وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم NSF-IOS المنحة الوطنية # 1144391 إلى البنك السعودي الهولندي.

1. إعداد النباتات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن نبتت بذور نبات الأرابيدوبسيس مباشرة على التربة أو على لوحات MS. تنمو النباتات لمدة أربعة إلى ستة أسابيع في غرف النمو مع الإضاءة 12 ساعة (22 ° C يوم، 15 ° C يلة 14). محطات المياه مرة واحدة إلى مرتين في الأسبوع. استخدام الدرج السفلي للسقي، لا محطات المياه من أعلى؛ تسمح الأدراج لتجف قبل إعادة سقي. التأكد من النباتات جيدا المائية في وقت الحصاد. </li></ol> 2. إعداد حلول والأطباق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> K-EDTA 2 الحل: إصنع ملي K-EDTA 2 الحل الحل 100 الأوراق المالية، والتي يمكن أن تبقى في الثلاجة. في يوم جمع وتمييع الحل 04:59 (جزء واحد EDTA حل، وأربعة أجزاء من الماء) للحصول على 20 ملي K-EDTA حل 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كوب أو طبق بتري (قطر 7-15 سم) في منتصف الطريق مع ملي 20 K-EDTA حل 2. إذا جمع عينات من العلاجات المختلفة (لالسابقينمراقبة وافرة والنباتات المجهدة الملح أو المورثات مختلفة)، وإعداد أطباق منفصلة لكل معاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء العدد المرغوب فيه من 1.7 مل أنابيب رد فعل مع 1.4 مل من 20 ملي K-EDTA حل 2. ملء عدد متساو من أنابيب رد فعل مع 1.4 مل تعقيمها الماء منزوع الأيونات أو ميليبور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع المناشف الورقية على مقاعد البدلاء لوضع النباتات على؛ الحصول على واحد شفرة حلاقة جديدة وضعت على قفازات. </li></ol> 3. جمع من اللحاء الإفرازات (كما هو مبين في المخطط الانسيابي في الشكل 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريدة الحصاد يترك من أربع إلى ست محطات من العمر الأسبوع بالقص مع شفرة حلاقة في قاعدة قريبة سويقات إلى وسط ريدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على الفور يترك في الأطباق التي تحتوي على 20 ملي K-EDTA 2. تأكد من المغمورة نهاية قطع من سويقات في الحل (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة وقد تم جمع 15 ورقة (حوالي 3-4 النباتات)، كومة الأوراق بلطف على أعلى من كل هذه ر الأخرىيتم محاذاة قبعة قطع أعناق مع بعضها البعض. Recut قاعدة أعناق (حوالي 1 ملم)، ونقل على الفور الأوراق إلى واحدة من أنابيب رد فعل مع ملي 20 K-EDTA حل 2. الأوراق تناسب أسهل إذا كانت وتوالت ارتفاعا طفيفا. تجنب الضغط على الأوراق في لأن هذا قد يسبب إصابة الخلايا، وبالتالي، ويؤدي إلى جمع المحتوى الخلية ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اذا كانت هناك حاجة المزيد من المواد، وتغطي بلطف عينات مع منشفة ورقية مبللة. استخدام مجموعة جديدة من الأطباق إذا لجمع عينات من العلاجات أو الأنماط الجينية المختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم وضع جميع العينات في أنابيب رد فعل، وجمع الإفرازات إما في الظلام أو في الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع في الظلام، خط الكلمة من طبق ضحل كبير مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في طبق وإما غطاء مع مناشف ورقية مبللة أو وضعها في عودة البلاستيك الأسود مع الشقوق للتهوية. وضع الإعداد كامل في خزانة أو غرفة مظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجمع في ضوء، خط الجزء السفلي من وعاء شبكي واضحة مع مناشف ورقية مبللة. وضع رف مع أنابيب رد فعل ورقة مليئة في حاوية وإغلاقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، إزالة الأوراق بلطف من الحاوية وأنابيب رد فعل ويغسل جيدا بالماء المقطر، منزوع الأيونات أو ميليبور لإزالة جميع EDTA. هذه الخطوة يخدم ثلاثة أغراض: (1) أنه يزيل EDTA إلى الضرر التقليل إلى الخلايا، (2) أنه يلغي تدخل من EDTA مع SDS-PAGE واللوني، و (3) يزيل أي المركبات التي تراكمت من قطع / التالفة الخلايا. نقل على الفور الى رد فعل أنابيب معدة تحتوي على الماء تعقيمها والعودة إلى حاويات جمع مرطب لجمع الإفرازات. في هذه المرحلة، إضافة ريبونوكلياز المانع إذا احتاج الافرازات لاستخدامها في استخراج الحمض النووي الريبي. اختياري: يمكن إضافة مثبطات بروتين إذا كان المطلوب تحليل البروتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وقت جمع المقصود، سحب وDISCAطريق الأوراق واللحاء تجميد الإفرازات في السائل N 2 لاستخدامها مرة أخرى. اذا كانت هناك حاجة التخزين الموسعة، يجفد العينات وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة نبات الأرابيدوبسيس، يمكن بالفعل يتم الكشف عن نواتج الأيض بعد مجموعة من الإفرازات لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، وجمع ل5-8 ساعة من المستحسن إذا تم التخطيط تحليل مكونات أقل وفرة. للنباتات الكبيرة مثل بريلا، ينصح مرات جمع أطول (8 ساعات). الافرازات التي تم جمعها من 15 ورقة هو عادة ما يكفي لحارة واحدة على SDS-PAGE هلام (البروتينات)، لاستخراج مرنا، GC-MS (السكريات ونواتج الأيض). لتحليل الدهون ويوصى تجميع عينات 2-3 (30-45 ينضح يترك) ويؤدي إلى نتائج أكثر وضوحا. </li></ol> 4. التحليل اللاحق (للحصول على الفيديو نظهر فقط 4.4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل البروتين، عينة resuspend في 15 ميكرولتر المياه و 30 ميكرولتر العازلة Lämmli والحرارة إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، وتدور بسرعة إلى أسفل أي عrecipitates وتحميل عينة كامل الصعود إلى SDS-PAGE هلام (45 جيوب التحميل ميكرولتر). يجب أن تكون ملطخة العينات مع Coomassie صمغي أو البقع الحساسة الأخرى منذ فرة البروتين منخفض جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنسبة للسكر وتحليل المستقلب صغيرة، إضافة derivatizing كلاء لالعينة المجففة كما هو موضح في الأدب 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرنا يمكن تحليلها باستخدام RT-PCR، ميكروأري أو تحليل الحمض النووي الريبي تسلسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحليل الدهون على الفور تجمع 2-3 العينات وقسم ضد الكلوروفورم: ميثانول (1:1) في غطاء الدخان كما يلي: إضافة مبلغ مساو من الكلوروفورم: ميثانول إلى كل عينة، دوامة لمدة بضع ثوان، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 400 ز س. جمع (العضوية) مرحلة القاع في أنبوب زجاجي مع غطاء تفلون وتكرار التقسيم مع مرحلة أعلى ثلاث مرات أكثر. تجفيف المراحل العضوية المشتركة تحت تيار من N 2 وتقدم إلى مزيد من التحليل (طبقة رقيقة اللوني: TLC 14، 37؛ السائل اللوني الكتلة الطيفي: LC-MS 14). </li></ol>

