هذا العمل معتمد من قبل جامعة تاكاساكي للصحة والرعاية الاجتماعية.

1-زراعة الخلايا وإضافة المستضدات خارجية المنشأ بوفا <ol><li>تحضير تستخدم وصفها بروتين البيوتين كيت بعد الشركة المصنعة &#39; بروتوكول s. 
	ملاحظة: عادة، بوفا يحتوي على البيوتين م 2 الواحدة 1 "متر البويضات" في المتوسط-</li>
	<li>الخلايا DC2.4 تنمو في ربمي-1640 تستكمل مع مم 2 لتر-الجلوتامين، بيروفات صوديوم 1 مم والأحماض الأمينية غير الأساسية 0.1 مم، 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين، 55 مم 2-mercaptoethanol، 10 مم حبيس (درجة الحموضة 7.5) ومصل العجل الجنين 10% (يشار إليها فيما بعد ربمي) عند 37 درجة مئوية في 5 % CO 2 في حاضنة هوميديفيد (يشار إليها فيما بعد دون ذكر، الخلايا هي المحتضنة في هذا الشرط). من الممكن أيضا استخدام دميم وتستكمل مع 10% مصل العجل الجنين، 3.7 غرام/لتر ناكو 3 (يشار إليها فيما بعد دميم) بدلاً من ربمي.</li>
	<li>في اليوم قبل تنقية، تقسيم الخلايا إلى ربمي إلى 1 × 10 5 خلايا/مل في صفيحة زراعة الأنسجة. تجنب حفظ الخلايا في دولة المتلاقية. خلايا DC2.4 يمكن إدراج الغاية المستضدات خارجية المنشأ حتى دولة شبه المتلاقية، ولكن تفقد القدرة بسرعة بعد التوصل إلى إقامة دولة روافد الإفراط.</li>
	خلايا <li>قبل DC2.4 شبه المتلاقية وإضافة 250 ميكروغرام/مل من بوفا 1 × 10 6 خلايا/مل واحتضانها حاء – 2-4 
	ملاحظة: أثناء تجارب المصب، كافة المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة وتحفظ في 4 درجات مئوية ما لم يبين خلاف ذلك.</li>
</ol> 2. إعداد ميكروسوميس <ol><li>حصاد الخلايا DC2.4 من بيبيتينج رقيقة من لوحة النسيج في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.</li>
	<li>الطرد المركزي في غ س 1,000 لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، وإزالة بعناية المتوسطة مع بوفا بتطلع.</li>
	<li>تغسل الخلايا DC2.4 مرتين مع 40 مل من برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (1.37 ملم كلوريد الصوديوم، 8.1 مم نا 2 هبو 4 مم 2.68 بوكل، 1.47 م خ 2 ص 4) باستخدام الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق، 4 درجة مئوية، وتجاهل المادة طافية في كل مرة بتطلع.</li>
	<li>ريسوسبيند بيليه في الخطوة 2، 3 في 1-2 مل (1/20-1/10 حجم الثقافة المتوسطة) من متوسطة التجانس (0.25 م السكروز، 1 مم يدتا، 10 مم حبيس-هيدروكسيد الصوديوم [الأس الهيدروجيني 7.4]) مع حجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز ونقل DC2.4 ريسوسبينديد الخلايا في المثلج دونس الخالطون-</li>
	تعطيل <li>الخلايا DC2.4 ريسوسبينديد بلطف من 10-20 السكتات الدماغية مع الخالطون دونس المثلج. 
	ملاحظة: أثناء الخطوة التعطيل، الخالطون دونسي يتم تبريده في مدت</li>
	<li>نقل تعليق تعطلت الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديدة.</li>
	<li>إضافة المتوسطة التجانس مل 8-9 إلى 10 مل مجموع والطرد المركزي الأنبوبة المخروطية لمدة 10 دقائق في 000 2 × ز و 4 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل المادة طافية إلى أنبوب 15 مل مخروطية الشكل جديد لإزالة الخلايا غير منقطعة ونوى، والطرد المركزي الأنبوبة المخروطية مرة أخرى لمدة 10 دقيقة في 000 2 × ز و 4 درجة مئوية.</li>
	<li>نقل المادة طافية في أنبوب تنبيذ فائق جديد وجهاز الطرد المركزي لمدة 45 دقيقة في 000 100 × ز و 4 درجة مئوية.</li>
