Diese Arbeit wird von der Takasaki Hochschule für Gesundheit und Soziales unterstützt.

1. wachsenden Zellen und Ergänzung der exogene Antigene <ol><li>Prepare bOVA mit einem Biotin-Protein-Kennzeichnung kit nach dem Hersteller &#39; s Protokoll. 
	Hinweis: Normalerweise bOVA enthält 2 M Biotin pro 1 M OVA durchschnittlich.</li>
	<li>Wachsen DC2.4 Zellen RPMI-1640 ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 1 mM Natrium Pyruvat, 0,1 mM nichtessentiellen Aminosäuren, 100 U/mL Penicillin-Streptomycin, 55 mM 2-Mercaptoethanol, 10 mM HEPES (pH 7,5) und 10 % fetalen Kälberserum (im folgenden RPMI) bei 37 ° C in 5 % CO 2 in einem befeuchteten Inkubator (im folgenden ohne Erwähnung, Zellen sind inkubiert in diesem Zustand). Es ist auch möglich, verwenden Sie DMEM mit 10 % fetalen Kälberserum, 3,7 g/L Nahco3 3 (im folgenden DMEM) anstelle von RPMI ergänzt.</li>
	<li>Einen Tag vor der Reinigung, die Zellen in RPMI bis 1 x 10 5 Zellen/mL in einer Gewebekultur Platte aufgeteilt. Vermeiden Sie die Zellen an einem konfluierende Zustand zu halten. DC2.4 Zellen können exogene Antigene hoch bis semi-konfluierende Zustand zu übernehmen, aber schnell verlieren die Fähigkeit nach einer übermäßigen Zusammenfluss Zustand zu erreichen.</li>
	<li>Vor der DC2.4 Zellen sind semi-konfluierende, fügen Sie 250 µg/mL bOVA für 1 x 10 6 Zellen/mL und inkubieren Sie für 2-4 h 
	Hinweis: Während der nachfolgenden Experimente alle Puffer und Reagenzien sind gehalten bei 4 ° C sofern nicht anders angegeben.</li>
</ol> 2. Vorbereitung der Microsomen <ol><li>die DC2.4 Zellen durch sanfte Pipettieren von der Gewebe-Platte in ein neues 50 mL konische Röhrchen ernten.</li>
	<li>Zentrifuge bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C und entfernen Sie vorsichtig das Medium mit bOVA durch Aspiration.</li>
	<li>Die DC2.4 Zellen zweimal mit 40 mL PBS-Puffer (1,37 mM NaCl, 8,1 mM Na 2 HPO 4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH 2 PO 4) durch Zentrifugation bei 1.000 x g für 5 min, 4 ° C zu waschen und entsorgen des Überstands jedesmal durch Absaugen.</li>
	<li>Aufschwemmen das Pellet in Schritt 2.3 in 1-2 mL (1/20-1/10 Volumen Kulturmedium) Homogenisierung Medium (0,25 M Saccharose, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES-NaOH [pH 7.4]) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails und Übertragung der resuspendierte DC2.4 Zellen in einer eiskalte Dounce-Homogenisator.</li>
	<li>Stören die resuspendierte DC2.4 Zellen sanft von 10-20 Schläge mit dem eiskalten Dounce-Homogenisator. 
	Hinweis: Während der Unterbrechung Schritt Dounce-Homogenisator wird gekühlt auf Eis</li>
	<li>Übertragen die Zelle gestört Aussetzung zu einem neuen 15 mL konische Schlauch.</li>
	<li>10 mL insgesamt 8-9 mL Homogenisierung Medium hinzu und Zentrifugieren die konische Röhre für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Übertragen den Überstand auf eine neue 15 mL konische Rohr, ungebrochene Zellen und Kerne entfernen und Zentrifugieren die konische Röhre wieder für 10 min bei 2.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Übertragen den Überstand in ein neues Ultrazentrifugation Rohr und Zentrifuge für 45 Minuten bei 100.000 x g und 4 ° c</li>
	<li>Aspirieren überstand und Aufschwemmen der Pellet sorgfältig in 1-2 mL Homogenisierung Medium mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals in Sekundenbruchteilen Microsome für nachgeschaltete Experimente machen.</li>
	<li>Übertragen die Microsome Bruchteil in ein neues Röhrchen 5 mL Rundboden. 
	Hinweis: Nach diesem Schritt ist es möglich, Objektive Microsomen durch Iodixanol Dichte Gradienten Zentrifugation laut Hersteller bereichern &#39; s-Protokoll, um unspezifische Microsomen zu entfernen. Die Peak-Fraktionen für exogene Antigene werden gesammelt und dann mit dem nächsten Schritt der Reinigung (Schritt 3) unterworfen.</li>
</ol> 3. Reinigung von Microsomen mit bOVA unterziehen ERAD <ol><li>Add 1/100 Volumen von frischen SA-magnetischen Kügelchen auf den Microsome Bruchteil Schritt 2.11 in der 5 mL Runde Unterrohr. 
	Hinweis: Bevor Sie diesen Schritt, es ist möglich, Microsome Bruchteil von Kontrolle-magnetische Beads zu Verunreinigungen der unspezifischen Microsomen vorab klar.</li>
	<li>Sanft vermischen und drehen die Rundboden-Röhre langsam für 30 min bei 4 ° c</li>
	<li>Insgesamt 4 mL in die Rundboden Röhrchen ca. 2-3 mL Homogenisierung Medium hinzufügen und vorsichtig vermengen.</li>
	<li>Ein Magnetstativ Rundboden Rohr aufsetzen und 10 min bei 4 ° c inkubieren Da die Perlen an die Vesikel gebunden der Magnet angezogen sind, braune Mikro-Perlen werden allmählich reichern sich an der Rohrwand am nächsten an den Magneten.</li>
	<li>Mit dem Rohr in der Magnetstativ verbleibenden sorgfältig verwerfen die Überstände durch Absaugen, die ungebundenen Vesikel zu entfernen.</li>
