 an AVK unterstützt.

<ol>
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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Der Actin-Co-Sedimentationstest ist eine einfache Technik, die schnell bestimmen kann, ob ein Protein F-Actin bindet. Mit einigen Modifikationen kann die Technik auch verwendet werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu messen. Zusätzlich zu den im oben genannten Protokoll aufgeführten Punkten sollten bei der Gestaltung, Durchführung und Interpretation des Assays die folgenden Punkte berücksichtigt werden. Protein von Interesse Frisch zubereitetes oder gefrorenes Protein kann im Assay verwendet werden. Wenn gefrorenes Protein verwendet wird, wird dringend empfohlen, dass die Ergebnisse mit frischem (nie gefrorenem) Protein verglichen werden, um sicherzustellen, dass das Einfrieren die F-Aktinbindung nicht beeinflusst. G-Aktin Quelle Viele Pelletierexperimente verwenden G-Actin, das aus dem Muskel isoliert ist, wegen seiner relativen Häufigkeit. Es gibt drei Haupt-Actin-Isotypen bei Säugetieren - Alpha, Beta und Gamma - das sind bemerkenswert ähnlich (&gt; 90% Sequenz identiTy) Dennoch gibt es funktionale Unterschiede zwischen den Isotypen 12 , 13 . Wenn möglich, sollte der in dem Bindungsassay verwendete G-Aktin-Isotyp mit dem in vivo- Isotyp übereinstimmen. Zum Beispiel, wenn ein Protein im Skelettmuskel exprimiert wird, ist Alpha-Aktin die beste Wahl; Bei der Untersuchung eines in Fibroblasten exprimierten Proteins wird Beta-Actin empfohlen. Phalloidin Gebrauch Da Phalloidin F-Actin bindet, kann es die Bindung einiger F-Aktin-bindender Proteine ​​stören oder sogar blockieren ( z. B. Phalloidin-Blöcke cofilin aus Bindung an Aktin-Filamente) 14 . So sollte Phalloidin mit Vorsicht verwendet werden und die Ergebnisse im Vergleich zu Nicht-Phalloidin-behandelten Proben, wenn möglich. Hoher hintergrund Es ist nicht ungewöhnlich, daß Proteine ​​in Abwesenheit von F-Aktin sedimentieren ( Fig. 1A , keine F-Aktin-PelletprobeS). Allerdings können hohe Niveaus der Hintergrund-Sedimentation die echte Aktin-Co-Sedimentation maskieren und es schwierig machen, wenn nicht gar unmöglich zu bestimmen, ob ein Protein F-Actin bindet oder die Affinität der Wechselwirkung mißt. Das Hinzufügen von Polidicanol zum Reaktionspuffer (Schritt 4.1) kann den Hintergrund erheblich reduzieren und ist eine einfache Lösung. Wenn das nicht den Hintergrund verringert, kann die Einstellung des Reaktionspuffers, der Salzkonzentration und / oder der Inkubationstemperatur helfen. Bindekurve Um eine Bindungskurve zu erzeugen, ist es notwendig, die Konzentration von entweder dem interessierenden Protein oder dem F-Aktin über eine Reihe von Reaktionen zu variieren. In der Praxis ist es einfacher und bevorzugt, F-Aktin in einer festen Konzentration aufrechtzuerhalten und die Konzentration des interessierenden Proteins zu variieren. Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration ( z. B. 2 &amp; mgr; M) im Pelletier-Assay begrenzt das unspezifische Fallen bei höheren Konzentrationen von F-Aktin und verhindertDepolymerisation bei niedrigeren (&lt;0,5 μM) Konzentrationen von F-Aktin. Die Depolymerisation kann mit Phalloidin verhindert werden, obwohl dies einen potentiellen komplizierenden Faktor in das System einführt (siehe Schritt 3.3 und darüber). Die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration erlaubt es auch, das F-Aktin-Pellet über Proben zu vergleichen (und zu normalisieren) und um fehlgeschlagene Experimente zu identifizieren ( dh wo das F-Aktin-Pellet sehr variabel ist und eine Analyse über Konzentrationen hinweg verhindert). Schließlich ermöglicht die Aufrechterhaltung von F-Aktin in einer festen Konzentration, dass man bestimmt, ob die Bindung an den Aktin-Filament kooperativ ist ( 1C ). Gesättigte Bindung Wie bei allen Bindungsexperimenten ist es entscheidend, dass die Bindung an F-Actin gesättigt ist und dass die Konzentration von Protein plus F-Aktin-Plateaus (Abbildung 1C ). Ohne Plateau ist es nicht möglich, eine genaue Dissoziationsgleichgewichtskonstante zu berechnen. Also, esIst wichtig, die zu testende Verdünnungsreihe sorgfältig zu planen und immer höhere Protein-Konzentrationen ( dh mindestens 5- bis 10-fach höher als die erwarteten K d ) zu enthalten. Bindungsanalyse Damit die gemessenen Dissoziationskonstanten schlüssig sind, sollte der Assay unter Verwendung einer F-Aktin-Konzentration durchgeführt werden, die es ermöglicht, dass die Konzentration von Bindungsstellen auf F-Aktin für das interessierende Protein viel niedriger als die Affinität ist. Um zu prüfen, ob dieses Kriterium erfüllt ist, schätzen Sie die Konzentration der Bindungsstellen von B max . Zum Beispiel, wenn [F-Aktin] 2 μM und B max = 0,5 war, dann [Bindungsstellen] ≈ 1 μM. Das K d sollte mindestens 5- bis 10-fach größer sein als [Bindungsstellen]. Ist das gemessene K d in der gleichen Größenordnung wie [Bindungsstellen], so ist es möglich, dass die beobachtete Bindungskurve eine Titration der hochaffinen Bindungsstelle darstelltEher als eine echte Bindungsisotherme. Wenn dies beobachtet wird, wiederholen Sie den Assay mit einer 10-fach niedrigeren F-Aktin-Konzentration, um eine genaue Affinität zu messen. Für hochaffine Wechselwirkungen kann eine Phalloidin-Stabilisierung (Schritt 3.3) notwendig sein, um eine F-Aktin-Konzentration zu erreichen, die niedrig genug ist, um die Affinität genau zu messen. Schließlich gibt es grundsätzliche Einschränkungen mit dem Co-Sedimentationstest, den die Forscher bei der Durchführung und Bewertung des Assays bewusst sein sollten. Am wichtigsten ist, dass der Co-Sedimentationstest keine echte Gleichgewichtskonstante ergibt. Die Produkte der Bindung ( dh Protein plus F-Aktin) werden bei der Zentrifugation von den Reaktanten abgetrennt, woraufhin die Produkte dann dissoziieren können, um ein neues Gleichgewicht zu erzeugen. Infolgedessen kann der Co-Sedimentations-Assay die Wechselwirkung mit geringer Affinität fiskussieren oder nicht erkennen. Da viele aktinbindende Proteine ​​eine niedrige ( dh mikromolare) Affinität für F-Aktin aufweisen , ist ein negatives Ergebnis ( <eM&gt; dh keine nachweisbare Bindung) im Assay bedeutet nicht zwangsläufig, dass ein Protein nicht F-Actin bindet. Als Alternative sind TIRF-Mikroskopie-basierte Einzelfilament-Bindungsassays empfindlicher und genauer für die Bestimmung einer Dissoziationskonstante (für Rezensionen zu dieser Technik siehe Literatur 15,16 ). Trotz dieser Einschränkungen liegt der Pelletierassay innerhalb der Mittel der meisten Forscher und ist ein wirksames Instrument, um festzustellen, ob ein Protein F-Aktin bindet und die Affinität der Wechselwirkung misst.