	<li>نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه بعناية في 1-2 مل متوسطة التجانس مع حجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز التي بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً عدة مرات لجعل جزء ميكروسومي لتجارب المتلقين للمعلومات-</li>
	<li>نقل الكسر ميكروسومي في أنبوب أسفل 5 مل جولة جديدة- 
	ملاحظة: بعد هذه الخطوة، فمن الممكن لإثراء موضوعي ميكروسوميس بكثافة إيوديكسانول التدرج الطرد المركزي وفقا للشركة المصنعة &#39; بروتوكول s، لإزالة ميكروسوميس غير محددة. الكسور الذروة المستضدات خارجية المنشأ وتم جمعها وتعرض ثم انتقل إلى الخطوة التالية لتنقية (الخطوة 3)-</li>
</ol> 3. تنقية ميكروسوميس مع بوفا "أراد تمر" الخرز SA المغناطيسي <ol><li>حجم إضافة 1/100 من جديد لكسر ميكروسومي خطوة 2.11 في 5 مل جولة الأنبوبة السفلي. 
	ملاحظة: قبل هذه الخطوة، أنه من الممكن قبل مسح جزء ميكروسومي بالخرز التحكم المغناطيسي لتقليل التلوث microsomes غير محددة.</li>
	<li>بلطف المزيج جيدا وتدوير أنبوب أسفل جولة ببطء لمدة 30 دقيقة في 4 ° C.</li>
	<li>إضافة 2-3 مل من تجانس المتوسطة لمجموع 4 مل في أنبوب أسفل جولة ولطف مزيج جيد.</li>
	<li>وضع أنبوب أسفل جولة على الوقوف مغناطيسية واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. منذ الخرز منضمة إلى الحويصلات تنجذب إلى المغناطيس، الخرز الصغير البنى سوف تتراكم تدريجيا على جدار الأنبوبة الأقرب إلى المغناطيس.</li>
	<li>مع الأنبوب المتبقية في موقف المغناطيسي، بعناية تجاهل في supernatants بالتطلع إزالة الحويصلات غير منضم.</li>
	<li>أغسل الخرز المغناطيسي ملزمة للحويصلات مرتين مع 5 مل متوسطة التجانس المغناطيسي الوقوف لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية في كل مرة بتطلع بعناية. 
	ملاحظة: دون الوقوف المغناطيسي، تنقية قبل سينتريفوجيشنز في 2,000 س ز لمدة 10 دقائق، 4 درجة مئوية يتوفر أيضا.</li>
	<li>الخرز المغناطيسي منضم إلى الحويصلات بعناية في 100 ميليلتر التجانس المتوسطة حسب بيبيتينج الحل صعودا وهبوطاً عدة مرات ريسوسبيند-</li>
	<li>نقل الحويصلات ريسوسبينديد إلى microtube جديد ميكروسومي المنقي لتجارب المتلقين للمعلومات- 
	ملاحظة: عادة، 50 ميليلتر ميكروسومي جزء يحتوي على 5-20 ميكروغرام البروتينات من 1 × 10 7 الخلايا يمكن أن تكون معزولة.</li>
</ol> 4. تحليل Microsomes تنقية <ol><li>ريسوسبيند المغناطيسي الخرز منضمة إلى الحويصلات من 3.8 خطوة 100-200 ميليلتر من TNE المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، يدتا 0.5 M، 1% P-40 نونيديت) بحجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز بدلاً من المتوسطة التجانس.</li>
	<li>نقل من الخطوة 4، 1 إلى microtube 1.5 مل جديدة.</li>
	<li>تحديد تركيز البروتين من الخطوة 4، 2 باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اتفاق التعاون الأساسي للشركة المصنعة &#39; بروتوكول s- 
	ملاحظة: عادة ما يكون 5-10 ميليلتر من الخطوة 4، 2 ما يكفي لتحديد تركيز البروتين.</li>
	<li>نقل من الخطوة 4، 2 (2 ميكروغرام من البروتين لتلطيخ فضية و 10 ميكروغرام من البروتين النشاف الغربية) إلى microtubes الجديدة-</li>
	<li>وضعت في microtubes على كتلة حرارة في البروتينات 95 درجة مئوية، ويغلي في 1 × مخزونات النشر الاستراتيجي جل تحميل المخزن المؤقت (100 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 200 ملم ديثيوثريتول، الحزب الديمقراطي الصربي 4%، 0.2% بروموفينول الأزرق، والغليسيرول 20 ٪) للحد الأدنى 5</li>