	<li>Waschen die magnetische Beads die Vesikel zweimal mit 5 mL Medium Homogenisierung durch die magnetische verpflichtet stehen für 10 min bei 4 ° C und entsorgen des Überstands jedesmal durch sorgfältig absaugen. 
	Hinweis: Ohne Magnetstativ, Reinigung von Centrifugations bei 2.000 x g für 10 min, 4 ° C ist auch verfügbar.</li>
	<li>Aufschwemmen der magnetischen Kügelchen durch pipettieren die Lösung nach oben und unten mehrmals an die Vesikel sorgfältig in 100 µL Homogenisierung Medium gebunden.</li>
	<li>Übertragen die resuspendierte Vesikel in eine neue Reaktionscup als die gereinigten Microsome für nachgeschaltete Experimente. 
	Hinweis: In der Regel 50 µL Microsome Bruch mit 5-20 µg Proteinen aus 1 x 10 7 Zellen isoliert werden kann.</li>
</ol> 4. Analyse der gereinigt Microsomen <ol><li>Aufschwemmen der magnetischen Perlen verpflichtet die Vesikel aus Schritt 3,8 für 100-200 µL Puffer TNE (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 % Nonidet p-40) mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails anstelle der Homogenisierung Medium.</li>
	<li>Übertragen die lysate aus Schritt 4.1 auf eine neue 1,5-mL-Reaktionscup.</li>
	<li>Bestimmen die Proteinkonzentration Schritt 4.2 mithilfe einer BCA Assay Kit pro Hersteller &#39; s Protokoll. 
	Hinweis: In der Regel 5-10 µL lysate aus Schritt 4.2 genügt, um festzustellen, die Proteinkonzentration.</li>
	<li>Übertragen die lysate aus Schritt 4.2 (2 µg Protein für silberne Färbung und 10 µg Protein für das westliche Beflecken) in neue Mikroröhrchen.</li>
	<li>Setzen die Mikroröhrchen auf einem Heizblock bei 95 ° C und Kochen Proteine in 1 x SDS-Gel-laden-Puffer (100 mM Tris-HCl pH 6,8, 200 mM Dithiothreitol, 4 % SDS, 0,2 % Bromophenol Blue, 20 % Glycerin) für 5 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Mikroröhrchen für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in neue Mikroröhrchen die unlöslichen Anteile entfernen.</li>
	<li>Die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (2 µg) von standard SD-Seite zu analysieren.</li>
	<li>Visualisieren die Protein-Bands durch die silberne Färbung mit silbernen Färbung nach dem Hersteller Kit &#39; s Protokoll.</li>
	<li>Analysieren die aufgelöste Proteine in Schritt 4.6 (10 µg) von standard SD-PAGE und Western-Blot. Verwenden Sie das Reagenz (SA-HRP) pro Hersteller &#39; s-Protokoll und visualisieren von Fluorography.</li>
</ol> 5. In-vitro- Rekonstitution des ERAD Ubiquitination von bOVA Verwendung gereinigt Microsomen <ol><li>Übertragung der gereinigten Microsomen (5-10 µg Protein) von 3,8 Schritt mit einem Volumen von 50 % der Retikulozytenzahl lysate (RL), 1 x Reaktion Puffer (50 mM Tris pH 7.4, 3 mM ATP, 0,5 mM MgCl (2), und 12:02-Flag gekennzeichnet Ubiquitin in eine neue Reaktionscup. Der letzte Band dieses Experiments ist 20-40 µL.</li>
	<li>Inkubation die Reaktionscup für 2 h bei 37 ° c 
	Hinweis: Wenn die Menge an Ubiquitinated bOVA in Schritt 5.12 zu klein, durch westliche Beflecken zu erkennen ist, fügen Sie 10 µM MG132 oder 2 µM Lactacystin, die Verarbeitung von Ubiquitinated bOVA durch Proteasomen hemmen.</li>
	<li>Stoppen Sie die Reaktion indem man die Reaktionscup auf Eis.</li>
	<li>Lösen die Microsomen durch Zugabe von 500 µL TNE Puffer mit 1/1.000 Volumen der Protease-Hemmer Cocktails.</li>
	<li>Die Reaktionscup Zentrifuge für 10 min bei 21,500 x g und 4 ° C. sammeln die Überstände in eine neue Reaktionscup die unlöslichen Brüche zu entfernen, die Ubiquitinated bOVA in DC2.4 vor der in-vitro- Ubiquitination Assay enthalten.</li>
	<li>Den Überstand auf eine neue Reaktionscup übertragen und Volumen 1/100 der neuen SA-magnetische Beads (in der Regel 5 µL für 500 µL Überstände).</li>
	<li>Sanft vermischen und drehen die Reaktionscup langsam für 30 min bei 4 ° c</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen der Überstand durch Absaugen, bOVA und Ubiquitinated bOVA wiederherzustellen mit der SA-magnetische Beads gebunden.</li>
	<li>Waschen zweimal die gesammelten SA-magnetische Beads mit 1 mL TNE Puffer durch Zentrifugation für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° C. verwerfen des Überstands jedesmal durch Aspiration.</li>
	<li>Kochen der SA-magnetischen Kügelchen in 1 x SDS-Gel Ladepuffer für 5 min bei 95 ° C auf einem Hitze-Block, der gereinigten Proteine durch die SA-magnetische Beads zu lösen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Reaktionscup für 10 min bei 21.500 x g und 4 ° c in eine neue Reaktionscup, die unlöslichen Anteile zu entfernen die Überstände sammeln.</li>
	<li>Analysieren die SA-magnetische Beads durch standard SD-Seite und Western-Blot-an die Proteine gebunden. Der Einsatz von Antikörpern (Anti-Flag, Anti-Multi-Ub und Anti-Maus IgG-HRP) und das Reagenz (SA-HRP) ist pro Hersteller &#39; s-Protokoll und visualisiert durch Fluorography.</li>
</ol>

