Name: the isolation and culture of primary epicardial cells derived from human adult and fetal heart specimens
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
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Questa ricerca è sostenuta da l'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) (VENI 016.146.079) e un assegno di ricerca LUMC sia per AMS e Stichting Bontius LUMC (MJG).

Tutti gli esperimenti con campioni di tessuto umano sono stati approvati dal comitato etico del Leiden University Medical Center e conforme alla dichiarazione di Helsinki. Tutti i passaggi sono eseguiti con attrezzature sterili in un flusso di cultura cellulare mobile.
1. preparati
<ol><li>Preparare il supporto di EPDC mescolando di Dulbecco esente modificato Eagle (DMEM basso-glucosio) e Medium 199 (M199) in un rapporto 1:1. Aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS, calore inattivati per 25 min a 56 ° C) e completare con 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina. Pre-riscaldare il mezzo EPDC in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Preriscaldare la tripsina 0.25%/EDTA (1:1) a bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Pozzi di cappotto con gelatina. Aggiungere 0,1% gelatina/PBS in ciascun pozzetto e incubare le piastre per almeno 15 min a 37 ° C. Linee guida per la piastra di coltura cellulare richiesto sono riassunti nella tabella 1. Rimuovere con attenzione tutto il liquido prima di placcatura di cellule.</li>
	<li>Preparare una soluzione stock di 10 mM SB431542 (SB), diluita in DMSO (attenzione). Rendere le aliquote di 50 µ l in provette in polipropilene fondo conico, come provette Eppendorf e conservarli a-20 ° C. Si noti che le aliquote SB possono essere scongelate solo una volta.</li>
</ol>2. recupero e conservazione degli esemplari adulti e fetale cuore
<ol><li>Memorizzare i auricles umano adulto direttamente alla rimozione durante l'intervento chirurgico in un tubo da 50 mL con 15 mL alto-glucosio DMEM contenente 10% FBS, 100 U/mL di penicillina e streptomicina 100 mg/mL a 4 ° C. I campioni sono generalmente 3-5 cm nel formato e possono essere memorizzati fino a 48 h dopo la dissezione.</li>
	<li>Conservare il cuore fetale ottenuto da materiale di aborto elettivo in mezzo EPDC a 4 ° C fino a 24 h dopo l'isolamento. Per questo protocollo, è possibile utilizzare campioni con un'età gestazionale tra 12-22 settimane. Notare che tutto il cuore può essere utilizzato per l'isolamento dell'epicardio.</li>
</ol>3. isolamento dello strato dell'epicardio
<ol><li>Nel flusso laminare, preparare un piatto di coltura cellulare di 100 mm con PBS e posizionare una goccia separata (~ 200 µ l) di PBS nel coperchio. Riempire una provetta da 15 mL con 5 mL di terreno pre-riscaldato di EPDC.</li>
	<li>Posizionare il tessuto in coltura cellulare piatto pieno di PBS. Assicurarsi che il tessuto è inumidito frequentemente durante la procedura.</li>
	<li>Utilizzando un microscopio stereoscopico, rimuovere tanto dello strato dell'epicardio dal campione di tessuto possibile staccando di usando il forcipe. Nota: L'epicardio può essere riconosciuto come uno strato molto sottile, trasparente aderito strettamente all'esterno del cuore (Figura 1A). Se si tenta di evitare la contaminazione con tessuto adiposo epicardico e vasi sanguigni poiché questo ostacolerà l'isolamento.</li>
	<li>Raccogliere i pezzi di tessuto dell'epicardio nella goccia di PBS sul coperchio.</li>
	<li>Tagliare il tessuto dell'epicardio in piccoli pezzi (0,5 mm3) usando un bisturi (Figura 1B), oppure usando le punte taglienti di piccola pinzetta. Si noti che i pezzi devono essere in grado di passare un P1, puntale 000 (punto 3.6).</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tripsina al tessuto dell'epicardio e raccogliere i pezzi e la tripsina con una P1, 000 puntale. Trasferire il tessuto in una provetta conica per centrifuga da 1,5 mL (Figura 1).</li>
	<li>Incubare la provetta nel bagnomaria a 37 ° C per 10 minuti, agitando a ~ 60 giri/min.</li>
	<li>Rimuovere il tubo dal bagno di acqua e pulire la parte esterna del tubo con etanolo al 70%.</li>
	<li>Consentire al tessuto di depositarsi sul fondo del tubo (Figura 1) e trasferire con cautela il supernatante contenente cellule dell'epicardio nella provetta di 15 mL contenente 5 mL di terreno di EPDC per inattivare la tripsina.</li>
	<li>Ricostituire il tessuto restante nella provetta conica per centrifuga con tripsina 1 mL e Miscelare pipettando delicatamente su e giù.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 3,7 a 3.10 due volte. Nella fase finale, dopo un totale di 30 min di incubazione di tripsina, trasferire il surnatante e il tessuto restante dell'epicardio nella provetta contenente il mezzo EPDC.</li>
	<li>Quando tutte le celle sono raccolti in media EPDC, delicatamente passare la sospensione attraverso una siringa da 10 mL con un ago di calibro 19 in una provetta da 15 mL nuova meccanicamente dissociare le cellule (Figura 1E). Nota: Assicurarsi di omogeneizzare la sospensione pipettando su e giù prima di passare la soluzione attraverso l'ago per evitare che l'ago sempre ostruito.</li>
	<li>Per dissociare ulteriormente le cellule, ripetere il passaggio 3.12 con un ago da 21 gauge.</li>
