Este trabajo fue apoyado por el National Institutes of Health Grant HL127711 a AVK.

<ol>
	<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+and+Actin-Binding+Proteins.">Actin and Actin-Binding Proteins.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (8), (2016).</li><li>Hansen, M. D., Kwiatkowski, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+actin+dynamics+by+allosteric+regulation+of+actin+binding+proteins.">Control of actin dynamics by allosteric regulation of actin binding proteins.</a> Int Rev Cell Mol Biol. 303, 1-25 (2013).</li><li>Lappalainen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-binding+proteins:+the+long+road+to+understanding+the+dynamic+landscape+of+cellular+actin+networks.">Actin-binding proteins: the long road to understanding the dynamic landscape of cellular actin networks.</a> Mol Biol Cell. 27 (16), 2519-2522 (2016).</li><li>Mullins, R. D., Hansen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+actin+filament+and+network+dynamics.">In vitro studies of actin filament and network dynamics.</a> Curr Opin Cell Biol. 25 (1), 6-13 (2013).</li><li>Miller, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Danio+rerio+alphaE-catenin+is+a+monomeric+F-actin+binding+protein+with+distinct+properties+from+Mus+musculus+alphaE-catenin.">Danio rerio alphaE-catenin is a monomeric F-actin binding protein with distinct properties from Mus musculus alphaE-catenin.</a> J Biol Chem. 288 (31), 22324-22332 (2013).</li><li>Wickline, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaT-Catenin+Is+a+Constitutive+Actin-binding+alpha-Catenin+That+Directly+Couples+the+Cadherin.Catenin+Complex+to+Actin+Filaments.">alphaT-Catenin Is a Constitutive Actin-binding alpha-Catenin That Directly Couples the Cadherin.Catenin Complex to Actin Filaments.</a> J Biol Chem. 291 (30), 15687-15699 (2016).</li><li>Simpson, R. J., Adams, P. D., Golemis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in protein purification and analysis : a laboratory manual. , (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+simple+and+informative+binding+assays.">A guide to simple and informative binding assays.</a> Mol Biol Cell. 21 (23), 4061-4067 (2010).</li><li>Hansen, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alphaE-catenin+actin-binding+domain+alters+actin+filament+conformation+and+regulates+binding+of+nucleation+and+disassembly+factors.">alphaE-catenin actin-binding domain alters actin filament conformation and regulates binding of nucleation and disassembly factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3710-3720 (2013).</li><li>Perrin, B. J., Ervasti, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+actin+gene+family:+function+follows+isoform.">The actin gene family: function follows isoform.</a> Cytoskeleton (Hoboken). 67 (10), 630-634 (2010).</li><li>Tondeleir, D., Vandamme, D., Vandekerckhove, J., Ampe, C., Lambrechts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+isoform+expression+patterns+during+mammalian+development+and+in+pathology:+insights+from+mouse+models.">Actin isoform expression patterns during mammalian development and in pathology: insights from mouse models.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 66 (10), 798-815 (2009).</li><li>Prochniewicz, E., Janson, N., Thomas, D. D., Dela Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+increases+the+torsional+flexibility+and+dynamics+of+actin+filaments.">Cofilin increases the torsional flexibility and dynamics of actin filaments.</a> J Mol Biol. 353 (5), 990-1000 (2005).</li><li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys J. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li><li>Hansen, S. D., Zuchero, J. B., Mullins, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+actin:+purification+and+single+molecule+assembly+assays.">Cytoplasmic actin: purification and single molecule assembly assays.</a> Methods Mol Biol. 1046, 145-170 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El ensayo de co-sedimentación de actina es una técnica sencilla que puede determinar rápidamente si una proteína se une a la F-actina. Con algunas modificaciones, la técnica también puede usarse para medir la afinidad de la interacción. Además de los puntos planteados en el protocolo anterior, los siguientes aspectos deben ser considerados al diseñar, conducir e interpretar el ensayo. Proteína de Interés En el ensayo se puede usar proteína recién preparada o congelada. Si se usa proteína congelada, se recomienda que los resultados se comparen con proteínas frescas (nunca congeladas) para asegurar que la congelación no afecta a la unión de F-actina. G-actina Fuente Muchos experimentos de granulación utilizan G-actina aislada del músculo debido a su abundancia relativa. Hay tres principales isotipos de actina en mamíferos - alfa, beta y gamma - que son notablemente similares (&gt; 90% de la secuencia identiTy). No obstante, existen diferencias funcionales entre los isotipos 12 , 13 . Si es posible, el isotipo G-actina usado en el ensayo de unión debe coincidir con el isotipo in vivo . Por ejemplo, si se prueba una proteína expresada en el músculo esquelético, la alfa-actina es