Name: the isolation and culture of primary epicardial cells derived from human adult and fetal heart specimens
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens at JoVE.com

이 연구는 네덜란드 조직에 대 한 과학적 연구 (NWO) (아래 016.146.079) 및 LUMC 연구 친교 AMS, 및 LUMC Bontius Stichting (MJG) 둘 다에 의해 지원 됩니다.

인간의 조직 표본으로 모든 실험 라이덴 대학 메디컬 센터의 윤리 위원회에 의해 승인 되었다 고 헬싱키의 선언에. 모든 단계는 캐비닛 셀 문화 흐름에 멸 균 장비와 함께 수행 됩니다.
1입니다. 준비
<ol><li>Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM 낮은 포도 당) 및 매체 199 (M199) 1:1 비율로 혼합 하 여 EPDC 매체를 준비 합니다. 10% 열 비활성화 소 태아 혈 청 (FBS, 열 56 ° C에서 25 분 비활성화) 추가 100 U/mL 페니실린 및 100 mg/mL 스 보충. 사전에 EPDC 매체는 37 ° C 물 욕조에 따뜻한.</li>
	<li>미리 따뜻하게 트립 신 0.25%/EDTA (1:1) 37 ° C 물 목욕에서.</li>
	<li>젤라틴과 웰 스 코트. 각 우물에 0.1% 젤라틴/PBS를 추가 하 고 37 ° c.에 적어도 15 분 동안 접시를 품 어 필요한 셀 문화 접시에 대 한 지침 표 1에 요약 되어 있습니다. 조심 스럽게 셀을 도금 하기 전에 모든 액체를 제거.</li>
	<li>재고 솔루션 10 m SB431542 m (SB), 희석 DMSO (주의)를 준비 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 원뿔 바닥 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브, Eppendorf 관 처럼 50 µ L aliquots 참고 SB aliquots는 한 번만 해빙 될 수 있습니다.</li>
</ol>2. 검색 및 성인 및 태아 심장 표본 저장
<ol><li>수술 시 제거 시 직접 인간 성인 auricles 15 mL 50 mL 튜브에 저장 10 %FBS, 100 U/mL 페니실린, 4 ° c.에 100 mg/mL 스 포함 된 높은 포도 당 DMEM 샘플은 일반적으로 3-5 cm 크기에서 및 최대 저장 될 수 있다 해 부 후 48 h.</li>
	<li>격리 후 24 h까지 4 ° C에서 EPDC 매체에서 선택 낙태 자료에서 얻은 태아 마음을 저장 합니다. 이 프로토콜에 대 한 샘플을 사용 하 여 12 월 22 일 주 사이 임신 나이. 참고 전체 심 혼은 epicardium의 격리에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3입니다. 절연 Epicardial 계층의
<ol><li>층 류 캐비닛에 PBS 가진 100 m m 세포-배양 접시를 준비 하 고 뚜껑에 PBS의 별도 작은 물방울 (~ 200 µ L)를 배치 합니다. 5 mL 미리 데워 진된 EPDC 매체에 15 mL 튜브를 채우십시오.</li>
	<li>장소 세포 배양 접시에 조직 PBS 가득합니다. 조직 절차 동안 자주 습 하 게 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 그것을 벗 하 여 가능한 조직 샘플에서 epicardial 계층의 제거는 stereomicroscope를 사용 하 여. 참고:로 매우 얇고, 투명 한 레이어는 밀접 하 게 심장 (그림 1A)의 바깥쪽에 준수는 epicardium은 인식할 수 있습니다. 이 격리를 방해 합니다 때문 epicardial 지방 조직 및 혈관으로 오염을 방지 하려고 합니다.</li>
	<li>뚜껑에 PBS의 물방울에 epicardial 조직의 조각을 수집 합니다.</li>
	<li>(그림 1B), 메스를 사용 하 여 또는 작은 집게의 날카로운 팁을 사용 하 여 작은 조각 (0.5 m m3)으로 epicardial 조직을 잘라. 조각을 P1, 전달할 수 있어야 합니다 참고 000 피펫으로 팁 (단계 3.6).</li>
	<li>1 mL의 트립 신 epicardial 조직에 추가 하 고 조각 및 p1, 000 피펫으로 팁 트립 신 수집. 조직 1.5 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 (그림 1C)로 전송 합니다.</li>
	<li>~ 60 rpm에서 떨고 있는 동안 10 분 동안 37 ° C 물 욕조에 튜브를 품 어.</li>
	<li>물 탕에서 튜브를 제거 하 고 70% 에탄올 튜브의 외부를 청소.</li>
	<li>(그림 1D) 관의 바닥에 침 몰 하 고 신중 하 게 상쾌한 비활성화는 트립 신을 5 mL EPDC 매체를 포함 하는 15 mL 튜브에 epicardial 셀을 포함 하는 조직을 허용.</li>
	<li>1 mL의 트립 신와 원뿔 원심 분리기 튜브에 남아 있는 조직을 보충 하 고 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>3.7 3.10 단계를 두 번 반복 합니다. 마지막 단계에서 트립 신 보육의 30 분의 총 후 전송는 상쾌한 고 나머지 epicardial 조직 EPDC 매체를 포함 하는 관으로.</li>
	<li>모든 세포는 EPDC 매체에 수집 되는 경우 부드럽게 통과 정지 10 mL 주사기 19-게이지 바늘으로 세포 (그림 1E) 기계적으로 해리를 새로운 15 mL 튜브에. 참고: 방해 지 고 바늘을 방지 하기 위해 바늘을 통해 솔루션을 전달 하기 전에 아래로 pipetting으로 현 탁 액을 균질 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>더 세포 분열, 21-게이지 바늘 3.12 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>100 µ m 셀 거르는 50 mL 튜브 위에 놓고 10 mL 피 펫을 사용 하 여 모든 나머지 덩어리 (그림 1 층)을 제거 하는 여과기에 epicardial 셀을 포함 하는 매체를 전송 합니다.</li>