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L., Kyritsis, C., Tamp&#233;, R., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phagosomes+in+dendritic+cells+form+a+cellular+compartment+sufficient+for+cross+presentation+of+exogenous+antigens.">Early phagosomes in dendritic cells form a cellular compartment sufficient for cross presentation of exogenous antigens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12889-12894 (2003).</li><li>Saveanu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IRAP+identifies+an+endosomal+compartment+required+for+MHC+class+I+cross-presentation.">IRAP identifies an endosomal compartment required for MHC class I cross-presentation.</a> Science. 325 (5937), 213-217 (2009).</li><li>Zehner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+translocon+protein+Sec61+mediates+antigen+transport+from+endosomes+in+the+cytosol+for+cross-presentation+to+CD8(+)+T+cells.">The translocon protein Sec61 mediates antigen transport from endosomes in the cytosol for cross-presentation to CD8(+) T cells.</a> Immunity. 42 (5), 850-863 (2015).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In früheren Studien von CP eingearbeitete exogene Antigene in den geschützten Bereich des späten Endosom oder ER durch immunofluorescent Mikroskopie16,30,31,32angesammelt. Es wird geschätzt, dass ERAD-wie Transport und Verarbeitung von exogenen Antigenen in diesen spezialisierten Bereichen ER oder späten Endosom durchgeführt werden, wie das zelluläre Fach von Saccharose oder Iodixanol Di...