la mejor opción; Si se examina una proteína expresada en fibroblastos, se recomienda la beta-actina. Uso de Phalloidin Dado que la faloidina se une a la actina F, puede interferir o incluso bloquear la unión de algunas proteínas de unión a la actina F ( p. Ej., La faloidina bloquea la cofilina de la unión a los filamentos de actina) 14 . Por lo tanto, la faloidina debe utilizarse con precaución y los resultados en comparación con las muestras no tratados con faloidina cuando sea posible. Fondo alto No es infrecuente que las proteínas sedimenten en ausencia de actina F ( Figura 1A , ninguna muestra de pellet de F-actinaS). Sin embargo, altos niveles de sedimentación de fondo pueden enmascarar la verdadera co-sedimentación de actina y dificultar, si no imposible, determinar si una proteína se une a F-actina o para medir la afinidad de la interacción. La adición de polidicanol al tampón de reacción (paso 4.1) puede reducir significativamente el fondo y es una solución fácil. Si esto no reduce el fondo, el ajuste del tampón de reacción, la concentración de sal y / o la temperatura de incubación pueden ayudar. Curva de encuadernación Para generar una curva de unión, es necesario variar la concentración de la proteína de interés o de la F-actina sobre una serie de reacciones. En la práctica, es más fácil y preferible mantener F-actina a una concentración fija y variar la concentración de la proteína de interés. El mantenimiento de la actina F a una concentración fija ( por ejemplo, 2 μM) en el ensayo de granulación limita la captura no específica a concentraciones más altas de actina F y previeneDespolimerización a concentraciones menores (&lt;0,5 μM) de F-actina. La despolimerización puede evitarse utilizando la faloidina, aunque esto introduce un factor de complicación potencial en el sistema (ver paso 3.3 y anteriores). El mantenimiento de la actina F a una concentración fija también permite comparar (y normalizar) el sedimento de actina F entre muestras e identificar experimentos fallidos ( es decir, donde el sedimento de actina F es altamente variable, evitando el análisis a través de las concentraciones). Por último, el mantenimiento de la actina F a una concentración fija permite determinar si la unión al filamento de actina es cooperativa ( Figura 1C ). Unión saturada Como en todos los experimentos de unión, es crítico que la unión a F-actina esté saturada y que la concentración de proteína más platinas de F-actina ( Figura 1C ). Sin una meseta, no es posible calcular una constante de equilibrio de disociación precisa. Por lo tanto,Es importante planificar cuidadosamente la serie de dilución a ensayar e incluir siempre concentraciones más altas de proteína ( es decir, por lo menos 5- a 10 veces mayor que la Kd esperada). Análisis de encuadernación Para que las constantes de disociación medidas sean concluyentes, el ensayo debe realizarse usando una concentración de actina F que permita que la concentración de sitios de unión en la actina F para la proteína de interés sea mucho menor que la afinidad. Para comprobar si este criterio se cumplió, estimar la concentración de sitios de unión de B max . Por ejemplo, si [F-actina] era 2 μM y Bmax = 0,5, entonces [sitios de unión] ≈ 1 μM. El Kd debe ser al menos 5- a 10 veces mayor que [sitios de unión]. Si el Kd medido es del mismo orden de magnitud que [sitios de unión], entonces es posible que la curva de unión observada represente una titulación de unión de alta afinidad siMás que una verdadera isoterma vinculante. Si esto se observa, repetir el ensayo utilizando una concentración de actina F 10 veces menor para medir una afinidad precisa. Para las interacciones de alta afinidad, la estabilización de la faloidina (etapa 3.3) puede ser necesaria para lograr una concentración de actina F lo suficientemente baja como para medir con precisión la afinidad. Finalmente, existen limitaciones fundamentales con el ensayo de co-sedimentación que los investigadores deben tener en cuenta al realizar y evaluar el ensayo. Más importante aún, el ensayo de co-sedimentación no produce una constante de equilibrio real. Los productos de unión ( es decir, proteína más F-actina) se separan de los reactivos durante la centrifugación, después de lo cual los productos pueden disociarse para crear un nuevo equilibrio. Como resultado, el ensayo de co-sedimentación puede calcular erróneamente o no detectar interacciones de baja afinidad. Puesto que muchas proteínas de unión a actina tienen una afinidad baja ( es decir, micromolar) para la actina F, un resultado negativo <eM&gt; es decir, ninguna unión detectable) en el ensayo no significa necesariamente que una proteína no se une a F-actina. Como alternativa, los ensayos de unión a un solo filamento basados ​​en microscopía TIRF son más sensibles y más precisos para determinar una constante de disociación (para revisiones sobre esta técnica, véanse las referencias 15 , 16 ). A pesar de estas limitaciones, el ensayo de granulación está dentro de los medios de la mayoría de los investigadores y es una herramienta eficaz para determinar si una proteína se une a la actina F y para medir la afinidad de la interacción.