	<li>5 mL EPDC 매체는 여과기에 pipetting 여 잔여 세포를 수집 여과기를 세척.</li>
	<li>피펫으로 세포 현 탁 액 15 mL 튜브에 50 mL 튜브에서. 이후 셀 튜브의 바닥에 침 몰, pipetting 전에 솔루션 부드럽게 흔들어. 참고:이 단계는 필요 하지, 하는 동안 작은 튜브 원심 분리 후 펠 릿의 시각화를 에이즈.</li>
	<li>실내 온도 (그림 1G)에 5 분 동안 200 x g에서 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 필요한 양의 EPDC 매체 (표 1)에 셀 펠 릿 (그림 1 H) resuspend. 참고: 태아 EPDCs 직접 ALK5 키 니 아 제 억제 물 (EPDC + SB)의 10 µ M를 포함 하는 EPDC 매체를 사용 합니다. 성인 세포 첫 대목 중 SB 없이 도금 될 수 있다.</li>
	<li>세포 현 탁 액에 젤라틴 코팅 배양 배지 (그림 1I) 접시 우물의 크기는 epicardial 조직 샘플 (표 1)의 크기에 따라 달라 집니다. 참고 낮은 confluency 응급의 발생을 유발 한다.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2 문화 접시에 연결할 셀 수 있도록 적어도 48 h에 대 한 인큐베이터에 셀을 놓습니다.</li>
</ol>4입니다. EPDCs의 문화
<ol><li>EPDC + SB 매체 매 3 일 보충.</li>
	<li>적어도 3 일 마다 현미경을 사용 하 여 셀을 검사 합니다. 셀 도달 하면 confluency, 즉, 문화 접시 셀으로 완전히 덮여 때, 통로 표면 비율 1: 2에에서 셀. Note confluency 도달 ~ 5-10 일을 걸릴 수 있습니다.<ol>
<li>매체와 함께, 예를 들면, 유리 피펫으로 피펫으로 또는 포부 시스템을 사용 하 여 발음</li>
		<li>세포를 PBS를 추가 하 여 셀을 신중 하 게 씻어. 부드럽게 접시 소용돌이 PBS 발음.</li>
		<li>접시에 트립 신을 추가 합니다. 부드럽게 회전 하는 트립 신으로 모든 세포를 커버 하 고 37 ° c.에 1 분 동안 접시를 품 어 접시 참고: 사용 가능한 작은 트립 신으로 (표시: 6의 당 200 µ L 잘 플레이트)</li>
		<li>접시 접시의 아래쪽에서 세포를 기계적으로 분리를 누릅니다. 현미경을 사용 하 여 시각적으로 세포 분리가 확인. 그렇지 않으면, 추가 분에 대 한 셀 문화 접시를 품 어.</li>
		<li>셀에 EPDC + SB 매체의 필요한 볼륨을 추가 하 고 아래로, pipetting으로 resuspend 새로운 젤라틴 코팅 문화 접시에 세포 현 탁 액을 전송. 참고: 일반적으로, 세포 수에 보관 통과 8까지 조약돌 형태학.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. EPDCs 구급 대의 유도
<ol><li>세계로 유도 하 trypsin 및 전송 새로운 젤라틴을 셀 4에 설명 된 대로 EPDC + SB 매체에서 표면 비율 1:2 웰 스를 코팅 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 적어도 24 h에 대 한 품 어 세포 분열.</li>
	<li>확인 경우 confluency은 50-70% 그리고 EPDCs 조약돌 형태학입니다. 참고: Confluency 응급을 EPDCs의 능력을 영향을 줍니다.</li>
	<li>세포에서 매체를 발음 하 고 신중 하 게 PBS와 세포 세척 (단계 4.2.1-참조 4.2.2).</li>
	<li>1 ng/mL TGFβ3 EPDC 매체에와 세포를 자극 하 고 37 ° c, 5% CO2 5 일 동안 인큐베이터에 넣어. 참고는 자극, 동안 포함 하는 TGFβ3 EPDC 매체 필요가 없습니다 보충 되어야 합니다.</li>
	<li>셀을 매일 모니터링 합니다. 5 일 후 응급 수술 하는 셀은 스핀 들 모양의 형태 (그림 2A)에 의해 인식 됩니다.</li>
	<li>문화 스핀 들-모양 EPDCs EPDC 매체에 SB 또는 TGFβ의 추가 없이 4에서 설명 하는 방법. 일반적으로, 스핀 들-모양 EPDCs는 통로 20까지 양식 수 있습니다.</li>
	<li>Immunofluorescent 얼룩과 응급 발생 확인 F-말라 스트레스 섬유 (그림 2B)의 형성을 검출 하기 위하여 엽 마커 αSMA 또는 Vimentin 또는 phalloidin에 의해 항 체를 사용 하 여 또는 qRT-PCR를 사용 하 여 응급 관련 유전자 ( 에 대 한 예를 들어, WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Cadherin, MMP3, 달팽이, 민 달팽이) (그림 2C 와 표 2).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells:+Their+origin,+role+and+fate.">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li><li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development.">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li><li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart.">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li><li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-Derived+Heart+Repair.">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li><li