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

جمع EDTA-سهلت من اللحاء الإفرازات بسيطة جدا، ويحتاج الحد الأدنى من المعدات، وينطبق على معظم النباتات. وعموما، هذا الأسلوب يمتد القدرة على تحليل الإفرازات اللحاء من أكثر الأنواع. على الرغم من أن الافرازات غير المخفف، فمن السهل أن جمع العديد من عينات مختلفة أو من العديد من النباتات لزيادة لكمية كبيرة من المواد. هذا ثم يسمح للكشف عن المركبات الرواية التي هي في وفرة منخفضة جدا وولاها يمكن تجاهلها. هذه الطريقة يمكن استخدامها لأنواع النباتات متعددة ويعمل كما هو موضح لتلك المذكورة في هذه المخطوطة. إذا يتم استكشاف أنواع جديدة، واثنين من الجوانب التي قد تحتاج إلى تعديل هي عدد الأوراق المستخدمة والوقت من نضح. في معظم الحالات، ينبغي أن يكون نضح 5-8 ساعة مناسبة. للتأكد من استخدام هذه الطريقة للحصول على الأنواع النباتية الجديدة، الافرازات يحتاج إلى جمع واحد أو أكثر من تحليل لاحقة كما هو موضح في البروتوكول جزء 4 نeeds التي يتعين القيام بها. اعتمادا على شدة إشارة لوحظ، قد تحتاج إلى جمع حجم زيادتها. بشكل عام، سوف الدهون والبروتين تحليل تتطلب المزيد من المواد من السكر والأيض تحليل منذ السابق هي أقل وفرة في الإفرازات اللحاء. لأن جمع الافرازات EDTA-سهلت ينطوي على السطوح قطع فضلا عن تأثير المدمر المحتمل لEDTA، عدة نقاط يجب النظر فيها: (1) بعد الحضانة ساعة واحدة مع EDTA، وأعناق يجب غسلها جيدا. هذا يزيل أي المركبات التي تم الحصول عليها من خلايا الجرحى فضلا عن EDTA نفسها، والتي يمكن أن تضر خلايا أو تتداخل مع الاستخراج. (2) بحاجة الضوابط الإيجابية والسلبية التي ستدرج لضمان وتستمد البيانات التي تم الحصول عليها من اللحاء SAP وليس من خلايا المصاب (انظر الخطوات الحاسمة أدناه). (3) اللحاء SAP لا تحتوي على العديد من الإنزيمات، والتي يمكن أن تكون نشطة خلال جمع الافرازات. وبالتالي، في بعض الحالات، قد يكون من المفيد جمع FOR كميات مختلفة من الوقت. (4) منذ الأسلوب تشارك نضح في الماء، وهو الكمي المطلق من المركبات غير ممكن. الخطوات الحاسمة: إن مفتاح نجاح استخدام هذا الأسلوب هو استخدام الحذر أثناء التعامل مع العينة أن لا تجرح أي الخلايا وكذلك استخدام الضوابط المناسبة (انظر المرجع 14). واحد للتحكم مناسبة هو مجموعة من الإفرازات اللحاء دون معالجة مسبقة مع EDTA. في هذه الحالة سوف اللحاء عزل نفسه ويمكن جمع أي الافرازات. سوف يتم الكشف عن أي تلويث المركبات القادمة من خلايا الجرحى هنا. ومن شأن التحكم الثاني يكون تحليل السكريات في الافرازات. في نبات الأرابيدوبسيس، ينبغي أن يكون السكروز السائد الأيض داخل اللحاء SAP، مع الفركتوز إلى نسبة السكروز من 1:04 حتي 01:08 (المرجع 8، 14). لاستخراج الحمض النووي الريبي استخدام مثبط ريبونوكلياز هو ضروري. وبالإضافة إلى ذلك، تحكم إيجابية من describ سابقاإد مرنا اللحاء المترجمة (UBC9: اليوبيكويتين انزيم التصريف 9، At4g27960، 8، 14) والسيطرة السلبية من على سبيل المثال مرنا بلاستيدات الخضراء (Rubisco LSU) هي الأفضل. لأن الافرازات تحتوي على خمائر نشطة، وينصح دورة الوقت لإجراء تغييرات في التشكيل الجانبي متأكد من اللحاء ليست ببساطة بسبب الاختلافات في وقت جمع. في بعض الحالات، قد يكون من المفيد استخدام مثبطات بروتين. ومع ذلك، فإن المحققين بحاجة إلى أن نضع في اعتبارنا، أن الافرازات التي تم جمعها سوف تتركز والتي سوف تتركز إلى حد كبير أي مركبات المضافة. والخطوة الثانية الحاسمة ضمن البروتوكول هو recutting من سويقات تحت EDTA. هذه الخطوة تخدم غرضا مزدوجا: أولا، أنه يزيل أي لوحات غربال مختومة في حين منع تشكيل جديد المقابس وبالتالي السماح للتدفق الحر للاللحاء SAP. الثاني، فإنه يزيل فقاعة التجويف في الخشب ولدت في حين خفض وبالتالي يسمح للنقل الخشب. حجم الخفض الثاني تعتمدق على النباتات المستخدمة. في النباتات مع أعناق أكبر ينبغي أن يكون عدة مليمترات (ما يصل إلى 1 سم) فوق قطع الأول، في النباتات مثل نبات الأرابيدوبسيس، مم 1-2 تكفي. ويمكن استخدام هذه الطريقة تؤدي إلى اكتشاف مركبات جديدة في الإفرازات اللحاء التي كان يمكن أن يشير، والآثار التنموية أو الطب الحيوي. وقد دفع ذلك أكثر نظرة متعمقة في إشارة الدهون لمسافات طويلة، والذي كان حقل القليل المدروسة ضمن علوم النبات ويرجع ذلك إلى عدم الوصول إلى اللحاء.