	<li>الطرد المركزي microtubes لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 درجة مئوية. جمع في سوبيرناتانتس إلى microtubes جديدة لإزالة أجزاء غير قابلة للذوبان.</li>
	<li>تحليل البروتينات حلها في خطوة 4.6 (2 ميكروغرام) من صفحة SD القياسية.</li>
	<li>تصور عدة نطاقات البروتين بالفضية التلوين باستخدام صبغة الفضة عقب الشركة المصنعة &#39; بروتوكول s-</li>
	<li>تحليل البروتينات حلها في خطوة 4.6 (10 ميكروغرام) صفحة SD القياسية والنشاف الغربية. استخدام الكاشف (SA-برنامج الصحة الإنجابية) لكل الشركة المصنعة &#39; s البروتوكول وتصور طريق فلوروجرافي-</li>
</ol> 5. في المختبر إعادة تشكيل "أوبيكويتينيشن أراد" من بوفا "استخدام تنقية ميكروسوميس" ميكروسوميس <ol><li>نقل تنقية (5-10 ميكروغرام من البروتين) من الخطوة 3.8 بحجم خلية شبكية ليستي (RL)، 50% في 1 س رد فعل المخزن المؤقت (50 مم تريس الأس الهيدروجيني 7.4، 3 مم ATP، 0.5 مم مجكل 2)، و 12:02 م معلم العلم أوبيكويتين في microtube جديد. الحجم النهائي لهذه التجربة هو ميليلتر 20-40-</li>
	<li>إينكوباتي microtube ح 2 في 37 درجة مئوية. 
	ملاحظة: إذا كان مقدار بوفا أوبيكويتيناتيد في الخطوة 5، 12 صغير جداً للكشف عن طريق النشاف الغربية، إضافة 10 ميكرون من MG132 أو 2 ميكرومتر من لاكتاسيستين تحول دون معالجة بوفا أوبيكويتيناتيد من بروتيسوميس-</li>
	<li>وقف رد الفعل بوضع microtube على مدت</li>
	<li>حل في microsomes بإضافة 500 ميليلتر TNE من المخزن المؤقت بحجم 1/1,000 الكوكتيل مثبط البروتياز.</li>
	<li>الطرد المركزي microtube لمدة 10 دقائق في 21,500 x ز و 4 درجة مئوية. جمع في supernatants في microtube جديدة لإزالة الكسور غير قابلة للذوبان، التي تتضمن بوفا أوبيكويتيناتيد في DC2.4 قبل الفحص في المختبر أوبيكويتينيشن.</li>
	<li>نقل المادة طافية microtube جديدة وإضافة المجلد 1/100 من حبات SA المغناطيسي الجديد (عادة 5 ميليلتر ل 500 ميليلتر من سوبيرناتانتس).</li>
	<li>المزيج جيدا بلطف وتدوير microtube ببطء لمدة 30 دقيقة في 4 ° C.</li>
	<li>الطرد المركزي microtube لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 ° جيم تجاهل المادة طافية بالتطلع استرداد بوفا وأوبيكويتيناتيد بوفا ملزمة مع الخرز سا-المغناطيسية-</li>
	<li>يغسل مرتين الخرز سا-المغناطيسية التي تم جمعها مع 1 مل من TNE المخزن المؤقت باستخدام الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 ° جيم تجاهل المادة طافية في كل مرة بتطلع.</li>
	<li>غلى الخرز سا-المغناطيسية في 1 س جل الحزب الديمقراطي الصربي تحميل المخزن المؤقت لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية في حرارة كتلة حل البروتينات المنقاة بالخرز سا-المغناطيسية-</li>
	<li>الطرد المركزي microtube لمدة 10 دقائق في 21,500 س ز و 4 درجة مئوية. جمع في supernatants في microtube جديدة لإزالة أجزاء غير قابلة للذوبان.</li>
	تحليل <li>SA المغناطيسي الخرز ملزمة للبروتينات بصفحة SD القياسية والنشاف الغربية. استخدام الأجسام المضادة (المضادة العلم ومكافحة--متعددة--يو بي الماوس المضادة IgG-برنامج الصحة الإنجابية) والكاشف (SA-HRP) كل الشركة المصنعة &#39; بروتوكول s وتصور طريق فلوروجرافي-</li>
</ol>