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor.">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li><li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor,+FGFR-1,+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart.">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li><li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo.">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li><li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythropoietin+and+retinoic+acid,+secreted+from+the+epicardium,+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation.">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li><li>M&#228;nner, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos.">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li><li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation,+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes.">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li><li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns.">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li><li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development.">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li><li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium.">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692 (2012).</li><li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors.">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li><li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury.">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li><li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction.">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li><li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells:+a+novel+model+to+study+their+activation.">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li><li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells.">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li><li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro.">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li><li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF&#946;-signaling+and+WT1.">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGF&#946;-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li><li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue.">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 상세한 프로토콜을 및 문화 기본 epicardial 세포 인간 성인 그리고 태아 심 혼에서 파생 된 설명 합니다. 이러한 세포의 광범위 한 특성은 이전에 게시17이었다. 우리는 두 세포 유형 상피 조약돌 모양의 셀 때 ALK5 키 니 아 제 억제 물 SB431542와 교양으로 유지할 수 있습니다 나타났습니다. 응급 개발 및 후 부상 응답 epicardial 활성화에 vivo에서 의 중요 한 부분 이다. 응급 수 공부 될이 메서드를 사용 하 여 TGFβ의 추가 의하여. 중요 한 것은, 이전 관찰 SB 제거 성인 EPDCs는만 자극17시 응급 수술 하는 동안 태아 EPDCs 빠르게 자발적인 응급을 받아야 합니다. 태아 EPDCs에서이 과정을 공부 하 고 최적의 성인 epicardium 손상 후 활성화 하는 방법을 이해에 도움이 수 있습니다.