النباتات لا يمكن أن تتحرك إلى الفرار من الظروف المعاكسة. ونتيجة لذلك، كان لديهم لتطوير آليات للكشف عن الضغوط البيئية، وانتزاع إرسال إشارة ذات الصلة في جميع أنحاء المصنع، وضبط التنمية وفقا لذلك. توجد نظم النقل اثنين لتوزيع المياه والمواد الغذائية وغيرها من المركبات (إشارات). الأول هو الخشب؛ الذي ينقل عادة الماء والمعادن تناولها من قبل الجذور في جميع أنحاء المصنع. والثاني هو اللحاء. لقد تغيرت وجهة نظر اللحاء من استيعاب نظام النقل بسيطة لقناة لRNA والبروتين، والفيروسات، والدهون والجزيئات الصغيرة الأخرى. انها تلعب دورا هاما في استيعاب ونقل المواد الغذائية، استجابة للضغوط الحيوية وغير الحيوية، وكذلك في نمو وتطور النبات. ويطلق الآن عليها اسم &quot;طريق المعلومات السريع&quot; من النبات 18. ويتكون اللحاء من عدة أنواع من الخلايا: لحمة اللحاء، وكذلك رفيق المتخصصة CELLS وعناصر غربال. العنصر غربال هو موقع الحركة لمسافات طويلة. للسماح لتدفق طولية دون عائق، وعناصر غربال مفقودة معظم العضيات وكذلك النوى والتي يعتقد أنها تحتوي في أحسن الأحوال محدودة الآلات متعدية 21، 33. ويعتقد أن الخلايا رفيق تجميع البروتينات وغيرها من المركبات التي تسافر في تيار اللحاء. ثم يتم نقل هذه المركبات إلى عنصر غربال عبر رابطات هيولية ويمكن أن تعمل كإشارات لمسافات طويلة 4،16. يمكن العثور على عدة مجموعات من المركبات في الإفرازات اللحاء: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السكريات وغالبا ما تكون المنتجات من التمثيل الضوئي ويتم نقلها على أنها &quot;تحمل الطاقة&quot; الجزيئات إلى أجزاء أخرى من النبات لتخزين أو لبنات البناء. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تعمل أيضا كمضاد للتجميد أو كما يشير المركبات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن أيضا أن تكون موجودة في البروتينات الإفرازات اللحاء. وهي تشمل الإنزيمات الأيضية ولكن أيضا قد يشير إلى وظيفة. واحد أمثلجنيه من البروتين والتي هي بمثابة إشارة التنموية هي مزهرة موضع T البروتين، وهو ما يشير إلى تحريض المزهرة وكذلك اقتطاع ورقة الموسمية في النباتات. 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأحماض النووية موجودة في الإفرازات اللحاء في شكل مرنا، الرناوات الصغيرة ومتناهية الصغر، والرنا الفيروسي. تظهر أن تشارك إلى حد كبير في إشارة 27، 28، 39. في نفس الوقت، وقد لوحظت الريباسي وtRNAs لجميع الأحماض الأمينية تقريبا في اللحاء SAP من القرعيات 42. تظهر على أن يتم تحويلها بشكل انتقائي في النظام أنبوب غربال. وtRNAs تظهر التعديلات الضرورية نظرا لقدرته على نقل الأحماض الأمينية إلى الجهاز متعدية. حتى الآن، بدلا من المشاركة في الترجمة، ويبدو أنها تمنع هذه العملية. بدلا من ذلك، فإنها يمكن أن تكون بمثابة مصدر سيتوكينين أو إشارة حالة التمثيل الغذائي للنبات 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم العثور على الأحماض الدهنية، oxylipins، والدهون الأخرى أيضا في اللحاء الإفرازات 3، 13، 14، 23. JasmoNIC حامض، تتحرك oxylipin من خلال اللحاء كجزء من الاستجابة للعدوى الممرض 22، 29، 31، 32. في حين أن دور معظم الدهون اللحاء لا يزال غير واضح، وبعضها من المرجح أن يشير ظيفة 4. </li></ul> ويتمثل التحدي في العمل مع اللحاء النبات تكمن في قدرته على عزل نفسه عند اصابة. هناك أربعة أساليب رئيسية تستخدم لجمع الإفرازات اللحاء، ولكنها تعمل فقط في الأنواع حدد: 1) في القرعيات أنه من الممكن الحصول على كميات معقولة من اللحاء الافرازات من خلال