Actin ist ein essentielles zytoskeletales Protein, das in zahlreichen zellulären Prozessen eine entscheidende Rolle spielt, einschließlich Motilität, Kontraktion, Adhäsion und Morphologie 1 . Actin besteht in zwei Formen: monomeres globuläres Actin (G-Actin) und polymerisiertes filamentöses Actin (F-Aktin). Innerhalb der Zellen wird die F-Aktin-Organisation durch eine große Sammlung von Proteinen kontrolliert, die die Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und die Demontage der Aktinfilamente 2 , 3 , 4 regulieren. Doch wie viele aktinbindende Proteine ​​im Zusammenspiel zur Regulierung der Aktin-Netzwerkorganisation funktionieren, ist noch weitgehend unklar. Die Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen ist ein wichtiger Ansatz für das Verständnis, wie Proteine ​​ihre Auswirkungen auf das zelluläre Verhalten auf biochemischer Ebene ausüben. Viele verschiedene Assays können verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen gereinigten Proteinen zu detektieren.Häufige Ansätze für lösliche Proteine ​​umfassen Pull-Downs, Fluoreszenzpolarisation, isotherme Titrationskalorimetrie und Oberflächenplasmonenresonanz. Wichtig ist, dass alle diese Assays Proteine ​​benötigen, um löslich zu sein, und sind daher schwierig für die Verwendung mit einem polymeren, filamentösen Protein wie F-Actin anzupassen. Hier beschreiben wir eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um festzustellen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung mißt. Der Aktin-Pelletier-Assay ist eine relativ einfache Technik, die keine spezialisierte Ausrüstung erfordert, abgesehen von einer Ultrazentrifuge. Alle Reagenzien können hergestellt werden, die Kenntnis der Grundbiochemie annehmen oder erworben werden. Sobald die Bindung an F-Actin etabliert ist, kann der Assay verwendet werden, um die scheinbare Affinität ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) zu messen. Auch wenn einmal eine Affinität festgestellt ist, wird der PelletierungsassayIst ein nützliches Werkzeug, um zu messen, wie sich Veränderungen des interessierenden Proteins ( dh posttranslationale Modifikationen, Mutationen oder Ligandenbindung) auf die Wechselwirkung mit F-Aktin 6 auswirken. Die Technik hat Einschränkungen (siehe die Diskussion ), die der Forscher sich bewusst sein sollte, bevor er den Test versuchte.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