제시 방법은 수술 하는 동안 얻은 환자 자료에 의존 합니다. 따라서, 한 중 환자 다양성 또는 자료 운영 극장에서 수집 하는 속도, 절연 재료의 상태에 몇 가지 유사 콘텐츠를 기대할 수 있습니다. 이 변화 절차의 차이 설명할 수 있습니다: 1) 얼마나 쉽게는 epicardium 심근에서 해 부 될 수 있다, 접시, 3) 능력을 방지 하거나 응급, 그리고 4) 확산 속도 받을 준수 2) 고립 된 세포의. 일반적으로, 빠른 격리 세포 생존을 위해 바람직합니다. 중요 한 요점은 심근에서 epicardium 필 링입니다. epicardium 기본 조직을 강하게 준수는, 트립 신으로 심장 조직의 15 분 전처리는 epicardium 보다 쉽게 제거 하 도울 수 있다. 또한, 트립 신 치료의 효능 trypsin 활동과 조직의 구성 등 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다. 따라서, 낮은 수익률, 관찰 하는 경우 보육 시간 트립 신을 조정할 수 있습니다. 또한, 아무 셀 펠 릿 아래로 회전 후 보이는 경우에, 솔루션 수도 하지가 되어 완전히 해리 했다 필터를 통해 실행 하기 전에. 주사기를 통해 솔루션을 전달 하거나 추가로 사용 하기 전에 솔루션을 혼합, 작은 주사기 셀을 분리 유용 수 있습니다. EPDCs 시드를 위한 잘 크기는 상피 상태로 유지 하기 위해 셀 수 있도록 신중 하 게 고려해 야 합니다. 표 1 는 표시를 제공 하지만 한 때, 예를 들어 태아 심장의 단지 작은 부분을 사용할 수 있습니다 작은 잘에 도금 보다 편리 하 게이 지침에서 일탈 할 수 있다.
태아 세포는 SB17없이 구급 대를 즉시 받게 될 것 이다, 이후 태아 EPDCs SB와 도금 항상 한다. 그러나, 성인 EPDCs 그들의 상피 형태를 유지 하는 경향이 하 고 따라서 셀 준수를 촉진 하는 첫 대목의 첫 번째 48 h 동안 SB 없이 도금 될 수 있다. 첫 대목, 후 성인 그리고 태아 EPDCs 지속적으로 자발적인 구급 대를 방지 하기 위해 SB와 교양. 또한, 낮은 세포 밀도 응급에 대 한 중요 한 방 아 쇠입니다. EPDCs 한다 따라서 결코 될 교양 50 %confluency 아래. 다른 한편으로, 세계로, 필요한 경우 EPDCs 너무 밀도가 시드되지 않습니다 70 %confluency 아래 숙박 있는지 확인 합니다. 하지만이 프로토콜 사용 TGFβ3, TGFβ1 및-2 자극 뿐만 EPDCs (관찰 되지 않은)에 응급을 유도할 수 있다.
이 프로토콜에서 셀이 때문에 우리는 원심 분리기를 사용 하는 경우 더 낮은 세포 생존을 관찰, 회전 하지 않고 직접 분할 됩니다. 따라서, trypsin의 낮은 볼륨을 사용 하 여 혈 청 포함 매체 추가 될 때 그것의 비활성화를 위해 생명 이다.
~ 6-8 구절, 후 상피 형태와 EPDCs 성장 중지 하거나 또는 자발적으로 구급 대를 받게 될 것 이다. 따라서, 실험을 위해 우리 사용 EPDCs 통로 3 사이의 통로 6 선. 대조적으로, 엽 형태와 EPDCs 덜 취약 하 고 통로 20까지 경작 될 수 있다. 그러나 실험에서, 우리가 사용한 적이 없는 10번째 통과 후 EPDCs 스핀 들.
epicardium 심장의 외부에 있기 때문에 기본 조직에서 분리 하기 쉽습니다, 셀의 신뢰성은 분명 하다, 그리고 중요 한 오염 가능성이 낮습니다. 지방 조직 또는 혈관 때로는 격리 epicardial 계층에 충실, 비록 대부분 그 세포의 고립 동안에 여과기를 통과 하지 않습니다 하 고 그렇지 않으면 EPDC 세포 배양에서 살아남을 수 없다. 또한, 전에 설명 했 듯이, 인간의 재료를 사용 하 여 모델을 제공 합니다 독특한 인간의 epicardial 셀 동작. 를 조사 하 예를 들어, epicardial 지방 조직은 인간의 epicardial 셀 모델21의 필요성을 강조 하는 종 사이 다른 알려져 있습니다.
그것은 심장 auricles 병에 걸리는 마음에 수술 하는 동안 가져온 및 질병, 약물 사용된, 나이, 그리고 기증자의 성별 차이 실험의 재현성 영향을 미칠 수 있으므로 유의 하십시오. 실험은 유효한 결과 얻을 하 고 확실 한 결론을 그릴 수 있도록 몇 가지 격리에 따라서 수행 되어야 한다. 또한, 연구 문제에 따라 하나의 다르게 동작할 것으로 예상 된다 비-허 혈 성 판 막 병 질환 epicardium 허 혈 성 질병을 가진 환자 또는 환자에서 사용 하도록 특별히 선택할 수 있었다.
그것은, epicardial 동작에 대 한 유효한 모델을 제공 함으로써 epicardium 심 방 심장 auricle에서 파생 하는 경우 질문 심 epicardium 심 epicardium2에서 독특한 특성을 있을 수 있습니다 제안 되었습니다. 이런이 맥락에서는 찾을 수 없습니다 차이점 태아 심 방 및 심 실 파생 된 EPDCs (되지 않은 데이터)는 것을 중요 하다. 그러나, 인간의 성인 심 실에서 epicardium를 사용 하 여이 확인 하는 궁극적인 셀 소스 것. 아직, EPDC 절연에 대 한 인간의 성인 심의 큰 견본 수집 매우 환자에 대 한 침략 적 이며 따라서 현재 가능 하지 않습니다이 병원에서.
우리는 SB 항상 태아 EPDCs에 주로 응급을 방지 하기 위해 충분 하지는 않다는 것을 관찰 했다. 때 태아 EPDCs 응급 SB의 존재를 받 다, 우리는 실험에서 그들을 제외 합니다. 결과적으로, 세포 실험에 사용 되는 SB에 상피 표현 형을 유지 하는 그들의 기능에 대 한 선택 됩니다. 우리 가설 태아 세포 응급, 과정에서 특정 임계값을 넘어 이미 수 그리고 SB와 그 억제는 이것을 막을 수 없습니다.
이 epicardial 셀 모델 개발 및 성인 epicardium 조사 수 때문에 여러 응용 프로그램, 있다. 우리 실험실에서 우리는 심장 손상 후 epicardial 재생 응답의 개선에 집중 한다. 성인 EPDCs는 epicardium의 ameliorated 재생 대응에 대 한 잠재적인 치료 약물을 찾을 것을 목표로 하는 구급 대를 유발 하는 화합물을 테스트를 사용할 수 있습니다. 또한, paracrine 신호는 (다시)를 이해 하는 EPDCs에 의해 은닉 하는 요소를 측정 하는 심근을 생성. 또한, 태아 EPDCs는 자연스럽 게 성인 EPDCs에 비해 응급 수술 하는 경향이 관찰, 이후 우리 태아 및 성인 EPDCs의 차이점을 조사 합니다. 증가 태아 활성화의 기본 메커니즘을 결정 성인 심장 epicardial 활성화를 개선 하기 위해 큐를 제공할 수 있습니다.