Die MHC ich Moleküle auf der Oberfläche aller kernhaltigen Zellen, mit kurzen Antigene Peptide abgeleitet endogene Antigene, die durch das Ubiquitin-Proteasom-System in der Zellflüssigkeit1verarbeitet werden ausgedrückt werden. Nach der Bearbeitung werden Antigene Peptide in das endoplasmatische Retikulum (ER)-Lumen von Peptid-Transporter TAP transportiert. Das ER-Lumen eine Reihe von spezifischen Chaperone unterstützen das Peptid-laden und die korrekte Faltung des MHC ich komplexe. Diese Reihe von Molekülen nennt man die Peptid-laden-Komplex (PLC), darauf hinweist, dass ER ein zentrales Fach für Peptid laden auf MHC ich2. Nach Peptid laden, MHC ich Moleküle an der Zelloberfläche transportiert und spielen eine Schlüsselrolle bei der adaptiven Immunsystems als selbständige Marker und ermöglicht die CD8+ zytotoxische T-Lymphozyten (CTLs), Krebszellen oder Krankheitserreger erkennen von Antigenen Peptide aus Nichtselbst Proteine3.
Antigenpräsentierende Zellen (APC), Antigene Peptide aus exogene Antigene sind auch auf MHC habe ich4,5,6,7,8 über CP, das hauptsächlich getragen wird vorgestellt von DCs9,10,11. CP ist wichtig sowohl für die Aktivierung von naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen gegen Infektionen und Anti-Tumor CTLs12,13, und bei der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz durch die Inaktivierung der selbsttätige naive T-Zellen14,15. Der CP spielt viele wichtige Rollen in das adaptive Immunsystem jedoch die molekularen Mechanismen der CP müssen noch im Detail beschrieben werden. Frühere Studien der CP ergab, dass exogene Antigene, in der ER und das Endosom lokalisiert wurden und wurden von ERAD, was darauf hindeutet, dass exogene Antigene, die ER für ERAD-wie Verarbeitung und laden16 Peptid aus dem Endosom transportiert werden verarbeitet . Sammeln Beweise deutet jedoch darauf hin, dass das Peptid-Laden von CP durchgeführt wird, nicht in der Notaufnahme sondern im nicht-klassischen endocytic Fächer, die auch Besonderheiten der ER (Abbildung 1)17,18 ,19,20,21. Zur Vermeidung von Abbau der Antigen Peptid Vorläufer von der hohen Aktivität des Aminopeptidase tritt22 im Zytosol, Verarbeitung und Peptid im CP laden im proximalen Bereich dieser nichtklassischen endocytic Abteilungen (Abbildung 1). Obwohl die Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen umstritten sind, gibt es keine bestehende spezifische Moleküle als exogene Antigene in diesem Fach.
ERAD ist ein zellulärer Weg, der speziell fehlgefaltete Proteine aus dem ER entfernt. In dem ERAD Weg fehlgefaltete Proteine Doppelthebel durch die ER-Membran, das Zytoplasma transportiert und verarbeitet von den Ubiquitin-Proteasom System23,24,25. Beim Transport von großer Molekülen wie Proteinen, durch die Lipid-Bilayer durchlaufen diese Moleküle ein molekularer Apparat namens ein Translocon, wie der Sec61 komplex und Delrin Komplex in die ER26, und die komplexe Tom und Tim Komplex in der Mitochondrien-27. Wenn exogen hinzugefügt Antigene durch die ER-Membran transportiert werden, müssen sie die Lipid-Bilayer im Komplex mit Translocons, wie den Sec61-Komplex eindringen. Die hier beschriebene Methode gereinigt die gezielte Blase durch die Nutzung dieser Membran durchdringen Moleküle als Marker für die endocytic Fächer.
Die hier beschriebene Methode ist ein neues Vesikel-Reinigung-Protokoll mit der DC-ähnliche Zelle Zeile DC2.428 und biotinylierte Ovalbumin (bOVA) als eine exogene Antigen. Die endocytic Fächer wurden gereinigt, indem Streptavidin (SA)-magnetische Beads, die mit der Membran durchdringen bOVA als Hersteller. In diesem gereinigten Microsome hinzugefügt einige exogen bOVA blieb noch in Bruchteilen Membran aber waren an der Außenseite des Microsome und dann Ubiquitinated transportiert und verarbeitet in-vitro-29. Dieses gereinigte Microsome enthielt nicht nur endocytic Fach-spezifische Proteine, sondern auch ER ansässigen Proteine für ERAD und das Peptid Komplex laden; darauf hindeutet, dass das zelluläre Fach das prospektive endocytic Fach für CP29. Dieses Protokoll ist nicht abhängig von der Art der exogene Antigene und gilt auch für andere DC-Subsets und andere Zelltypen, z. B. Endothelzellen, Makrophagen und B-Zellen, den genaue molekularen Mechanismus der DCs für kompetente CP zu klären.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>gibco by life technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Equitech bio</td><td>SFB30</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>gibco by life technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>MEM non-essential amino acids</td><td>gibco by life technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>gibco by life technologies</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>gibco by life technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>gibco by life technologies</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>Penisicillin-Sreptomycin</td><td>gibco by life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>gibco by life technologies</td><td>12100-46</td><td></td></tr><tr><td>OVA</td><td>SIGMA</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-protein labelling kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F6347</td><td></td></tr><tr><td>MG-132</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>lactacystin</td><td>SIGMA</td><td>L6785</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenizer</td><td>IUCHI</td><td>131703</td><td></td></tr><tr><td>protease inhibitor cocktails</td><td>SIGMA</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>iodixanol</td><td>Cosmo bio</td><td>1114542</td><td></td></tr><tr><td>SA-magnetic beads</td><td>New England Biolabs</td><td>201270</td><td></td></tr><tr><td>control magnetic beads</td><td>Chemagen</td><td>M-PVA012</td><td></td></tr><tr><td>magnetic stand</td><td>BD Biosciences</td><td>552311</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>silver staining kits</td><td>Cosmo bio</td><td>423413</td><td></td></tr><tr><td>Reticulocyte Lysate</td><td>Promega</td><td>1730714</td><td></td></tr><tr><td>Flag-tagged ubiquitin</td><td>SIGMA</td><td>U5382</td><td></td></tr><tr><td>anti-ovalbumin (OVA,mouse)</td><td>Antibody Shop</td><td>HYB 094-06</td><td></td></tr><tr><td>ant-multi-ubiquitin (mouse)</td><td>MBL</td><td>D058&amp;minus;3</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag (mouse)</td><td>SIGMA</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>trypsin</td><td>SIGMA</td><td>85450C</td><td></td></tr></tbody></table>