<ol>
	<li>van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Providing+ligands+for+MHC+class+I+molecules.">Providing ligands for MHC class I molecules.</a> Cell Mol Life Sci. 68 (9), 1467-1469 (2011).</li><li>Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).</li><li>McDevitt, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+the+role+of+the+major+histocompatibility+complex+in+the+immune+response.">Discovering the role of the major histocompatibility complex in the immune response.</a> Annu Rev Immunol. 18 (1), 1-17 (2000).</li><li>Bedoui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation+of+viral+and+self+antigens+by+skin-derived+CD103++dendritic+cells.">Cross-presentation of viral and self antigens by skin-derived CD103+ dendritic cells.</a> Nat Immunol. 10 (5), 488-495 (2009).</li><li>Segura, E., Villadangos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+presentation+by+dendritic+cells+in+vivo.">Antigen presentation by dendritic cells in vivo.</a> Curr Opin Immunol. 21 (1), 105-110 (2009).</li><li>Cheong, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+stimulation+fully+differentiates+monocytes+to+DC-SIGN/CD209(+)+dendritic+cells+for+immune+T+cell+areas.">Microbial stimulation fully differentiates monocytes to DC-SIGN/CD209(+) dendritic cells for immune T cell areas.</a> Cell. 143 (3), 416-429 (2010).</li><li>Henri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD207++CD103++dermal+dendritic+cells+cross-present+keratinocyte-derived+antigens+irrespective+of+the+presence+of+Langerhans+cells.">CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells.</a> J Exp Med. 207 (2), 189-206 (2010).</li><li>Shortman, K., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD8++dendritic+cell+subset.">The CD8+ dendritic cell subset.</a> Immunol. Rev. 234 (1), 18-31 (2010).</li><li>Carbone, F. R., Kurts, C., Bennett, S. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation:+a+general+mechanism+for+CTL+immunity+and+tolerance.">Cross-presentation: a general mechanism for CTL immunity and tolerance.</a> Immunol Today. 19 (8), 368-373 (1998).</li><li>Nair-Gupta, P., Blander, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+view+of+the+intracellular+mechanisms+regulating+cross-presentation.">An updated view of the intracellular mechanisms regulating cross-presentation.</a> Front Immunol. , (2013).</li><li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation+by+dendritic+cells.">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li><li>Kurts, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo.">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J Exp Med. 184 (3), 923-930 (1996).</li><li>Kurts, C., Kosaka, H., Carbone, F. R., Miller, J. F., Heath, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+I-restricted+cross-presentation+of+exogenous+self-antigens+leads+to+deletion+of+autoreactive+CD8(+)+T+cells.">Class I-restricted cross-presentation of exogenous self-antigens leads to deletion of autoreactive CD8(+) T cells.</a> J Exp Med. 186 (2), 239-245 (1997).</li><li>Bonifaz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+targeting+of+protein+antigen+to+the+dendritic+cell+receptor+DEC-205+in+the+steady+state+leads+to+antigen+presentation+on+major+histocompatibility+complex+class+I+products+and+peripheral+CD8++T+cell+tolerance.">Efficient targeting of protein antigen to the dendritic cell receptor DEC-205 in the steady state leads to antigen presentation on major histocompatibility complex class I products and peripheral CD8+ T cell tolerance.</a> J Exp Med. 196 (12), 1627-1638 (2002).</li><li>Heath, W. R., Carbone, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-presentation+in+viral+immunity+and+self-tolerance.">Cross-presentation in viral immunity and self-tolerance.</a> Nat Rev Immunol. 1 (2), 126-134 (2001).</li><li>Imai, J., Hasegawa, H., Maruya, M., Koyasu, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exogenous+antigens+are+processed+through+the+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+(ERAD)+in+cross-presentation+by+dendritic+cells.">Exogenous antigens are processed through the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) in cross-presentation by dendritic cells.</a> Int Immunol. 17 (1), 45-53 (2005).</li><li>Houde, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosomes+are+competent+organelles+for+antigen+cross-presentation.">Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation.</a> Nature. 425 (6956), 402-406 (2003).</li><li>Guermonprez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-phagosome+fusion+defines+an+MHC+class+I+cross-presentation+compartment+in+dendritic+cells.">ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells.</a> Nature. 425 (6956), 397-402 (2003).</li><li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation.">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nat Immunol. 9 (5), 558-566 (2008).</li><li>Liz&#233;e, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+cell+cross-presentation+by+the+major+histocompatibility+complex+class+I+cytoplasmic+domain.">Control of dendritic cell cross-presentation by the major histocompatibility complex class I cytoplasmic domain.</a> Nat Immunol. 4 (11), 1065-1073 (2003).</li><li>Basha, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD74-dependent+MHC+class+I+endolysosomal+cross-presentation+pathway.">A CD74-dependent MHC class I endolysosomal cross-presentation pathway.</a> Nat Immunol. 13 (3), 237-245 (2012).</li><li>Saveanu, L., Carroll, O., Hassainya, Y., van Endert, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complexity,+contradictions,+and+conundrums:+studying+post-proteasomal+proteolysis+in+HLA+class+I+antigen+presentation.">Complexity, contradictions, and conundrums: studying post-proteasomal proteolysis in HLA class I antigen presentation.</a> Immunol Rev. 207 (1), 42-59 (2005).</li><li>Wiertz, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sec61-mediated+transfer+of+a+membrane+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+to+the+proteasome+for+destruction.">Sec61-mediated transfer of a membrane protein from the endoplasmic reticulum to the proteasome for destruction.</a> Nature. 384 (6608), 432-438 (1996).</li><li>Hampton, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER-associated+degradation+in+protein+quality+control+and+cellular+regulation.">ER-associated degradation in protein quality control and cellular regulation.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (4), 476-482 (2002).</li><li>Tsai, B., Ye, Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-translocation+of+proteins+from+the+endoplasmic+reticulum+into+the+cytosol.">Retro-translocation of proteins from the endoplasmic reticulum into the cytosol.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (4), 246-255 (2002).</li><li>Nyathi, Y., Wilkinson, B. M., Pool, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-translational+targeting+and+translocation+of+proteins+to+the+endoplasmic+reticulum.">Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum.</a> Biochim Biophys Acta. 1833 (11), 2392-2402 (2013).</li><li>Varabyova, A., Stojanovski, D., Chacinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+protein+homeostasis.">Mitochondrial protein homeostasis.</a> IUBMB Life. 65 (3), 191-201 (2013).</li><li>Shen, Z., Reznikoff, G., Dranoff, G., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloned+dendritic+cells+can+present+exogenous+antigens+on+both+MHC+class+I+and+class+II+molecules.">Cloned dendritic cells can present exogenous antigens on both MHC class I and class II molecules.</a> J Immunol. 158 (6), 2723-2730 (1997).</li><li>Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+the+subcellular+compartment+in+which+exogenous+antigens+undergo+endoplasmic+reticulum-associated+degradation+from+dendritic+cells.">Purification of the subcellular compartment in which exogenous antigens undergo endoplasmic reticulum-associated degradation from dendritic cells.</a> Heliyon. , (2016).</li><li>Kovacsovics-Bankowski, M., Rock, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phagosome-to-cytosol+pathway+for+exogenous+antigens+presented+on+MHC+class+I+molecules.">A phagosome-to-cytosol pathway for exogenous antigens presented on MHC class I molecules.</a> Science. 267 (5195), 243-246 (1995).</li><li>Ackerman, A. L., Giodini, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+endoplasmic+reticulum+protein+retro+translocation+machinery+during+cross+presentation+by+dendritic+cells.">A role for the endoplasmic reticulum protein retro translocation machinery during cross presentation by dendritic cells.</a> Immunity. 25 (4), 607-617 (2006).</li><li>Ackerman, A. L., Kyritsis, C., Tamp&#233;, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens.">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li><li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation.">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li><li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8(+)+T+cells.">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