Epicardium, 봉투는 마음 임을 심장 개발 및 수리 (Smits 외 에 검토에 대 한 중요 한 중요성의 단일 셀 상피 층 1).는 epicardium proepicardial 기관, 개발의 기초에 있는 작은 구조에서에서 발생 하는 발달. 마우스, 그리고 4 주 후 임신 인간에서 발달 하루 E9.5, 셀 시작이 콜리플라워 구조에서 마이그레이션할 개발 심근2를 커버. 단일 상피 세포 층이 형성 되 면 epicardial 셀의 일부 엽 전환 (응급) 상피를 겪 습. 응급, 중 셀 셀 셀 유착 등 상피의 특성을 잃게 되 고 그들에 게 개발 심근으로 마이그레이션할 수 있는 능력을 주는 엽 형을 얻을. 비록 후자는 두 셀 형성된 epicardial 파생된 셀 (EPDCs) 섬유 아 세포, 평활 근 세포, 그리고 잠재적으로 cardiomyocytes와 내 피 세포3를 포함 하 여 여러 심장 세포 유형으로 분화 할 수 있다 토론 (Smits 외 에 검토에 따라 인구 남아 4). 또한,는 epicardium 규제의 성장과 vascularization5,6,,78심근에 교육적 paracrine 신호를 제공 한다. 여러 학문은 장애인된 epicardial 형성 발달 결함 심장 근육9,10, 맥 관 구조11및 전도 시스템12, 필수 강조에 리드 설명 했다 심장의 형성에 epicardium의 기여 금.
성인 심장에는 epicardium 휴면 레이어로 있으면, 비록 그것은 허 혈13시 다시 활성화 된다. Epicardial 다시 활성화 후 상해의 몇몇이 프로세스 심장 개발을 위한 확산 및 응급14, 이기는 하지만 설명 덜 효율적으로. 흥미롭게도, 비록 정확한 메커니즘은 완전히 이해 되지 않습니다, 복구 epicardial 기여와 함께, 예를 들어, Thymosin β415 처리에 의해 향상 시킬 수 있습니다 또는 mRNA VEGF A16, ameliorated 심장에 결과 수정 심근 경색 후 함수입니다. epicardium 따라서 부상된 심장의 내 생 수리를 강화 하는 재미 있는 셀 소스를 여겨진다.
심장 개발의 메커니즘은 덜 효율적인 방식 상해, 동안 자주 지는. Epicardial 활성 검색 확인 하 고 태아 및 성인 epicardium의 전체 용량을 비교할 수 있습니다 우리가 최고입니다. 또한, 치료 관점에서, 동물 실험, 뿐만 아니라 우리 인간의 epicardium의 응답에 관한 지식을 확장 중요 하다. 여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)는 상피 세포 같은 형태학에 문화를 격리 하 고 구급 대를 유도 하는 방법을 설명 합니다. 이 모델을 우리는 탐구 하 고 성인과 태아 epicardial 셀 동작 비교 목표로 합니다.
이 프로토콜의 주요 장점은 철저 하 게 공부 하지는 인간의 epicardial 물자의 사용 이다. 중요 한 것은, 설명된 절연 및 세포 문화 프로토콜 두 태아 및 성인 자갈 EPDCs, 이러한 두 셀 소스 사이 직접적인 비교를 사용 하면 파생 단일 유니폼 방법의 제공 한다. 또한, 이후는 epicardium 격리 된 위치에 따라, 그것은 셀 실제로 epicardially 파생된17는 보장 된다.
인간의 EPDC 격리 방법을 이전 설립 되었습니다,이 주로 심장 또는 epicardial 조직의 조각 셀 문화 접시18,19에 도금는 파생물 프로토콜에 의존. 이 방법은 그로 인하여 세포는 부분적으로 마이그레이션하려면, 그들의 상피 표현 형을 잃고 그리고 자발적인 응급 수술 하는 경향이 더 위해 특별히 선택 합니다. 현재 프로토콜에서은 epicardium 상피 상태로 유지 하기 위해 고립 된 EPDCs를 허용 하는 단일 셀 솔루션으로 먼저 처리 됩니다. 이 메서드는 따라서 epicardial 응급 연구 단단한 체 외에 모델을 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0.25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin G sodium salt</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulphate</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 1:250 from bovine pancreas</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 6 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 12 well</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates 24 well</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&amp;micro;L Filtered Pipet Tips</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>5-ml pipet</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Or home-made and sterilized</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030120086</td><td></td></tr><tr><td>15-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50-ml centrifuge tubes</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>305959</td><td></td></tr><tr><td>Needles 19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Needles 21 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Cell Sieves, 100 &amp;micro;m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;3&amp;nbsp;</td><td>R&amp;amp;D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-Actin, &amp;alpha;-Smooth Muscle</td><td>Sigma</td><td>A2547&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Pipet controller</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Inverted Light Microscope</td><td>Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