purification of the membrane compartment for endoplasmic reticulum-associated degradation of exogenous antigens in cross-presentation

Dendritische Zellen (DCs) sind leistungsfähige Verarbeitung und verinnerlichten exogene Antigene auf großen Histocompatibility-Klasse (MHC) zu präsentieren ich Moleküle auch bekannt als Kreuz-Präsentation (CP). CP spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der Stimulation der naiven CD8+ T Zellen und Gedächtnis CD8+ T-Zellen für infektiöse und Tumor Immunität sondern auch bei der Inaktivierung von selbsttätige naive T-Zellen durch T-Zell-Anergie oder T-Zell-Löschung. Wenn auch der kritischen molekularen Mechanismus der CP geklärt werden noch, gibt es sammeln Hinweise darauf, dass exogene Antigene durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau (ERAD) nach dem Export aus nichtklassischen endocytic verarbeitet werden Fächer. Bis vor kurzem waren Charakterisierungen dieser endocytic Abteilungen beschränkt, denn es keine spezifische molekulare Marker als exogene Antigene gab. Die hier beschriebene Methode ist ein neues Protokoll Vesikel Isolierung, die für die Reinigung dieser endocytic Abteilungen ermöglicht. Mit diesem gereinigten Microsome, rekonstituiert wir ERAD-wie Transport, Ubiquitination und Verarbeitung des exogene Antigen in Vitro, was darauf hindeutet, dass das Ubiquitin-Proteasom-System die exogene Antigen nach dem Export aus dieser verarbeitet Handy-Fach. Dieses Protokoll kann weiter auf andere Zelltypen zu klären, den molekularen Mechanismus der CP angewendet werden.

Um den molekularen Mechanismus der CP zu erhellen, ist es notwendig, die zellulare Fächer zu identifizieren, wo exogene Antigene ERAD-wie Transport und Verarbeitung unterzogen werden. Während Beobachtungen durch immunofluorescent Mikroskopie oder durch Elektronenmikroskopie der zelluläre Fach wo exogene Antigene16,17,18,19angesamm...