في الدراسات السابقة لحزب المحافظين، تراكمت المستضدات خارجية المنشأ مدرجة في المنطقة المحظورة من دخلول المتأخرة أو ER بالفحص المجهري إيمونوفلوريسسينت16،30،،من3132. ومن المقدر أن أراد مثل النقل والتجهيز من المستضدات خارجي...

MHC أنا يعبر عن الجزيئات على السطح لكافة الخلايا المنواه، مع الببتيدات مستضدي قصيرة مستمدة من المستضدات الذاتية، التي تتم معالجتها بواسطة نظام ubiquitin-بروتوزوم في سيتوسول1. بعد المعالجة، تنقل الناقل الببتيد الصنبور الببتيدات المستضديه في التجويف هيولى (ER). في التجويف ER، سلسلة من مرافقين محددة مساعدة في تحميل الببتيد والطي الصحيحة من MHC أنا معقدة. هذه السلسلة من الجزيئات تسمى مجمع الببتيد-تحميل (PLC)، مشيراً إلى أن لائحة حجرة مركزية الببتيد تحميل عند MHC2. بعد تحميل، ببتيد MHC أنا الجزيئات يتم نقلها إلى سطح الخلية وتلعب دوراً رئيسيا في النظام المناعي التكيفي كعلامات الذاتية، وتمكن CD8+ اللمفاويات T السامة للخلايا (CTLs) للكشف عن الخلايا السرطانية أو العوامل المعدية بمولده الببتيدات من البروتينات غير المتمتعة بالحكم الذاتي3.
في مستضد تقديم الخلايا (APC)، الببتيدات مستضدي من المستضدات خارجية المنشأ كما عرضت عليها MHC أنا4،5،6،،من78 عبر حزب المحافظين، الذي يتم أساسا من قبل وحدات تحكم المجال Dc10،،من911. CP أمر ضروري سواء بالنسبة لتنشيط السذاجة CD8+ تي الخلايا وذاكرة CD8 الخلايا+ تي في مكافحة الأمراض المعدية ومكافحة الأورام CTLs12،13، وفي الحفاظ على التسامح المناعية قبل يخمد من الذاتي بالإنابة السذاجة تي الخلايا14،15. حزب المحافظين يلعب العديد من الأدوار الهامة في النظام المناعي التكيفي، إلا أن الآليات الجزيئية لحزب المحافظين ولم توصف بالتفصيل. وكشفت الدراسات السابقة لحزب المحافظين أن المستضدات خارجية المنشأ كانت المترجمة لائحة ودخلول على حد سواء، وتم معالجتها بواسطة أراد، مما يوحي بأن تنقل المستضدات خارجية المنشأ من دخلول إلى لائحة للتجهيز مثل أراد والببتيد تحميل16 . ومع ذلك، تشير الأدلة تراكم إلى الاضطلاع بتحميل الببتيد CP لا لائحة وإنما في أماكن اندوسيتيك غير الكلاسيكية، التي لديها أيضا السمات المميزة لل ER (الشكل 1)17،18 ،19،،من2021. لتجنب تدهور السلائف ببتيد مستضدي بنشاط أمينوبيبتيداسي عالية يحدث22 في سيتوسول والتجهيز والببتيد تحميل في حزب المحافظين في المنطقة القريبة من هذه المقصورات اندوسيتيك غير الكلاسيكية (الشكل 1). على الرغم من أن الأوصاف من هذه المقصورات اندوسيتيك مثيرة للجدل، وهناك لا جزيئات محددة موجودة عدا المستضدات خارجية المنشأ في هذه المقصورة.
أراد هو مسار خلوية، وعلى وجه التحديد إلى إزالة البروتينات تجمعات لائحة. في مسار أراد، تنقل عبر غشاء ER إلى السيتوبلازم ريتروجراديلي تجمعات البروتينات ومعالجتها بواسطة نظام ubiquitin-بروتوزوم23،24،25. عندما يتم نقل الجزيئات الكبيرة، مثل البروتينات، عن طريق بلير الدهن، هذه الجزيئات المرور عبر جهاز جزيئي يسمى ترانسلوكون، مثل مجمع Sec61 وديرلان المعقدة في أية26، ومجمع توم وتيم المعقدة في 27من الميتوكوندريا. عندما أضيف مناشئ المستضدات تنقل عبر غشاء ER، أنهم يجب أن تخترق bilayer الدهني في المجمع مع ترانسلوكونس، مثل مجمع Sec61. الأسلوب الموصوفة هنا تنقية حويصلة المستهدفة باستخدام هذه الجزيئات اختراق الغشاء كعلامات للمقصورات اندوسيتيك.
الأسلوب الموصوفة هنا بروتوكول تنقية حويصلة جديدة تستخدم في الخلية مثل العاصمة خط DC2.428 وبيوتينيلاتيد أوفالبومين (بوفا) مستضد خارجية. تم تنقية المقصورات اندوسيتيك من ستريبتافيدين (SA)-المغناطيسي الخرز استخدام بوفا اختراق الغشاء كصانع. في هذا ميكروسومي المنقي، بعض مناشئ أضيف بوفا المحافظة لا تزال في غشاء الكسور ولكن نقلها إلى الخارج من ميكروسومي ومن ثم أوبيكويتيناتيد ومعالجتها في المختبر29. هذا المنقي ميكروسومي الواردة اندوسيتيك الخاصة بحجرة البروتينات ليس فقط، بل أيضا البروتينات ER-المقيم أراد والببتيد تحميل المعقدة؛ مما يدل على أن حجرة الخلوية حجرة اندوسيتيك المحتملين لحزب المحافظين29. هذا البروتوكول لا يتوقف على نوع المستضدات خارجية المنشأ، وينطبق أيضا لمجموعات فرعية DC الأخرى وأنواع الخلايا الأخرى، مثل الضامة وخلايا ب وخلايا بطانية، لتوضيح إليه الجزيئي الدقيق لوحدات تحكم المجال Dc CP يتقن.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>gibco by life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penisicillin-Sreptomycin</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco by life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-protein labelling kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>lactacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktails</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>iodixanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-magnetic beads</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>control magnetic beads</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>silver staining kits</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Reticulocyte Lysate</td><td>Promega</td><td>1730714</td><td></td></tr><tr><td>Flag-tagged ubiquitin</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>anti-ovalbumin (OVA,mouse)</td><td>Antibody Shop</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>ant-multi-ubiquitin (mouse)</td><td>MBL</td><td>D058&amp;minus;3</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag (mouse)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of the membrane compartment for endoplasmic reticulum-associated degradation of exogenous antigens in cross-presentation