the isolation and culture of primary epicardial cells derived from human adult and fetal heart specimens

Epicardium, 심근, 취재는 상피 세포 층 필수적인 역할 심장 개발 과정 뿐만 아니라 있다 복구 응답 심장의 허 혈 성 손상 후. 활성화 되 면, epicardial 세포 재생 심근 세포를 제공 하 엽 전환 (응급) 상피로 알려진 프로세스를 받 다. 또한,는 epicardium 필수 paracrine 요인의 분 비를 통해 기여 한다. 감사 하기 위해 완벽 하 게는 epicardium의 재생 잠재력, 인간 세포 모델이 필요 합니다. 여기 우리 소설 셀 문화 모델 인간 성인 그리고 태아 심장 조직에서 파생 하는 기본 epicardial 파생된 셀 (EPDCs)을 개설 한다. EPDCs를 분리 하는 epicardium 심장 표본의 외부에서 해 부 이며 단일 세포 현 탁 액으로 처리. 다음으로, EPDCs 도금 고가 5 키 억제제 그들의 상피 표현 형을 유지 하기 위해 SB431542를 포함 하는 EPDC 매체에서 경작. 구급 대는 TGFβ와 자극에 의해 유발 됩니다. 이 방법을 수 있도록, 처음으로, 제어 환경에서 인간의 epicardial 응급 과정의 연구 심장 재생을 원조 할지도 모른다 EPDCs의 secretome에서 더 많은 통찰력을 얻고 촉진 한다. 또한,이 균일 한 접근 인간 성인 그리고 태아 epicardial 행동의 직접적인 비교에 대 한 수 있습니다.