Die filamentöse Aktin (F-Aktin) -Organisation innerhalb der Zellen wird durch eine große Anzahl von aktinbindenden Proteinen reguliert, die die Aktin-Keimbildung, das Wachstum, die Vernetzung und / oder die Demontage kontrollieren. Dieses Protokoll beschreibt eine Technik - die Aktin-Co-Sedimentation oder Pelletierung, Assay - um zu bestimmen, ob eine Protein- oder Proteindomäne F-Actin bindet und die Affinität der Wechselwirkung ( dh die Dissoziationsgleichgewichtskonstante) misst. Bei dieser Technik wird zunächst ein Protein von Interesse mit F-Actin in Lösung inkubiert. Dann wird eine Differentialzentrifugation verwendet, um die Aktinfilamente zu sedimentieren, und das pelletierte Material wird durch SDS-PAGE analysiert. Wenn das interessierende Protein F-Aktin bindet, wird es mit den Aktinfilamenten co-sedimentieren. Die Produkte der Bindungsreaktion ( dh F-Aktin und des Proteins von Interesse) können quantifiziert werden, um die Affinität der Wechselwirkung zu bestimmen. Der Aktin-Pelletierassay ist eine einfache Technik zur BestimmungWenn ein Protein von Interesse F-Aktin bindet und für die Beurteilung, wie Veränderungen an diesem Protein, wie Ligandenbindung, seine Wechselwirkung mit F-Actin beeinflussen.