الخلايا الجذعية (DCs) قادرون على درجة عالية من تجهيز وتقديم المستضدات خارجية المنشأ المدخلة على الفئة الرئيسية هيستوكومباتيبيليتي (MHC) أنا جزيئات تعرف أيضا باسم الصليب-العرض التقديمي (CP). CP يلعب دوراً هاما ليس فقط في تحفيز السذاجة CD8+ تي الخلايا وذاكرة CD8+ تي الخلايا للمعدية وحصانة الورم بل أيضا في المنظمة سيلفاكتينج الخلايا السذاجة تي استعطال خلية T أو حذف خلايا T. على الرغم من أن الآلية الجزيئية الحرجة من حزب المحافظين توضيح، تراكم الأدلة تشير إلى أن تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ عن طريق المرتبطة هيولى تدهور (أراد) بعد التصدير غير الكلاسيكية اندوسيتيك الأجزاء الأخرى. الأوصاف لهذه المقصورات اندوسيتيك حتى وقت قريب، كانت محدودة لأن هناك لا علامات جزيئية محددة خلاف المستضدات خارجية المنشأ. الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية هذه المقصورات اندوسيتيك. باستخدام هذا ميكروسومي المنقي، نحن تشكيلها أراد مثل النقل، أوبيكويتينيشن، وتجهيز مستضد خارجية في المختبر، مما يوحي بأن نظام ubiquitin-بروتوزوم معالجة مستضد خارجية بعد التصدير من هذا حجرة الخلوية. يمكن تطبيق هذا البروتوكول كذلك لأنواع الخلايا الأخرى لتوضيح الآلية الجزيئية لحزب المحافظين.

لتوضيح هذه الآلية الجزيئية لحزب المحافظين، من الضروري تحديد المقصورات الخلوية، حيث يخضع المستضدات خارجية المنشأ أراد مثل النقل والتجهيز. بينما حددت ملاحظاتها بالفحص المجهري إيممونوفلوريسسينت أو بواسطة المجهر الإلكتروني حجرة الخلوية حيث تراكمت المستضدات خارجية المنش...