تخفيضات للسويقات. بمجرد إزالة الانخفاض الأولي مع التلوث من الخلايا المصاب، فمن الممكن الحصول على كميات كبيرة من الذهب الخالص معقول اللحاء SAP 1، 15. ومع ذلك، مع زيادة وقت جمع، هذه الافرازات يثخن، مما يجعلها غير صالحة على نحو متزايد لنهج اللوني السائل (غير منشورة). المنشورات الأخيرة تشير إلى أن تبعا للأنواع، ويستمد هذا اللحاء SAP من eitheص حزمي (FP) أو extrafascicular اللحاء (EP) والتي، في حين أنها لا تحتوي على &quot;المحمول&quot; اللحاء SAP من العناصر غربال (FP)، بل هو أيضا عرضة للتلوث من أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخشب 40، 41 . 2) والنهج الثاني هو الحصول على اللحاء SAP من خلال تخفيضات الضحلة أو ثقوب في الساق أو سويقات. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح في الترمس 17، 25، 36 القرعيات، والكرنب napus 12. هنا التلوث من الخلايا المصاب هو الحد الأدنى والإفرازات نقية جدا. ومع ذلك، النباتات تحتاج إلى أن تكون صحية وجيدة تسقى منذ انها صعبة للغاية لثقب انتقائي فقط العناصر غربال. إذا رصدت سفن الخشب، ويوجه كل الافرازات في مجرى الخشب. هذا يجعل طريقة غير مناسبة للنباتات مع أعناق أو سيقان هشة للغاية أو lignified للغاية. 3) stylectomy المن المن يسمح لإدراج مرود بهم في عناصر غربالن إزالة أولا بأول مع ليزر. وناضح اللحاء SAP من خلال ما تبقى من مرود 2، 9، 10، 35، 38. من الناحية النظرية، أي النباتات التي يمكن أن تصاب المن يمكن استخدامها لهذا النهج. ومع ذلك، فإن معظم الدفيئة أو مديري غرفة نمو لا يعتمد استخدام الممرض. وبالإضافة إلى ذلك، المن إدخال العديد من البروتينات في اللحاء مع لعابهم 19، 33. وهذا يؤدي إلى إعادة برمجة النسخي محدودة 30 و لديه القدرة على تغيير التركيبة اللحاء 26. 4) وصف الأسلوب هنا هو نضح EDTA-سهلت من اللحاء SAP. هذا الأسلوب يستخدم EDTA لمنع تسرب من اللحاء 20. EDTA يخلب كا 2 + الأيونات التي ستشارك خلاف ذلك في العمليات التي ختم اللحاء. بينما EDTA يمكن أن يؤدي إلى تلف الخلايا 30، وقد استخدمت عدة مجموعات هذا الأسلوب، ويلاحظ أي تأثير سلبي من تركيزات EDTA من 10 ملم إلى 20 ملم على التركيب الدقيق خلية أو على phloeم التحميل والنقل 5، 24. للحد من أي تأثير ضار وكذلك التدخل من EDTA مع اللوني وهلام الكهربائي، يتم نقل النباتات الى الماء بعد 1 ساعة، ويستخدم فقط في جزء لاحق من الافرازات 14. وهكذا، بدلا من نضح في EDTA، وexudated اللحاء في الماء (EDTA-سهلت نضح). بل هو مستقيم إلى الأمام، وانخفاض التكلفة، ومنخفضة التقنية طريقة لجمع الإفرازات اللحاء. الحصول على اللحاء SAP بهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لتحليل البروتينات والجزيئات الصغيرة، والدهون، والرنا واستخدمت بنجاح في العديد من النباتات. في حين قد تم تنفيذ كمية محدودة من التجارب في ذوات الفلقة 11، الأسلوب يبدو أن أكثر ملاءمة لdicots (بريلا 17، 20، نبات الأرابيدوبسيس 8، 13، 14، الحور 7). مجموعة من الإفرازات أن تحدث في بيئة رطبة لتجنب فقدان الإفرازات من خلال النتح. اعتمادا على النبات، الحضانة في EDTA ل1-2 ساعات هوكافية لمنع ختم العناصر اللحاء / غربال. ويمكن بعد ذلك تحدث جمع في الماء. وهذا له فائدة من منع التأثير السلبي EDTA لديه على بنية الخلية والاستقرار. كما أنه يزيل التدخل من EDTA مع طرق مثل HPLC أو SDS-الصفحة. ويرد عليه كما ينطبق على نبات الأرابيدوبسيس. للنباتات أكبر، الحضانة في EDTA والافرازات مجموعات لابد من زيادتها، ويتم تنفيذها في الأكواب بدلا من 1.7 في أنابيب رد فعل مل.