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Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Reinigung der Membran-Fach für endoplasmatische Retikulum-assoziierten Abbau von exogenen Antigenen in Kreuz-Präsentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

purification-membrane-compartment-for-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.2K Aufrufe.  Takasaki University of Health and Welfare. Die hier beschriebene Methode ist eine neue Vesikel Isolierung Protokoll, das für die Reinigung von den zellulären Kompartimenten ermöglicht dem exogene Antigenen durch endoplasmatische Retikulum verbundenen Abbau in Kreuz-Präsentation verarbeitet werden.

Serie: Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Large-Scale Purification of Porcine or Bovine Photoreceptor Outer Segments for Phagocytosis Assays on Retinal Pigment Epithelial Cells

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer segments (POS) can be performed in vitro. Photoreceptor outer segments with stacks of membranous discs containing the phototransduction machinery are continuously renewed in the retina. Spent POS are eliminated daily by RPE cells. Rodent, porcine/bovine and human RPE cells recognize POS from various species in a similar manner. To facilitate performing large series of experiments with little variability, a large stock of POS can be isolated from porcine eyes and stored frozen in aliquots. This protocol takes advantage of the characteristic of photopigments that display an orange color when kept in the dark. Under dim red light, retinae are collected in a buffer from opened eyecups cut in halves. The retinal cell suspension is homogenized, filtered and loaded onto a continuous sucrose gradient. After centrifugation, POS are located in a discrete band in the upper part of the gradient that has a characteristic orange color. POS are then collected, spun, resuspended sequentially in wash buffers, counted and aliquoted. POS obtained this way can be used for phagocytosis assays and analysis of protein activation, localization or interaction at various times after POS challenge. Alternatively, POS can be labeled with fluorophores, e.g., FITC, before aliquoting for subsequent fluorescence quantification of POS binding or engulfment. Other possible applications include the use of modified POS or POS challenge combined with stress conditions to study the effect of oxidative stress or aging on RPE cells.

This article describes the protocol for the purification of photoreceptor outer segment fragments (POS) via ultracentrifugation from porcine/bovine retinae using homogenization and sucrose gradient centrifugation. This protocol allows the preparation of large stocks of POS aliquots, labeled or unlabeled, that can then be stored at -80 &#176;C.

Groß Reinigung von Schwein oder Rind Photorezeptoraußensegmente für Phagozytose Assays auf Netzhautpigmentepithelzellen

Analysis of one of the vital functions of retinal pigment epithelial (RPE) cells, the phagocytosis of spent aged distal fragments of photoreceptor outer ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function depends on a robust quality control system to maintain protein homeostasis (proteostasis). Declines in mitochondrial proteostasis have been linked to cancer, aging, neurodegeneration, and many other diseases. Msp1 is a AAA+ ATPase anchored in the outer mitochondrial membrane that maintains proteostasis by removing mislocalized tail-anchored proteins. Using purified components reconstituted into proteoliposomes, we have shown that Msp1 is necessary and sufficient to extract a model tail-anchored protein from a lipid bilayer. Our simplified reconstituted system overcomes several of the technical barriers that have hindered detailed study of membrane protein extraction. Here, we provide detailed methods for the generation of liposomes, membrane protein reconstitution, and the Msp1 extraction assay.

Here, we present a detailed protocol for reconstitution of Msp1 extraction activity with fully purified components in defined proteoliposomes.

Rekonstitution der Msp1-Extraktionsaktivität mit vollständig gereinigten Komponenten

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Biochemie

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both signaling&#160;and antigen uptake are coordinated. IS formation involves dynamic actin remodeling accompanied by the polarized recruitment to the synaptic membrane of the centrosome and associated intracellular organelles such as lysosomes and the Golgi apparatus. Initial stages of actin remodeling allow B cells to increase their cell surface and maximize the quantity of antigen-BCR complexes gathered at the synapse. Under certain conditions, when B cells recognize antigens associated to rigid surfaces, this process is coupled to the local recruitment and secretion of lysosomes, which can facilitate antigen extraction. Uptaken antigens&#160;are internalized into specialized endo-lysosome compartments for processing into peptides, which are loaded onto major histocompatibility complex II (MHC-II) molecules for further presentation to T helper cells. Therefore, studying organelle dynamics associated with the formation of an IS is crucial to understanding how B cells are activated. In the present article we will discuss both imaging and a biochemical technique used to study changes in intracellular organelle positioning and cytoskeleton rearrangements that are associated with the formation of an IS in B cells.

Herein we describe two approaches to characterize cell polarization events in B lymphocytes during the formation of an IS. The first, involves quantification of organelle recruitment and cytoskeleton rearrangements at the synaptic membrane. The second is a biochemical approach, to characterize changes in composition of the centrosome, which undergoes polarization to the immune synapse.