Watch this Scientific Journal Video about Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation at JoVE.com

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية المقصورات الخلوية حيث تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ بتدهور هيولى المرتبطة في العرض التقديمي عبر.

تنقية المقصورة غشاء للتدهور المرتبطة هيولى المستضدات خارجية المنشأ في العرض التقديمي عبر

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Views.  Takasaki University of Health and Welfare. الأسلوب الموصوفة هنا هو بروتوكول عزلة حويصلة جديدة، مما يسمح لتنقية المقصورات الخلوية حيث تتم معالجة المستضدات خارجية المنشأ بتدهور هيولى المرتبطة في العرض التقديمي عبر.

Video: Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

واسع النطاق تنقية لحم الخنزير أو البقر مبصرة الخارجي قطاعات للالبلعمة فحوصات على خلايا الشبكية صبغات الظهارية

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

إعادة تشكيل نشاط استخراج Msp1 مع مكونات منقى بالكامل

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Biochemistry

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

على طريقة العائد فعالة وعالية لعزل مجموعات فرعية خلية الفأر الجذعية

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

دراسة ديناميات الأعضاء في الخلايا B أثناء تكوين المشبك المناعي

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

عزل وامتصاص الخلايا الشجيرية للحويصلات الصغيرة خارج الخلية من المشوكات الحبيبية

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Intralumenal Vesicles and Multivesicular Bodies

Intraluminal vesicles (ILVs) are small vesicles 50-80 nm in diameter formed during the maturation of early endosomes. A specialized endosome containing numerous ILVs is called a multivesicular body (MVB). ILVs contain internalized molecules such as antigens, nucleic acids, proteins, and metabolites. Some of these molecules are released from the MVBs inside exosomes and are transported to other cells. Other MVBs contain molecules that are retained in the ILVs and are later degraded within the cell.
MVBs were first observed in neuronal cells in 1955 using electron microscopy. MVBs have a diameter of 400-500 nm, are spherical, and were initially thought to be a form of the late endosome; however, recent studies have shown that MVBs are an intermediate form of these organelles between the early and the late endosomes.
ILV formation takes place when a ubiquitin-tagged protein enters the cell in an endocytic vesicle and fuses with the early endosome. As the early endosome matures, the endosomal membrane bends inwards to form ILVs. An ESCRT protein complex mediates ILV formation. Phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) is also required for ILV formation. PtdIns3P acts as a docking site for ESCRTs for the bending of the endosomal membrane.
The ESCRT complex and the ATPase, Vps4, required for ILV formation can be hijacked by enveloped retroviruses that infect host cells. Normally, ILVs are formed inside maturing endosomes with the help of ESCRTs within the cell, and the ubiquitin-tagged proteins are recognized and sorted into ILVs. In contrast, retroviruses use the ESCRTs to be released outside the cell. For example, the human immunodeficiency virus (HIV) codes for proteins, such as Gag, NC-p2, and Tat, that require ubiquitination for export. This ubiquitination is essential because ESCRTs and Vps4 recognize and sort only ubiquitin-tagged proteins into viral buds. Once the viral particles bud off from an infected cell, they are released into the extracellular space to infect other host cells.

الحويصلات داخل الكمض والأجسام متعددة الحويصلات

Intraluminal vesicles (ILVs) are small vesicles 50-80 nm in diameter formed during the maturation of early endosomes. A specialized endosome containing ...

Education

JoVE Core

Cell Biology

Unit 1

Endocytosis and Exocytosis

KEY TERMS AND CONCEPTS

Receptor Downregulation in MVBs

Multivesicular bodies (MVBs) are mature endosomes that sort ubiquitinated proteins and then fuse with lysosomes to degrade the sorted proteins. Epidermal growth factor (EGF) and its receptor (EGFR) form a complex that can be internalized through endocytosis, sorted into an MVB, and later degraded.
The EGFR can initiate signaling pathways that&#160; lead to cell proliferation, migration, and differentiation. Overexpression of EGFR&#160; stimulates cells to proliferate. Excessive&#160; EGFR activation may result in cancer; therefore, EGFR expression must be tightly regulated. The degradation of the EGF-EGFR complex through the endocytic pathway is a means of downregulating EGFR and preventing its overexpression.
EGF binding to EGFR induces EGFR dimerization. EGFR is ubiquitinated by a ubiquitin ligase. Ubiquitination triggers the endocytosis of the dimerized EGF-EGFR complex. Once inside the cell, the complex is first sorted into the early endosome. As the early endosome matures, ESCRT proteins, or endosomal sorting complexes required for transport, translocate&#160; the EGFR-EGF complex into intraluminal vesicles (ILVs). Several ILVs are formed inside the maturing endosome, eventually becoming multivesicular bodies (MVBs). MVBs containing the EGF-EGFR complex then fuses with a lysosome for degradation of the EGFR-EGF complex.
Similar to EGFR, cytokine receptors are also internalized and downregulated by MVBs. Ubiquitinated receptor-cytokine complexes are endocytosed and later delivered to MVBs for degradation. The degradation weakens the cytokine signaling. In the case of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor alpha (TNF&#593;) or interleukin-1 (IL-1), any defect in ubiquitination, endocytosis, or degradation of the receptor-cytokine complex through MVB can cause enhanced or sustained signaling. This may lead to inflammatory diseases like Crohn&#39;s disease or rheumatoid arthritis.