<table><tbody><tr><td>K2-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED2P-500G</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15cm)</td><td>PYREX or Corning</td><td></td><td>Any clean, shallow dish will work</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>EMD</td><td>CX1054-1</td><td>Only open containers in fume hood</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>J.T.Baker</td><td>9070-03</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>VWR International</td><td>53283-800</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Screw cap tubes</td><td>Sun Sri</td><td>13-425</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td>&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

اللحاء المصنع هو ضروري لنقل لمسافات طويلة من (الصور) تستوعب وكذلك من الإشارات نقل الإجهاد الحيوية أو غير الحيوية. أنه يحتوي على السكريات والأحماض الأمينية والبروتينات والحمض النووي الريبي، والدهون والأيض الأخرى. بينما هناك اهتمام كبير في فهم تركيبة ووظيفة اللحاء، ودور كثير من هذه الجزيئات، وبالتالي، أهميتها في تطوير المصنع والإجهاد استجابة لديه لم يتحدد بعد. واحد عائقا أمام تحليل اللحاء تكمن في حقيقة أن الأختام اللحاء نفسه على جرح. ونتيجة لذلك، فإن عدد النباتات التي يمكن الحصول عليها اللحاء SAP محدودة. أسلوب واحد الذي يسمح مجموعة من الإفرازات اللحاء من عدة أنواع النباتات دون معدات المضافة هي اللحاء جمع الافرازات EDTA التي يسهلها وصفها هنا. في حين أنه من السهل الاستخدام، وأنها لا تؤدي إلى جرح الخلايا والرعاية يجب أن يؤخذ لإزالة محتويات الخلايا التالفة. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من الضوابط لإثبات نقاء الافرازاتضرورية. لأنها تحلب بدلا من التحصيل المباشر من اللحاء SAP (غير ممكن في كثير من الأنواع) يمكن أن يحدث الكمي النسبي فقط من محتوياته. وميزة هذا الأسلوب مقارنة مع الآخرين هو أنه يمكن استخدامها في العديد من الأنواع النباتية العشبية أو الخشبية (بريلا، نبات الأرابيدوبسيس، الحور، الخ) ويتطلب الحد الأدنى من المعدات والتدريب. أنه يؤدي إلى كميات كبيرة من الإفرازات معقولة التي يمكن استخدامها لتحليلها لاحقا من البروتينات، والسكريات، والدهون، والحمض النووي الريبي والفيروسات ونواتج الأيض. انها بسيطة بما فيه الكفاية أنه يمكن أن تستخدم في كل من البحث وكذلك في مختبر التدريس.