La actina es una proteína esencial del citoesqueleto que desempeña un papel crítico en múltiples procesos celulares, incluyendo la motilidad, la contracción, la adhesión y la morfología 1 . La actina existe en dos formas: la actina globular monomérica (G-actina) y la actina filamentosa polimerizada (F-actina). Dentro de las células, F-actina organización está controlada por una gran colección de proteínas que regulan la nucleación, el crecimiento, reticulación y desmontaje de actina filamentos 2 , 3 , 4 . Sin embargo, la forma en múltiples actina vinculante proteínas funcionan en concierto para regular la actina red de organización sigue siendo en gran parte poco clara. La medición de las interacciones proteína-proteína es un enfoque importante para entender cómo las proteínas ejercen sus efectos sobre el comportamiento celular a nivel bioquímico. Se pueden usar muchos ensayos diferentes para detectar interacciones entre proteínas purificadas.Los enfoques comunes para las proteínas solubles incluyen pull-downs, polarización de fluorescencia, calorimetría de titulación isotérmica y resonancia de plasmón superficial. Es importante destacar que todos estos ensayos requieren que las proteínas sean solubles y, por lo tanto, son difíciles de adaptar para su uso con una proteína polimérica filamentosa tal como actina F. Aquí, describimos una técnica - la co-sedimentación de actina, o granulación, ensayo - para determinar si una proteína o dominio de proteínas se une a la actina F y para medir la afinidad de la interacción. El ensayo de granulación de actina es una técnica relativamente sencilla que no requiere equipo especializado, aparte de una ultracentrífuga. Todos los reactivos se pueden hacer, asumiendo el conocimiento de la bioquímica básica, o comprado. Una vez establecida la unión a F-actina, el ensayo puede usarse para medir la afinidad aparente ( es decir, la constante de equilibrio de disociación) 5 . Además, una vez que se establece una afinidad, el ensayo de granulaciónEs una herramienta útil para medir cómo los cambios en la proteína de interés ( es decir , las modificaciones post-traduccionales, mutaciones, ligando o ligando) afectan a su interacción con F-actina [ 6] . La técnica tiene limitaciones (vea la Discusión ) que el investigador debe tener en cuenta antes de intentar el ensayo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="842">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sorvall MTX 150 Micro-Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">46960</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">S100-AT3 rotor</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45585</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ultracentrifuge tubes - 0.2 ml</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">45233</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Actin, rabbit skeletal muscle</td>
			<td style="width:224px;">Cytoskeleton</td>
			<td style="width:119px;">AKL99</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A8531</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Polidicanol (Thesit)&#160;</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">88315</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Phalloidin</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P3457</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0862</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Adenosine triphosphate (ATP)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Imidazole</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">O3196</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Magnesium Chloride (MgCl2)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M33</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td style="width:224px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P217</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Ethylene glycol-bis(&#946;-aminoethyl ether)-N,N,N&#39;,N&#39;-tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td style="width:224px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">3779</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Odyssey CLx Imaging System</td>
			<td style="width:224px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:499px;">Coomassie Brilliant Blue R-250 Dye</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">20278</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Colloidal Blue Staining Kit</td>
			<td style="width:224px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">LC6025</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein binding to f-actin by co-sedimentation