	<li>Posizionare un colino di cella da 100 µm in cima a un tubo da 50 mL e trasferire il supporto che contiene le cellule dell'epicardio sul filtro utilizzando una pipetta di 10 mL per rimuovere tutti i restanti gruppi (Figura 1F).</li>
	<li>Lavare il filtro per raccogliere le cellule residue di pipettare 5 mL di terreno di EPDC sul filtro.</li>
	<li>Dispensare la sospensione cellulare dal tubo da 50 mL in una provetta da 15 mL. Poiché cellule depositano sul fondo della provetta, agitare delicatamente la soluzione prima di pipettaggio. Nota: Mentre questo passaggio non è necessario, un tubo più piccolo aiuta la visualizzazione del pellet dopo la centrifugazione.</li>
	<li>Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (Figura 1).</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare (Figura 1 H) nel volume richiesto di mezzo EPDC (tabella 1). Nota: Per EPDCs fetale, direttamente usare EPDC mezzo contenente 10 µM dell'inibitore della chinasi ALK5 (EPDC + SB). Le cellule adulte possono essere placcate senza SB durante il primo passaggio.</li>
	<li>Piastra di sospensione cellulare su piastre di coltura la gelatina rivestito (Figura 1I). Le dimensioni del pozzo dipende dalle dimensioni del campione del tessuto dell'epicardio (tabella 1). Nota che il confluency di bassa indurrà l'avvenimento di EMT.</li>
	<li>Posizionare le cellule nell'incubatore per almeno 48 h a 37 ° C, 5% CO2 per permettere alle cellule di fissare la piastra di coltura.</li>
</ol>4. la cultura di EPDCs
<ol><li>Ricostituire il mezzo EPDC + SB almeno ogni 3 giorni.</li>
	<li>Ispezionare le cellule almeno ogni 3 giorni con il microscopio. Quando le cellule raggiungono confluency, vale a dire, quando la piastra di coltura è completamente ricoperta di cellule, le cellule in un rapporto di superficie di 1:2 del passaggio. Si noti che arrivano fino a confluenza può prendere ~ 5-10 giorni.<ol>
<li>Aspirare il mezzo utilizzando una pipetta o un sistema di aspirazione con, per esempio, una pipetta di vetro.</li>
		<li>Lavare accuratamente le cellule aggiungendo PBS alle cellule. Delicatamente la piastra di turbinio e aspirare il PBS.</li>
		<li>Aggiungere tripsina alla piastra. Ruotare delicatamente la piastra per coprire tutte le cellule con tripsina e incubare la piastra per 1 min a 37 ° C. Nota: Utilizzare come tripsina piccolo come possibile (indicazione: 200 µ l di un 6 piastra bene)</li>
		<li>Toccare la piastra per scollegare meccanicamente le cellule dalla parte inferiore della piastra. Utilizzare il microscopio per controllare visivamente se cellule staccato. In caso contrario, incubare la piastra di coltura cellulare per un minuto in più.</li>
		<li>Aggiungere il volume richiesto di mezzo EPDC + SB alle cellule, risospendere pipettando su e giù e trasferire la sospensione cellulare per una nuova piastra di coltura di gelatina rivestito. Nota: In generale, le cellule possono essere mantenute in una morfologia di ciottoli fino al passaggio 8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. l'induzione di EMT in EPDCs
<ol><li>Per indurre EMT, dissociare le cellule con tripsina e trasferimento alle cellule di nuova gelatina rivestito pozzi in un rapporto di superficie di 1:2 in mezzo EPDC + SB, come descritto in 4 e incubare per almeno 24 h a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Verificare se confluenza è 50-70% e se EPDCs hanno una morfologia di ciottoli. Nota: Confluency riguarda la capacità di EPDCs di subire EMT.</li>
	<li>Aspirare il mezzo dalle cellule e lavare le cellule con attenzione con PBS (Vedi punto 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Stimolare le cellule con 1 ng/mL TGFβ3 in mezzo EPDC e metterli in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 per 5 giorni. Si noti che durante la stimolazione, il supporto di EPDC contenente TGFβ3 non deve essere rifornito.</li>
	<li>Monitorare quotidianamente le cellule. Dopo 5 giorni, le cellule che hanno subito la EMT sono riconosciute da una morfologia fusiforme (Figura 2A).</li>
	<li>Cultura EPDCs fusiformi secondo il metodo designate in 4 senza aggiunta di SB o TGFβ al medium EPDC. Si noti che in generale, EPDCs fusiformi possono essere coltivate fino a passaggio 20.</li>
	<li>Convalidare l'avvenimento di EMT con macchiatura immunofluorescente usando gli anticorpi contro i marcatori mesenchymal αSMA o il Vimentin o da falloidina per rilevare la formazione di fibre di stress di F-actina (Figura 2B), o mediante qRT-PCR per geni correlati all'EMT ( ad esempio, WT1, Periostina, Col1A1, αSMA, N-caderina, MMP3, lumaca, lumaca) (Figura 2 e tabella 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells:+Their+origin,+role+and+fate.">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li><li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per isolare e cultura primaria dell'epicardio cellule derivata da cuori umani adulti e fetali. Ampia caratterizzazione di queste cellule è stato precedentemente pubblicato il17. Abbiamo dimostrato che entrambi i tipi cellulari possono essere mantenuti come cellule epiteliali di ciottoli-come una volta coltivate con l'inibitore della chinasi di ALK5 SB431542. EMT è parte integrante di attivazione dell'epicardio in vivo durante sia lo sviluppo e l...