لقد أصبح واضحا خلال السنوات القليلة الماضية أن تعقد اللحاء SAP قد يكون الجواب على السؤال عن كيفية إرسال إشارات متفاوتة النباتات التنموية والإجهاد للاستجابة المثلى. باستخدام EDTA-سهلت اللحاء نضح قد توفر فرصة لتحليل الإفرازات اللحاء من النباتات التي ليست مناسبة للمناهج أخرى ولكن قد يكون من مصلحة اقتصادية أو الفسيولوجية. هذا الأسلوب يسمح للحصاد ما يكفي من اللحاء الإفرازات لتحديد البروتينات اللحاء المترجمة وكشف عن تغيرات في مستوياتها استجابة لتطوير أو الإجهاد (الشكل 3). كما يظهر في الشكل، هي في وفرة البروتينات منخفضة جدا، وحتى الآن، ومستوى مرتفع بما يكفي لتجارب لاحقة باستخدام البروتينات LC-MS/MS أو تحليل لطخة غربية. النتائج في القرعيات تشير إلى أن قطع من جذع يؤدي إلى اختلال التوازن إمكانات المياه وتدفق المياه واللاحقةالملوثات المحتملة من apoplast 41. بعد جمع لمرات تتراوح 1-8 ساعات لا يؤثر على البروتين الشخصي اللحاء / تكوين في نبات الأرابيدوبسيس (. فقط المبلغ المطلق يختلف Guelette وآخرون)، وكمية البروتين التي تم جمعها وهذا النمط من البروتينات الموجودة تختلف بين الأنواع (نبات الأرابيدوبسيس: في؛ بريلا، لين أنا وNI) والعلاجات (بريلا نمت في أطوال مختلفة اليوم، لين أنا وNI). ونتيجة لذلك الإشارات البروتينية يمكن تصور، التي تم تحديدها، واتباعها. ويمكن أيضا أن تحدد مرنا ومتناهية الصغر الرنا في الإفرازات اللحاء بواسطة هذه الطريقة. ومع ذلك، مع العلاج ريبونوكلياز المانع ضروري لمنع تدهور مرنا خلال الفترة الممتدة نضح. منذ العناصر غربال لا تحتوي على البلاستيدات الخضراء وظيفية، Rubisco صغيرة أو كبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء أو RbcL، على التوالي) mRNAs ويمكن استخدام ضوابط السلبية، في حين أن المعروف اللحاءالمترجمة مرنا مثل انزيم اليوبيكويتين-التصريف يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية (الشكل 4). وبالمثل، السكريات او نواتج صغيرة يمكن تحليلها باستخدام GC-MS أو LC-MS. وهنا تجدر الإشارة إلى أن الإفرازات اللحاء تحتوي على عدد كبير من الانزيمات وظيفية، بما في ذلك ما يقرب من مسار حال السكر كامل 12. وبالتالي، وذلك باستخدام العديد من النقاط الزمنية قد تكشف عن عمليات التمثيل الغذائي خلال جمع الافرازات. ويرد مثال في الشكل (5): في جميع الإفرازات، والسكروز هو المستقلب الأكثر وفرة، وهذا هو الأكثر وضوحا بعد جمع لمدة 1 ساعة. ومع ذلك، بعد خمس ساعات وانخفاض طفيف في نسبة السكروز إلى سكر الفواكه. إذا تم جمعها نفس الافرازات لمدة ساعة واحدة وترك على مقاعد البدلاء لساعات الأربع المقبلة، يتم تقليل السكروز إلى الفركتوز نسبة إلى حد أكبر من ذلك بكثير، مما يدل على أن الانزيمات النشطة في اللحاء الإفرازات تؤدي إلى تدهور السكروز في غرفة TEMاحلرارة (لمزيد من التفسيرات الذروة انظر 14). وهذا يتفق مع النتائج التي اللحاء التحميل والنقل من الجزيئات من الخلايا رفيق في عناصر غربال قد يستمر خلال نضح حتى يفقد النظام حيويتها 34. نسبة الدهون في الإفرازات اللحاء، وبالتبعية، مما يشير إلى الدهون لمسافات طويلة هي مجال حديث نسبيا من الاهتمام في علوم النبات. ونظرا لنسبة الدهون في طبيعتها مسعور موجودة فقط في تركيزات منخفضة، وربما يكون منضما إلى جزيئات أخرى لالانحلالية. ومع ذلك، فإن نضح EDTA-سهلت يسمح لجمع مادة كافية لتصور (TLC؛ الشكل 6) وتحديد (LC-MS؛ الشكل 7) نسبة الدهون في اللحاء من العديد من الأنواع النباتية. كما يظهر في الشكل فمن الممكن لتحديد وفصل العديد من الأنواع الدهنية. LC-MS يسمح لتحديد الأنواع المختلفة الدهون ورصد التغيرات في ملامح من المادة الدهنية من احالمورثات NT أو العلاجات. وهذا يسمح لدراسة دور الدهون خلال تطوير المصنع والاستجابة للضغط النفسي. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> الشكل 1. مخطط تدفق من مجموعة من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس أو بريلا. مسارات مختلفة تؤدي إلى منتجات نهائية مختلفة، والتي أشارت في الزرقاء. لإعداد الحمض النووي الريبي، ريبونوكلياز المانع (100 U / مل، روش) يضاف إلى الماء الذي يتم جمع الافرازات اللحاء. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> الشكل 2. إعداد المواد اللازمة لجمع اللحاء الافرازاتأيون. يعرض إعداد جميع المواد اللازمة لخطوات بروتوكول 3،1-3،4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (3)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> الشكل 3 البروتينات الموجودة في اللحاء الإفرازات اثنين من الأنواع المختلفة النبات، نبات الأرابيدوبسيس (في) وبريلا (أنا وNI؛ أطوال اليوم مختلفة)؛ MW: الجزيئية علامة الوزن (حارة 2). تم فصل البروتينات باستخدام التدرج 10-20٪ SDS-PAGE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> الشكل 4. تحليلوجود مرنا لRubisco الصغيرة والكبيرة الوحيدات (كرات الدم الحمراء وRbcL، على التوالي) وانزيم اليوبيكويتين-التصريف (UBC). وقد تم جمع مرنا من أوراق نبات الأرابيدوبسيس (L)، أعناق (P)، والإفرازات اللحاء (PH)، عكس النصوص المحولة ومحددة تصور باستخدام PCR. تم تعديل الرقم من Guelette وآخرون 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> الشكل (5). الشخصي GC-MS من اللحاء الإفرازات التي تم جمعها لكمية مختلفة من الأوقات. لاحظ كيف أن الكمية النسبية للتغيرات السكروز من المجموعة رقم 1 ساعة (A) إلى 5 ساعات من وقت جمع (B). الافرازات الشخصي بعد جمع لمدة 1 ساعة تليها &quot;الحضانة&quot; في غرفة<html> درجة الحرارة (RT) لمدة أربع ساعات (C). أوراق الملف الشخصي الأيض (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الشكل (6)" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> الشكل (6). طبقة رقيقة اللوني مقارنة الدهون من بريلا (يسار) ونبات الأرابيدوبسيس أوراق (يمين) والإفرازات اللحاء. العلامات النجمية تشير الدهون محددة لالإفرازات اللحاء. DGDG: digalactosyldiacylglycerol؛ PG: phosphatidylglycerol؛ MGDG: monogalactosyldiacyglycerol، وجزء من شخصية عرض الدهون نبات الأرابيدوبسيس تم تعديل من Guelette وآخرون 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . NT &quot;FO: المحافظة على together.within الصفحات =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> الرقم 7. صورة دهن من الإفرازات اللحاء من نبات الأرابيدوبسيس (كلوروفورم المرحلة) باستخدام LC-MS / وضع الأيونات السالبة. الرسوم البيانية في الجزء العلوي (متحولة، A) وأسفل (من النوع البري، B) تظهر الاختلافات في ملامح من المادة الدهنية بين اثنين من المورثات مختلفة (يشار إليه السهام). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method at JoVE.com