La organización de actina filamentosa (F-actina) dentro de las células está regulada por un gran número de proteínas de unión a actina que controlan la nucleación, crecimiento, reticulación y / o desmontaje de actina. Este protocolo describe una técnica - la co-sedimentación de actina, o granulación, ensayo - para determinar si un dominio de proteína o proteína se une a F-actina y para medir la afinidad de la interacción ( es decir, la constante de equilibrio de disociación). En esta técnica, una proteína de interés se incuba primero con F-actina en solución. A continuación, se utiliza la centrifugación diferencial para sedimentar los filamentos de actina, y el material en forma de gránulo se analiza por SDS-PAGE. Si la proteína de interés se une a la actina F, se co-sedimentará con los filamentos de actina. Los productos de la reacción de unión ( es decir, F-actina y la proteína de interés) se pueden cuantificar para determinar la afinidad de la interacción. El ensayo de granulación de actina es una técnica sencilla para determinarSi una proteína de interés se une a la actina F y para evaluar cómo los cambios en esa proteína, como la unión al ligando, afectan su interacción con la F-actina.

Se examinó αE-catenina homodímero vinculante a F-actina en el co-sedimentación ensayo. Dado que los experimentos anteriores han demostrado que la afinidad del homodímero αE-catenina para la actina F es alrededor de 1 μM y el Bmax cerca de 11 , se realizó el ensayo con una concentración baja de actina F (0,2 μM en lugar de 2 μM; La discusión). Puesto que 0,2 μM está por debajo de la concentración crítica, se añadió faloidina para estabilizar la F-actina polimerizada a partir de G-actina de músculo esquelético de conejo (etapa 3.3). Se incubaron concentraciones crecientes de homodímero αE-catenina (0,125-12,0 μM) en presencia o ausencia de actina F 0,2 μM. Las muestras fueron centrifugadas, y los pellets resultantes se analizaron ( Figura 1A ]. Como era de esperar, el homodímero αE-catenina co-sedimentado con F-actina por encima del fondo ( Figura 1A , compara las muestras de pellet de F-actina con el no-F-acMuestras de pellets de hojalata). BSA se ejecutó como un control negativo ( Figura 1B ]. La proteína unida se cuantificó y se trazó sobre proteína libre para calcular la afinidad de la interacción ( Figura 1C ). Los datos trazados se ajustan mejor a una ecuación Hill. El Kd calculado fue de 2,9 mu M, el Bmax fue de 0,2 y el coeficiente de Hill (h) fue de 4,8. Por tanto, el homodímero αE-catenina se une a la actina F cooperativamente con una afinidad micromolar baja, consistente con el trabajo previo (un Kd de 2,9 μM frente a 1,0 μM) 11 . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig1.jpg" /> Figura 1: Ensayo de co-sedimentación de F-actina de alta velocidad. ( A ) Se incubaron concentraciones crecientes (0,125-12,0 mu M) de homodímero de alpha - catenina con (paneles de la izquierda) o sin (paneles de la derecha) 0,2 mu M de actina F estabilizada con phalloidinorte. Se incubaron durante 30 min a TA y se centrifugaron. El total (7,5% del material de partida) y el material granulado (50% del material en forma de gránulo) se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con colorante Coomassie. ( B ) 4 μ M BSA se ejecutó como un control negativo. Las muestras totales y de pellets, con (+) o sin (-) F-actina, se separaron por SDS-PAGE y se tiñeron con colorante de Coomassie. ( C ) La α-catenina unida (μM / μM de actina) de A se representó contra la α-catenina libre (μM) y los datos se ajustaron a una ecuación de Hill (línea roja). Se enumeran los coeficientes Kd, Bmax y Hill (h). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55613/55613fig2.jpg" /> Figura 2: Cuantificación de la peletización con actina </sTrong&gt; - diagrama de flujo. Este esquema describe los pasos clave en la sección 5, con ejemplos de muestras de Total y Pellet ( A , CE ) y la curva estándar ( B ) utilizada para la cuantificación. 5.13 pasos: 1 ) Medir la cantidad de proteína de interés en las muestras totales (A). 2 ) Genere una curva estándar trazando la intensidad de banda frente a la masa de proteína (B). 3 ) Medir la cantidad de proteína de interés que co-sedimentado con F-actina ( C ). 4 ) Mida la cantidad de proteína de interés que sedimentó en ausencia de F-actina ( D ). 5 ) Sustraiga D de C para determinar la cantidad de proteína unida a F-actina. 6 ) Mida la cantidad de F-actina en cada pellet (E), calcule la cantidad promedio de F-actina por muestra y divida cada muestra por el promedio (los números abajo muestran la relación). 7 )Para cada muestra, divida la cantidad de proteína unida (calculada en el paso 5) por la proporción de gránulos de actina F (calculada en el paso 6) para ajustar las diferencias en el gránulo. 8 ) Utilice la curva estándar ( B ) para calcular la cantidad (masa) de proteína unida normalizada en cada muestra (paso 7). 9 ) Determine la concentración de proteína libre y proteína unida para crear una curva de unión. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55613/55613fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Este protocolo describe un método para probar la capacidad de una proteína para co-sedimentar con actina filamentosa (F-actina) y, si se observa unión, para medir la afinidad de la interacción.