L'epicardio, uno strato epiteliale unicellulare che buste il cuore, è di vitale importanza per lo sviluppo cardiaco e riparazione (rivisto in Smits et al. 1). inerente allo sviluppo, l'epicardio nasce dall'organo proepicardial, una piccola struttura situata alla base del cuore in via di sviluppo. Intorno giorno dello sviluppo E9.5 in mouse e post-concezione 4 settimane in umani, cellule iniziano a migrare da questa struttura di cavolfiore e coprire il miocardio in via di sviluppo2. Una volta che si forma uno strato di singola cellula epiteliale, una parte delle cellule dell'epicardio subisce epiteliale di transizione mesenchimale (EMT). Durante EMT, le cellule perdono le loro caratteristiche epiteliali, quali adesioni cellula-cellula e ottenere un fenotipo mesenchimale che dà loro la capacità di migrare nel miocardio in via di sviluppo. Le cellule derivate dell'epicardio formate (EPDCs) possono differenziarsi in diversi tipi di cellule cardiache tra cui fibroblasti, cellule muscolari lisce e potenzialmente cardiomiociti e cellule endoteliali3, anche se la differenziazione di questi ultimi due cellulari resti di popolazioni oggetto di dibattito (rivisto in Smits et al. 4). Inoltre, l'epicardio fornisce segnali paracrini istruttivo al miocardio a regolare la crescita e la vascolarizzazione5,6,7,8. Diversi studi hanno dimostrato che alterata formazione dell'epicardio conduce ai difetti inerenti allo sviluppo in muscolo cardiaco9,10, sistema vascolare11e conduzione sistema12, sottolineando l'essenziale contributo dell'epicardio per la formazione del cuore.
Anche se nel cuore adulto epicardio è presente come uno strato dormiente, esso diventa riattivato su ischemia13. Alberino-ferita di riattivazione dell'epicardio ricapitola molti dei processi descritti per sviluppo cardiaco, tra cui proliferazione ed EMT14, seppur meno efficientemente. È interessante notare che, sebbene l'esatto meccanismo completamente non è capito, il contributo dell'epicardio di riparazione può essere migliorato dal trattamento con, per esempio, Thymosin β415 o modifica mRNA di VEGF-A16, con conseguente migliorato cardiaco funzione dopo infarto miocardico. L'epicardio è quindi considerato un'interessante fonte di cellule per migliorare la riparazione endogena del cuore ferito.
Meccanismi di sviluppo cardiaco sono spesso ricapitolate durante la lesione, anche se in modo meno efficiente. In cerca di attivatori dell'epicardio, è fondamentale che possiamo determinare e confrontare l'intera capacità dell'epicardio feto ed adulto. Inoltre, da un punto di vista terapeutico, è importante che, oltre a esperimenti sugli animali, estendiamo conoscenza per quanto riguarda la risposta dell'epicardio umano. Qui, descriviamo un metodo per isolare e adulte e fetale dell'epicardio derivate cellule umane (EPDCs) in una morfologia epiteliale-cell-like della coltura e di indurre EMT. Con questo modello, ci proponiamo di esplorare e confrontare il comportamento delle cellule dell'epicardio adulto e fetale.
Il vantaggio principale di questo protocollo è l'utilizzo di materiale umano dell'epicardio, che non è stato studiato accuratamente. D'importanza, il protocollo di coltura delle cellule e isolamento descritto fornisce un singolo metodo uniforme per derivare entrambi EPDCs di cobble fetali ed adulti, consentendo un confronto diretto tra queste fonti di due cellule. Inoltre, poiché l'epicardio è isolato basato sulla sua posizione, è accertato che le cellule sono in realtà epicardially derivata17.
Mentre metodi di isolamento EPDC umani sono state stabilite in precedenza, queste si basano principalmente su protocolli di conseguenza dove pezzi di tessuto cardiaco o dell'epicardio sono piastrate su un cellulare cultura piatto18,19. Questo approccio quindi seleziona specificamente per le cellule che perdere parzialmente il loro fenotipo epiteliale al fine di migrare, e che sono più inclini a subire EMT spontanea. Nel protocollo attuale, l'epicardio è prima trasformato in una soluzione di singola cellula che permette il EPDCs isolato per preservarne lo stato epiteliale. Questo metodo fornisce quindi un modello solido in vitro per lo studio dell'epicardio EMT.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulphate</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 from bovine pancreas</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 6 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 12 well</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 24 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&amp;micro;L Filtered Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Or home-made and sterilized</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Needles 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Needles 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Cell Sieves, 100 &amp;micro;m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;3&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma</td><td>A2547&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet controller</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