Studium der Organelle-Dynamik in B-Zellen während der Immunsynapse-Bildung

Recognition of surface-tethered antigens&#160;by the B cell receptor (BCR)&#160;triggers the formation of an immune synapse (IS), where both ...

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Isolierung und dendritische Zellaufnahme von kleinen extrazellulären Vesikeln aus Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Intralumenal Vesicles and Multivesicular Bodies

Intraluminal vesicles (ILVs) are small vesicles 50-80 nm in diameter formed during the maturation of early endosomes. A specialized endosome containing numerous ILVs is called a multivesicular body (MVB). ILVs contain internalized molecules such as antigens, nucleic acids, proteins, and metabolites. Some of these molecules are released from the MVBs inside exosomes and are transported to other cells. Other MVBs contain molecules that are retained in the ILVs and are later degraded within the cell.
MVBs were first observed in neuronal cells in 1955 using electron microscopy. MVBs have a diameter of 400-500 nm, are spherical, and were initially thought to be a form of the late endosome; however, recent studies have shown that MVBs are an intermediate form of these organelles between the early and the late endosomes.
ILV formation takes place when a ubiquitin-tagged protein enters the cell in an endocytic vesicle and fuses with the early endosome. As the early endosome matures, the endosomal membrane bends inwards to form ILVs. An ESCRT protein complex mediates ILV formation. Phosphatidylinositol 3-phosphate (PtdIns3P) is also required for ILV formation. PtdIns3P acts as a docking site for ESCRTs for the bending of the endosomal membrane.
The ESCRT complex and the ATPase, Vps4, required for ILV formation can be hijacked by enveloped retroviruses that infect host cells. Normally, ILVs are formed inside maturing endosomes with the help of ESCRTs within the cell, and the ubiquitin-tagged proteins are recognized and sorted into ILVs. In contrast, retroviruses use the ESCRTs to be released outside the cell. For example, the human immunodeficiency virus (HIV) codes for proteins, such as Gag, NC-p2, and Tat, that require ubiquitination for export. This ubiquitination is essential because ESCRTs and Vps4 recognize and sort only ubiquitin-tagged proteins into viral buds. Once the viral particles bud off from an infected cell, they are released into the extracellular space to infect other host cells.

Intraluminale Vesikel und multivesikuläre Körper

Intraluminal vesicles (ILVs) are small vesicles 50-80 nm in diameter formed during the maturation of early endosomes. A specialized endosome containing ...

Lehre

JoVE Core

Zellbiologie

Unit 1

Endozytose und Exozytose

SCHLÜSSELBEGRIFFE UND KONZEPTE

Receptor Downregulation in MVBs

Multivesicular bodies (MVBs) are mature endosomes that sort ubiquitinated proteins and then fuse with lysosomes to degrade the sorted proteins. Epidermal growth factor (EGF) and its receptor (EGFR) form a complex that can be internalized through endocytosis, sorted into an MVB, and later degraded.
The EGFR can initiate signaling pathways that&#160; lead to cell proliferation, migration, and differentiation. Overexpression of EGFR&#160; stimulates cells to proliferate. Excessive&#160; EGFR activation may result in cancer; therefore, EGFR expression must be tightly regulated. The degradation of the EGF-EGFR complex through the endocytic pathway is a means of downregulating EGFR and preventing its overexpression.
EGF binding to EGFR induces EGFR dimerization. EGFR is ubiquitinated by a ubiquitin ligase. Ubiquitination triggers the endocytosis of the dimerized EGF-EGFR complex. Once inside the cell, the complex is first sorted into the early endosome. As the early endosome matures, ESCRT proteins, or endosomal sorting complexes required for transport, translocate&#160; the EGFR-EGF complex into intraluminal vesicles (ILVs). Several ILVs are formed inside the maturing endosome, eventually becoming multivesicular bodies (MVBs). MVBs containing the EGF-EGFR complex then fuses with a lysosome for degradation of the EGFR-EGF complex.
Similar to EGFR, cytokine receptors are also internalized and downregulated by MVBs. Ubiquitinated receptor-cytokine complexes are endocytosed and later delivered to MVBs for degradation. The degradation weakens the cytokine signaling. In the case of pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor alpha (TNF&#593;) or interleukin-1 (IL-1), any defect in ubiquitination, endocytosis, or degradation of the receptor-cytokine complex through MVB can cause enhanced or sustained signaling. This may lead to inflammatory diseases like Crohn&#39;s disease or rheumatoid arthritis.