Medición de la unión de proteínas a actina F por co-sedimentación

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

measuring-protein-binding-to-f-actin-by-co-sedimentation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

16.3K vistas.  University of Pittsburgh School of Medicine.  Este protocolo describe un método para probar la capacidad de una proteína para co-sedimentar con actina filamentosa (F-actina) y, si se observa unión, para medir la afinidad de la interacción. 

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Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Investigación

Bioquímica

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a major pharmacological target for multiple indications, including analgesia, blood pressure regulation, and the treatment of psychiatric disease. Upon ligand binding, GPCRs catalyze the activation of intracellular G-proteins by stimulating the incorporation of guanosine triphosphate (GTP). Activated G-proteins then stimulate signaling pathways that elicit cellular responses. GPCR signaling can be monitored by measuring the incorporation of a radiolabeled and non-hydrolyzable form of GTP, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), into G-proteins. Unlike other methods that assess more downstream signaling processes, [35S]GTP&#947;S binding measures a proximal event in GPCR signaling and, importantly, can distinguish agonists, antagonists, and inverse agonists. The present protocol outlines a sensitive and specific method for studying GPCR signaling using crude membrane preparations of an archetypal GPCR, the &#181;-opioid receptor (MOR1). Although alternative approaches to fractionate cells and tissues exist, many are cost-prohibitive, tedious, and/or require non-standard laboratory equipment. The present method provides a simple procedure that enriches functional crude membranes. After isolating MOR1, various pharmacological properties of its agonist, [D-Ala, N-MePhe, Gly-ol]-enkephalin (DAMGO), and antagonist, naloxone, were determined.

Guanosine triphosphate (GTP) binding is one of the earliest events in G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) activation. This protocol describes how to pharmacologically characterize specific GPCR-ligand interactions by monitoring the binding of the radio-labeled GTP analog, [35S]guanosine-5&#39;-O-(3-thio)triphosphate ([35S]GTP&#947;S), in response to a ligand of interest.

Medición de la señalización del receptor acoplado a la proteína G mediante unión de GTP marcada con radio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto the endosomal membrane. We have established a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to genetic and biochemical manipulations. Endosomal fractions are prepared by floatation in sucrose gradients from cells expressing the early endosomal protein GFP-RAB5. Cytosolic fractions are prepared from separate batches of cells. Both endosomal and cytosolic fractions can be stored frozen in liquid nitrogen, if needed. In the assay, the endosomal and cytosolic fractions are mixed, and the mixture is incubated at 37 &#176;C under appropriate conditions (e.g., ionic strength, reducing environment). At the desired time, the reaction mixture is fixed, and the F-actin is revealed with phalloidin. Actin nucleation and polymerization are then analyzed by fluorescence microscopy. Here, we report that this assay can be used to investigate the role of factors that are involved either in actin nucleation on the membrane, or in the subsequent elongation, branching, or crosslinking of F-actin filaments.