여기, 우리는 인간 성인 그리고 태아 심장 조직 (그림 1)에서 EPDCs를 분리 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜 (그림 1A) 심장의 외부에는 epicardium의 쉽게 접근할 수 있는 위치를 활용합니다. 해 부 WT1 + epicardium 기본 subepicardial 기질 및 심근 조직 손상 (그림 1J) 유지 하는 동안 제거 됩니다 보여 줍니다 후 심장 auricle의 얼룩. 광범위 한 특성 EPDCs 익스프레스 epicardial 마커, 예를 들어, 다른 심장 상주 세포 유형, 예를 들면, PECAM1, ISL1, CD34, 및 TNNT2의 ALDH1A2, TBX18, KRT8, KRT19 및 부족 식 시연 전에 수행 되었습니다. 17
성인 (그림 1 K)와 태아 (그림 1 L) EPDCs 조약돌 형태학 ALK5 kinase 억제제 SB431542 표시의 존재 양식. 그러나, 기증자와 문화 조건에 따라 태아 EPDCs 받을 수 응급 SB의 존재에도 불구 하 고. 이 조약돌 셀 (참조 그림 1 L에에서 화살표)의 인구 내의 스핀 들 모양의 셀에 발생할 수 있습니다. 태아 조직에서 조약돌 모양의 세포의 고립은 항상, 그리고 주로 스핀 들 모양의 셀의 파생 될 수 있습니다 유의 하십시오. 이 세포는 빨리 성장, 이후 그들은 신속 하 게 다른 세포 유형을 자라 다.
명확한 형태 전환 스핀 들 모양의 셀 (그림 2A)에 의해 증명으로 응급 성인 그리고 태아 세포에 5 일 동안 TGFβ320 잠복기에 의해 유도 될 수 있다. 치료 컨트롤 ("Empty")와 같이, 태아 EPDCs 성인 EPDCs TGFβ3와 자극에만 구급 대를 받게 될 것 이다 동안 SB의 제거에 따라 자발적인 구급 대를 받게 된다. 응급의 유효성을 검사 하려면 EPDCs immunostained 알파-부드러운 근육 걸 (αSMA), 엽 표식 (그림 2B)와 함께 했다. 또한, 응급 epicardial 마커의 WT1 qRT-PCR 보여주는 downregulation 엽 마커 POSTN, αSMA, 콜라겐 1A1, MMP3, 및 N-Cadherin (그림 2C)의 upregulation를 사용 하 여 성인 EPDCs에서 확인 됐다. 성인 및 태아 epicardial 응급에 관한 포괄적인 실험17전에 게시 됩니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>조직</td>
			<td>잘 입력</td>
			<td>세포 성장 지역 (cm2)</td>
			<td>매체 (mL)의 볼륨</td>
			<td>SB의 추가</td>
		</tr>
<tr>
<td>태아</td>
			<td>24</td>
			<td>1.9</td>
			<td>0.5</td>
			<td>직접</td>
		</tr>
<tr>
<td>성인 작은 (< 4cm)</td>
			<td>12</td>
			<td>3.8</td>
			<td>1</td>
			<td>1세인트 통과 후</td>
		</tr>
<tr>
<td>큰 성인</td>
			<td rowspan="2">6</td>
			<td rowspan="2">9.6</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">1세인트 통과 후</td>
		</tr>
<tr>
<td>(> 4 cm)</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 적절 한 세포 배양 접시를 선택 하기 위한 지침. 필요한 잘 크기 절연 epicardial 셀의 크기에 따라 달라 집니다. 이러한 지침을 적절 한 셀 문화 접시를 선택 엄지손가락의 규칙으로 사용할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>유전자</td>
			<td>시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>WT1 앞으로</td>
			<td>CAG CTT GAA TGC ATG ACC 안내</td>
		</tr>
<tr>
<td>WT1 역</td>
			<td>문신 TCT GTA TTG GGC TCC GC</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Cadherin 앞으로</td>
			<td>CAG ACC GAC CCA AAC AGC AAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-Cadherin 역</td>
			<td>GCA GCA ACA GTA AGG ACA AAC ATC</td>
		</tr>
<tr>
<td>POSTN 앞으로</td>
			<td>GGA GGC AAA CAG CTC AGA GT</td>
		</tr>
<tr>
<td>POSTN 역</td>
			<td>GGC TGA GGA AGG TGC TAA AG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMA 앞으로</td>
			<td>CCG GGA GAA AAT GAC TCA AA</td>
		</tr>
<tr>
<td>SMA 역</td>
			<td>GAA GGA ATA GCC ACG CTC AG</td>
		</tr>
<tr>
<td>MMP3 앞으로</td>
			<td>TGG ATG CCG 고양이 ATG 아 그</td>
		</tr>
<tr>
<td>MMP3 역</td>
			<td>CAG AAA TGG CTG 고양이 CGA</td>
		</tr>
<tr>
<td>COL1A1 앞으로</td>
			<td>CCA GAA GAA CTG GTA 고양이 CAG CA</td>
		</tr>
<tr>
<td>COL1A1 역</td>
			<td>CGC 고양이 법 CGA AAT GGG AAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAPDH 앞으로</td>
			<td>AGC CAC ATC GCT CAG ACA C</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAPDH 역</td>
			<td>GCC CAA 전술 GAC CAA ATC C</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2M 앞으로</td>
			<td>ACA CTG AAT TCA CCC CCA CT</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2M 역</td>
			<td>GCT 전술 ATG TCT CGA TCC CAC T</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: EPDCs에 응급의 유효성 검사에 사용 하는 뇌관 시퀀스. QRT-PCR를 위해 여러 세계로 표현 관련 성인 EPDCs에 유전자 확인 하는 데 사용 하는 정방향 및 역방향 뇌관의 시퀀스입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57370/57370fig1.jpg"> 그림 1 : 절연 Epicardial 파생 셀 (EPDCs). (A) Depicted 얇은 외부 막 층으로, 제거 epicardium 인간의 마음에서 제거 하는 성인 auricle입니다. 검은색 화살표는 epicardium를 가리킵니다. (B-난) EPDCs의 격리 방법의 시각적 표현입니다. 검은색 화살표 셀 펠 릿을 가리킵니다. (J) Immunofluorescent는 epicardium의 절 개 없이 심장 auricle의 얼룩. 눈금 막대: 50 µ m. (K) 대표 사진은 두 개의 다른 성인 EPDC 격리 하고있다 (L) 대표 사진 두 다른 태아 EPDC 격리 하고있다 검은 화살표와 경작의 경작의 태아에 엽 같은 셀 표시 EPDC 문화입니다. 눈금 막대: 200 µ m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57370/57370fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57370/57370fig2.jpg"> 그림 2 : 인간 성인 그리고 태아 Epicardial 파생 셀 (EPDCs)에 응급의 유효성 검사. 성인 및 태아 EPDCs SB, 치료 하지 (비어 있음)와 교양 또는 5 일 동안 TGFβ3와 자극. (A) 대표 밝은 필드 사진. 눈금 막대: 200 µ m. (B) DAPI 및 αSMA Immunostaining. 눈금 막대: 100 µ m. (C) mRNA 수준의 응급 관련 유전자, 성인 EPDCs qRT-PCR를 사용 하 여 결정. 측정된 값 GAPDH 및 B2M 식 정규화 되었다. 값 의미 + SD 2로 묘사 된다 ^-ΔΔct (n = 2). 약어: WT1:Wilms' 종양 1, MMP3: 매트릭스 Metalloproteinase 3, POSTN:Periostin, αSMA: 알파 Col1A1:Collagen 1A1 부드러운 근육 걸. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57370/57370fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens at JoVE.com