Herunterregulierung von Rezeptoren in MVKs

Multivesicular bodies (MVBs) are mature endosomes that sort ubiquitinated proteins and then fuse with lysosomes to degrade the sorted proteins. Epidermal ...

Export of Misfolded Proteins out of the ER

After folding, the ER assesses the quality of secretory and membrane proteins. The correctly folded proteins are cleared by the calnexin cycle for transport to their final destination, while misfolded proteins are held back in the ER lumen. The ER chaperones attempt to unfold and refold the misfolded proteins but sometimes fail to achieve the correct native conformation. Such terminally misfolded proteins are then exported to the cytosol by ER-associated degradation or ERAD pathway for degradation.
Different modes of ERAD pathways
Hrd1 is a ubiquitin ligase and a retro-translocation channel for misfolded polypeptides. It complexes with another membrane protein, Hrd3, to form the core ERAD machinery. The other players associated with these core proteins depend upon the topology of the misfolded protein. The retrotranslocation complex depends on the luminal lectin chaperones to identify misfolded proteins. Studies in the yeast system suggest the presence of ERAD-C, ERAD-L, and ERAD-M pathways to export misfolded proteins from various parts of the ER. The target proteins of the ERAD-L and ERAD-M pathways use the Hrd1 channel to exit the ER lumen and membrane, respectively, while the ERAD-C pathway utilizes the Doa10p ubiquitin ligase complex to degrade the cytoplasmic domains of the ER membrane proteins. Sometimes, these pathways can overlap as some misfolded proteins need translocation machinery from two different ERAD pathways to exit the ER. The mammalian ERAD machinery is more complex than yeast and has multiple proteins that export and mark proteins for proteasomal degradation. Eventually, all ERAD pathways converge due to their dependence on a cytoplasmic AAA-ATPase to provide the mechanical force to extract proteins through the membrane.
Degradation of non-glycosylated proteins
The ER has another lectin-independent system that monitors and clears the non-glycosylated proteins from ER. It consists of the resident ER chaperone, BiP protein, and the ER-localized DnaJ family members (ERdjs). ER stress induces the production of HERP, a ubiquitin-like membrane protein, which assembles with other ERAD proteins like the Hrd1 and AAA-ATPase, forming a complex. BiP uses some ERdj proteins as cofactors to recruit non-glycosylated misfolded proteins to the HERP complex for retrotranslocation and ubiquitination of the misfolded protein. HERP is associated with the proteasome on the cytosolic side, where it delivers the misfolded proteins for degradation.

Export von fehlgefalteten Proteinen aus dem ER

After folding, the ER assesses the quality of secretory and membrane proteins. The correctly folded proteins are cleared by the calnexin cycle for ...

Transmembrantransport im endoplasmatischen Retikulum und in Peroxisomen

Antigen Presenting Cells

The immune system is a complex network of cells and molecules that protects the body from foreign invaders. T cells, a type of white blood cell, play a crucial role in this process. They recognize and attack foreign substances, such as pathogens, that enter the body.
T cells require the help of antigen-presenting cells (APCs), which process foreign antigens into smaller fragments that can be recognized by T cells. These APCs are highly specialized cells that efficiently internalize antigens through phagocytosis or receptor-mediated endocytosis.
Dendritic cells, a type of professional APC, are particularly efficient at antigen processing and presentation. They are highly mobile and can be found in tissues first exposed to foreign antigens, such as the skin, mucosal surfaces, and lymphoid organs.
Macrophages may also function as APCs, and are found in all tissues. They can engulf and process foreign antigens and release cytokines, which activate T cells and other immune cells, thereby coordinating the immune response.
B cells are another type of APC that can present antigens to T cells. When an antigen is presented to a B cell, it activates the B cell to produce antibodies against the antigen. This activation process involves the binding of the antigen to the B cell receptor, followed by a series of molecular signaling events that produce antibodies.
When an APC engulfs an antigen, it breaks into smaller fragments and combines them with major histocompatibility complex (MHC) molecules. The antigen-MHC complex is then transported to the APC&#39;s plasma membrane, where it is presented to a T cell.
The appropriate T cell receptor recognizes the processed antigen complex, triggering an immune response against the foreign invader. This process is crucial for protecting the body from infection and disease.

Antigen-präsentierende Zellen

Antigen-presenting cells, also known as APCs, process foreign antigens, such as fragments from pathogens, for recognition by T cells.
When an APC engulfs ...