In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes

Early endosome functions depend on F-actin polymerization. Here, we describe a microscopy-based in vitro assay that reconstitutes the nucleation and polymerization of F-actin on early endosomal membranes in test tubes, thus rendering this complex series of reactions amenable to biochemical and genetic manipulations.

In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos

Many early endosome functions, particularly cargo protein sorting and membrane deformation, depend on patches of short F-actin filaments nucleated onto ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding interactions. This information is critical in the design of new pharmaceutical compounds. However, many pharmaceutically relevant ligands are chemically unstable at the high temperatures used in DSC analyses. Thus, measuring binding interactions is challenging because the concentrations of ligands and thermally-converted products are constantly changing within the calorimeter cell. Here, we present a protocol using thermolabile ligands and DSC for rapidly obtaining thermodynamic and kinetic information on the folding, binding, and ligand conversion processes. We have applied our method to the DNA aptamer MN4 that binds to the thermolabile ligand cocaine. Using a new global fitting analysis that accounts for thermolabile ligand conversion, the complete set of folding and binding parameters are obtained from a pair of DSC experiments. In addition, we show that the rate constant for thermolabile ligand conversion may be obtained with only one supplementary DSC dataset. The guidelines for identifying and analyzing data from several more complicated scenarios are presented, including irreversible aggregation of the biomolecule, slow folding, slow binding, and rapid depletion of the thermolabile ligand.

We present a protocol for rapid characterization of biomolecular folding and binding interactions with thermolabile ligands using differential scanning calorimetry.

Medición de perfiles Biomolecular DSC con ligandos termolábiles para caracterizar rápidamente doblar y atar las interacciones

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant strains. Carbohydrate substrate binding proteins (SBPs) represent viable targets for the development of protein-based vaccines and new antimicrobials because of their extracellular localization and the centrality of carbohydrate import for pneumococcal metabolism, respectively. Described here is a rationalized integrated protocol to carry out a comprehensive characterization of SP0092, which can be extended to other carbohydrate SBPs from the pneumococcus and other bacteria. This procedure can aid the structure-based design of inhibitors for this class of proteins. Presented in the first part of this manuscript are protocols for biochemical analysis by thermal shift assay, multi angle light scattering (MALS), and size exclusion chromatography (SEC), which optimize the stability and homogeneity of the sample directed to crystallization trials and so enhance the probability of success. The second part of this procedure describes the characterization of the SBP crystals using a tunable wavelength anomalous diffraction synchrotron beamline, and data collection protocols for measuring data that can be used to resolve the crystallized protein structure.

A streamlined protocol for performing an extensive biochemical and structural characterization of a carbohydrate substrate binding protein from Streptococcus pneumoniae is presented.

Caracterización bioquímica y estructural de la SP0092 de proteína de unión a sustrato de transporte de hidratos de carbono

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic properties of the absorbed/immobilized mass on sensor surfaces, allowing the measurements of the interaction of proteins with solid-supported surfaces, such as lipid bilayers, in real-time and with a high sensitivity. Annexins are a highly conserved group of phospholipid-binding proteins that interact reversibly with the negatively charged headgroups via the coordination of calcium ions. Here, we describe a protocol that was employed to quantitatively analyze the binding of annexin A2 (AnxA2) to planar lipid bilayers prepared on the surface of a quartz sensor. This protocol is optimized to obtain robust and reproducible data and includes a detailed step-by-step description. The method can be applied to other membrane-binding proteins and bilayer compositions.

Here, we present an experimental protocol that can be employed to determine the binding affinities and mode of interaction of label-free phospholipid-binding protein annexin A2 with immobilized solid-supported bilayers (SLB) by simultaneously measuring the mass uptake and the viscoelastic properties of the protein annexin A2.

Microgravimetry disipativo para estudiar la dinámica de unión de la fosfolípido vinculante proteínas anexina A2 a bicapas de lípidos respaldados por el sólido utilizando un resonador de cuarzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Medición e interpretación de las tasas de consumo de oxígeno en su totalidad operan segmentos de cabeza

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

Medición de alta sensibilidad de transcripción DNA Factor obligatorio afinidades por valoración competitiva utilizando microscopía de fluorescencia

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

Análisis del plegamiento de la proteína, el transporte y degradación en las células vivas por pulso radiactivo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...