the isolation and culture of primary epicardial cells derived from human adult and fetal heart specimens

L'epicardio, uno strato di cellule epiteliali che copre il miocardio, ha un ruolo essenziale durante sviluppo cardiaco e la risposta di riparazione del cuore dopo lesione ischemica. Quando attivato, le cellule dell'epicardio subiscono un processo noto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT) per fornire le cellule del miocardio. Inoltre, l'epicardio contribuisce via la secrezione di fattori paracrini essenziale. Per apprezzare appieno il potenziale rigenerativo dell'epicardio, è necessario un modello di cellula umana. Qui abbiamo delineare un modello di coltura cellulare romanzo per derivare cellule derivate dell'epicardio primarie (EPDCs) da tessuto cardiaco umano adulto e fetale. Per isolare EPDCs, l'epicardio è dissecato dall'esterno dell'esemplare cuore e trasformato in una sospensione unicellulare. Successivamente, EPDCs sono placcati e coltivate in medium EPDC contenente l'inibitore della 5-chinasi ALK SB431542 per mantenere il loro fenotipo epiteliale. EMT è indotta dalla stimolazione con TGFβ. Questo metodo consente, per la prima volta, lo studio del processo di EMT dell'epicardio umano in un ambiente controllato e agevola guadagnando più comprensione nel secretoma di EPDCs che può aiutare la rigenerazione del cuore. Inoltre, questo approccio uniforme consente un confronto diretto del comportamento umano adulto e fetale dell'epicardio.

Qui, descriviamo un protocollo semplice per isolare EPDCs da tessuto cardiaco umano adulto e fetale (Figura 1). Questo protocollo sfrutta la posizione facilmente raggiungibile dell'epicardio sulla parte esterna del cuore (Figura 1A). Macchiatura del auricle cuore dopo dissezione dimostra che l'epicardio WT1 + viene rimosso mentre il sottostante subepicardial matrice extracellulare e tessuto miocardico rimangono intatti (<strong c...

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The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

L'epicardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella riparazione del cuore fornendo le cellule e fattori di crescita per la parete del miocardio. Qui, descriviamo un metodo alle cellule dell'epicardio primarie umane di cultura che consente lo studio e il confronto delle loro caratteristiche inerenti allo sviluppo e adulti.

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.7K Views.  Leiden University Medical Center. L'epicardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo e nella riparazione del cuore fornendo le cellule e fattori di crescita per la parete del miocardio. Qui, descriviamo un metodo alle cellule dell'epicardio primarie umane di cultura che consente lo studio e il confronto delle loro caratteristiche inerenti allo sviluppo e adulti.

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Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

Epicardico escrescenza Cultura Assay e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La valutazione della migrazione delle cellule di derivazione epicardico

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

Isolamento di perivascolare Multipotent precursori delle cellule popolazioni dal cardiache umane Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

Coltura in vitro di cellule provenienti da epicardici Cuore embrionali di topo

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

Ingegneria

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

Isolamento e caratterizzazione funzionale di Human ventricolare Cardiomyocytes da campioni freschi chirurgici

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Medicina

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

Isolamento delle cellule endocartali e coronarie dal muro libero ventricolare del cuore di ratto

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

Isolamento di cellule melanociti-come primario dal Cuore del mouse

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

Biologia

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolamento della embrionali ventricolari cellule endoteliali

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolamento dei cardiomiociti da cuori fissi per l'immunocitochimica e l'analisi dello ploidy

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

Isolamento dei cardiomiociti ventricolari umani dalle fette miocardici Vibratome-Cut

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...