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.7K 조회수.  Leiden University Medical Center. epicardium 세포와 심근 벽에 성장 요소를 제공 하 여 개발 및 심장의 수리에 중요 한 역할을 하고있다. 여기, 우리는 연구와 그들의 발달 및 성인 특성의 비교 문화 인간의 기본 epicardial 셀 하는 방법을 설명 합니다.

비디오: The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing cardiovascular progenitors during development and disease. While a number of factors have been implicated in epicardium-derived cell (EPDC) mobilization, the mechanisms governing their subsequent migration and differentiation are poorly understood. Here, we present in vitro and ex vivo strategies to study EPDC motility and differentiation. First, we describe a method of obtaining primary epicardial cells by outgrowth culture from the embryonic mouse heart. We also introduce a detailed protocol to assess three-dimensional migration of labeled EPDC in an organ culture system. We provide evidence using these techniques that genetic deletion of myocardin-related transcription factors in the epicardium attenuates EPDC migration. This approach serves as a platform to evaluate candidate modifiers of EPDC biology and could be used to develop genetic or chemical screens to identify novel regulators of EPDC mobilization that might be useful for cardiac repair.

Epicardial Outgrowth Culture Assay and Ex Vivo Assessment of Epicardial-derived Cell Migration

Here, we describe methods for isolating primary mouse epicardial cells by an outgrowth culture assay and assessing the functional migration of epicardial-derived cells (EPDC) using an ex vivo heart culture system. These protocols are suitable for identifying genetic and chemical modulators of epicardial epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) and motility.

심 외막 파생물 문화 분석 및<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 심 외막 유래 세포 마이그레이션 평가

A single layer of epicardial cells lines the heart, providing paracrine factors that stimulate cardiomyocyte proliferation and directly contributing ...

연구

발생학

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

인간의 심장 조직에서 혈관 주위 능성 전구체 세포 집단의 분리

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium differentiate into smooth muscle cells, fibroblasts and endothelial cells that contribute to the formation of coronary vessels. Here we have established an in vitro culture method for embryonic epicardial cells. Using genetic labelling, we have demonstrated that the majority of the migrating cells in our explant culture are of epicardial origin. Epicardial explant cells also retain the expression of epicardial markers (Wt1 and Tbx18). Furthermore, we provide evidence that epicardial explant cells undergo epithelial to mesenchymal transition (EMT), migrate and differentiate into smooth muscle cells after Transforming growth factor beta 1 (TGF-&#946;1) treatment in a manner indistinguishable from that of epicardial cells in vivo. In conclusion, we provide a novel method for the culture of embryonic epicardial cells, which will help to explore the role of specific genes in epicardial cell biology.

In Vitro Culture of Epicardial Cells From Mouse Embryonic Heart

The epicardium is an essential source of multipotent cardiovascular progenitor cells and paracrine factors that are required for cardiovascular development and regeneration. We describe here a method to culture mouse embryonic epicardial cells.

마우스 배아 심장에서 심 외막 세포의 체외 배양에서

During embryogenesis, the epicardial contribution to coronary vasculature development has been very well established. Cells derived from the epicardium ...

공학

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

의학

Isolation of Endocardial and Coronary Endothelial Cells from the Ventricular Free Wall of the Rat Heart

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. Consequently, these two cell populations play unique roles in cardiac diseases. Current studies involving isolated endothelial cells investigate cell populations consisting of both EECs and CECs. This protocol outlines a method to independently isolate these two cell populations for cell-specific characterization. Following the collection of the left and right ventricular free wall, endothelial cells from the outer surface and inner surface are separately liberated using a digestion buffer solution. The sequential digestion of the outer surface and the inner endocardial layer retained separation of the two endothelial cell populations. The separate isolation of EECs and CECs is further verified through the identification of markers specific to each population. Based on previously published single cell RNA profiling in the mouse heart, the Npr3, Hapln1, and Cdh11 gene expression is unique to EECs; while Fabp4, Mgll, and Cd36 gene expression is unique to CECs. qPCR data revealed enriched expression of these characteristic markers in their respective samples, indicating successful EEC and CEC isolation, as well as maintenance of cell phenotype, enabling further cell-specific functional analysis.

We present a protocol for the isolation of endocardial and coronary endothelial cells from rat hearts through sequential tissue digestion in a digestion buffer, cell collection from recurrent centrifuge cycles, and cell purification using anti-rat CD31 microbeads.

쥐 심장의 심실 무료 벽에서 내심 내피 및 관상 내피 세포의 격리

It has been shown that endocardial endothelial cells (EECs) and coronary endothelial cells (CECs) differ in origin, development, markers, and functions. ...

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice. To investigate the electrical and biological properties of cardiac melanocytes we developed a procedure to isolate them from mouse hearts that we derived from those designed to isolate neonatal murine cardiomyocytes. In order to obtain healthier cardiac melanocytes suitable for more extensive patch clamp or biochemical studies, we developed a refined procedure for isolating and plating cardiac melanocytes based on those originally designed to isolate cutaneous melanocytes. The refined procedure is demonstrated in this review and produces larger numbers of healthy melanocyte-like cells that can be plated as a pure population or with cardiomyocytes.

In this protocol, we identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial arrhythmia triggers in mice.&#160;

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

생물학

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

배아 심실 내피 세포의 분리

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

면역 세포 화학 및 Ploidy 분석을 위한 고정된 심혼에서 심근세포의 격리

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...