تنظيم المستقبلات في MVBs

Multivesicular bodies (MVBs) are mature endosomes that sort ubiquitinated proteins and then fuse with lysosomes to degrade the sorted proteins. Epidermal ...

Export of Misfolded Proteins out of the ER

After folding, the ER assesses the quality of secretory and membrane proteins. The correctly folded proteins are cleared by the calnexin cycle for transport to their final destination, while misfolded proteins are held back in the ER lumen. The ER chaperones attempt to unfold and refold the misfolded proteins but sometimes fail to achieve the correct native conformation. Such terminally misfolded proteins are then exported to the cytosol by ER-associated degradation or ERAD pathway for degradation.
Different modes of ERAD pathways
Hrd1 is a ubiquitin ligase and a retro-translocation channel for misfolded polypeptides. It complexes with another membrane protein, Hrd3, to form the core ERAD machinery. The other players associated with these core proteins depend upon the topology of the misfolded protein. The retrotranslocation complex depends on the luminal lectin chaperones to identify misfolded proteins. Studies in the yeast system suggest the presence of ERAD-C, ERAD-L, and ERAD-M pathways to export misfolded proteins from various parts of the ER. The target proteins of the ERAD-L and ERAD-M pathways use the Hrd1 channel to exit the ER lumen and membrane, respectively, while the ERAD-C pathway utilizes the Doa10p ubiquitin ligase complex to degrade the cytoplasmic domains of the ER membrane proteins. Sometimes, these pathways can overlap as some misfolded proteins need translocation machinery from two different ERAD pathways to exit the ER. The mammalian ERAD machinery is more complex than yeast and has multiple proteins that export and mark proteins for proteasomal degradation. Eventually, all ERAD pathways converge due to their dependence on a cytoplasmic AAA-ATPase to provide the mechanical force to extract proteins through the membrane.
Degradation of non-glycosylated proteins
The ER has another lectin-independent system that monitors and clears the non-glycosylated proteins from ER. It consists of the resident ER chaperone, BiP protein, and the ER-localized DnaJ family members (ERdjs). ER stress induces the production of HERP, a ubiquitin-like membrane protein, which assembles with other ERAD proteins like the Hrd1 and AAA-ATPase, forming a complex. BiP uses some ERdj proteins as cofactors to recruit non-glycosylated misfolded proteins to the HERP complex for retrotranslocation and ubiquitination of the misfolded protein. HERP is associated with the proteasome on the cytosolic side, where it delivers the misfolded proteins for degradation.

تصدير البروتينات غير المطوية خارج غرفة الطوارئ

After folding, the ER assesses the quality of secretory and membrane proteins. The correctly folded proteins are cleared by the calnexin cycle for ...

Transmembrane Transport in Endoplasmic Reticulum and Peroxisomes

Antigen Presenting Cells

The immune system is a complex network of cells and molecules that protects the body from foreign invaders. T cells, a type of white blood cell, play a crucial role in this process. They recognize and attack foreign substances, such as pathogens, that enter the body.
T cells require the help of antigen-presenting cells (APCs), which process foreign antigens into smaller fragments that can be recognized by T cells. These APCs are highly specialized cells that efficiently internalize antigens through phagocytosis or receptor-mediated endocytosis.
Dendritic cells, a type of professional APC, are particularly efficient at antigen processing and presentation. They are highly mobile and can be found in tissues first exposed to foreign antigens, such as the skin, mucosal surfaces, and lymphoid organs.
Macrophages may also function as APCs, and are found in all tissues. They can engulf and process foreign antigens and release cytokines, which activate T cells and other immune cells, thereby coordinating the immune response.
B cells are another type of APC that can present antigens to T cells. When an antigen is presented to a B cell, it activates the B cell to produce antibodies against the antigen. This activation process involves the binding of the antigen to the B cell receptor, followed by a series of molecular signaling events that produce antibodies.
When an APC engulfs an antigen, it breaks into smaller fragments and combines them with major histocompatibility complex (MHC) molecules. The antigen-MHC complex is then transported to the APC&#39;s plasma membrane, where it is presented to a T cell.
The appropriate T cell receptor recognizes the processed antigen complex, triggering an immune response against the foreign invader. This process is crucial for protecting the body from infection and disease.

الخلايا العارضة للمستضد

Antigen-presenting cells, also known as APCs, process foreign antigens, such as fragments from pathogens, for recognition by T cells.
When an APC engulfs ...