Wir untersuchten die αE-Catenin-Homodimer-Bindung an F-Actin im Co-Sedimentationstest. Da vergangene Experimente gezeigt haben, dass die Affinität des αE-Catenin-Homodimers für F-Aktin etwa 1 μM und der B max bei 1 11 liegt , haben wir den Assay mit einer geringen Konzentration an F-Aktin (0,2 μM anstatt 2 μM) durchgeführt die Diskussion). Da 0,2 μM unterhalb der kritischen Konzentration liegt, wurde Phalloidin zugegeben, um das aus dem Kaninchen-Skelettmuskel G-Actin polymerisierte F-Aktin zu stabilisieren (Schritt 3.3). Zunehmende Konzentrationen von &amp; agr; E-Catenin-Homodimeren (0,125 &amp; ndash; 12,0 &amp; mgr; M) wurden in Gegenwart oder Abwesenheit von 0,2 &amp; mgr; M F-Aktin inkubiert. Die Proben wurden zentrifugiert und die resultierenden Pellets wurden analysiert ( Fig. 1A ). Wie erwartet, wurde der αE-Catenin-Homodimer mit F-Aktin über dem Hintergrund co-sedimentiert (Abbildung 1A , Vergleich der F-Aktin-Pelletproben mit dem No-F-acZinnpelletproben). BSA wurde als Negativkontrolle ausgeführt ( Abbildung 1B ). Das gebundene Protein wurde quantifiziert und über freies Protein aufgetragen, um die Affinität der Wechselwirkung zu berechnen (Abbildung 1C ). Die geplante Daten passen am besten zu einer Hill-Gleichung. Das berechnete K d betrug 2,9 &amp; mgr; M, das B max betrug 0,2 und der Hill-Koeffizient (h) betrug 4,8. Somit bindet das αE-Catenin-Homodimer F-Actin kooperativ mit einer geringen mikromolaren Affinität, konsistent mit früheren Arbeiten (ein Kd von 2,9 &amp; mgr; M gegenüber &amp; ndash; 1,0 &amp; mgr; M) 11 . <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Abbildung 1: Hochgeschwindigkeits-F-Aktin-Co-Sedimentationstest ( A ) Zunehmende Konzentrationen (0,125-12,0 μM) des αE-Catenin-Homodimers wurden mit (linken Tafeln) oder ohne (rechte Tafeln) mit 0,2 &amp; mgr; M F-Aktin, stabilisiert mit Phalloidi, inkubiertN. Sie wurden für 30 min bei RT inkubiert und zentrifugiert. Die Gesamtmenge (7,5% des Ausgangsmaterials) und das pelletierte Material (50% des pelletierten Materials) wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( B ) 4 &amp; mgr; M BSA wurde als Negativkontrolle durchgeführt. Gesamt- und Pelletproben mit (+) oder ohne (-) F-Aktin wurden durch SDS-PAGE getrennt und mit Coomassie-Farbstoff gefärbt. ( C ) Das gebundene αE-Catenin (μM / μM Actin) aus A wurde gegen freies αE-Catenin (μM) aufgetragen und die Daten passen zu einer Hill-Gleichung (rote Linie). Der K d , B max und der Hill-Koeffizient (h) sind aufgeführt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Abbildung 2: Aktin-Pelletierung Quantifizierung </sTrong&gt; - Flussdiagramm In diesem Schema werden die wichtigsten Schritte in Abschnitt 5 mit Beispielen für Total- und Pelletproben ( A , CE ) und der zur Quantifizierung verwendeten Standardkurve ( B ) erläutert. 5.13 Schritte: 1 ) Messen Sie die Menge des Proteins von Interesse in den Gesamtproben (A). 2 ) Erzeugen Sie eine Standardkurve, indem Sie die Bandintensität gegenüber der Proteinmasse (B) aufzeichnen. 3 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die mit F-Aktin ( C ) co-sedimentiert wurde . 4 ) Messen Sie die Menge an Interesse von Interesse, die in Abwesenheit von F-Aktin ( D ) pelletiert. 5 ) Subtrahieren Sie D von C, um die Menge an Protein zu bestimmen, die an F-Actin gebunden ist. 6 ) Messen Sie die Menge an F-Aktin in jedem Pellet (E), berechnen Sie die durchschnittliche Menge an F-Aktin pro Probe und teilen Sie jede Probe mit dem Durchschnitt (die Zahlen unten zeigen das Verhältnis). 7 )Für jede Probe teilen Sie die Menge an gebundenem Protein (berechnet in Schritt 5) durch das F-Aktin-Pellet-Verhältnis (berechnet in Schritt 6), um die Unterschiede im Pellet einzustellen. 8 ) Verwenden Sie die Standardkurve ( B ), um die Menge (Masse) des normalisierten gebundenen Proteins in jeder Probe zu berechnen (Schritt 7). 9 ) Bestimmen Sie die Konzentration von freiem Protein und gebundenem Protein, um eine Bindungskurve zu erzeugen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen.

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K Aufrufe.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren, um die Fähigkeit eines Proteins zu testen, mit filamentösem Actin (F-Aktin) zu coedimieren und, falls die Bindung beobachtet wird, die Affinität der Wechselwirkung zu messen. 

Serie: Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Forschung

Biochemie

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

In-vitro- Polymerisation von F-Aktin auf frühen Endosomen

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Biochemische und strukturelle Charakterisierung von Kohlenhydrat Transport Substrat-Bindeprotein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...