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر.

جمع وتحليل<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; اللحاء الإفرازات باستخدام أسلوب EDTA-سهلت

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

24.3K Views.  Michigan State Universtiy.  المعرفة من تكوين اللحاء SAP فضلا عن آلية التحميل والنقل لمسافات طويلة لها أمر ضروري لفهم الإشارات لمسافات طويلة في تطوير المصنع والإجهاد / استجابة الممرض واستيعاب وسائل النقل. يصف هذا المخطوط جمع الإفرازات اللحاء باستخدام طريقة EDTA-يسر. 

Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di(2-ethylhexyl) Phthalate on Metabolite Production

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol aims to introduce general guidelines for the collection of alfalfa root exudates to study the impact of di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) on metabolite production. First, alfalfa seedlings are grown under DEHP stress in a hydroponic culture experiment. Second, the plants are transferred to centrifuge tubes containing 50 mL of sterilized ultrapure water for 6 h to collect root exudates. The solutions are then freeze-dried in a vacuum freeze dryer. The frozen samples are extracted and derivatized with bis(trimethylsilyl)) trifluoroacetamide (BSTFA) reagent. Subsequently, the derivatized extracts are measured using a gas chromatograph system coupled with a time-of-flight mass spectrometer (GC-TOF-MS). The acquired metabolite data are then analyzed based on bioinformatic methods. Differential metabolites and significantly changed metabolism pathways should be deeply explored to reveal the impact of DEHP on alfalfa in view of root exudates.

Collection of Alfalfa Root Exudates to Study the Impact of Di2-ethylhexyl Phthalate on Metabolite Production

The secretion of root exudates is usually an external detoxification strategy for plants under stress conditions. This protocol describes how to assess the impact of xenobiotics on alfalfa via nontargeted metabolomic analysis.

مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض

Root exudates are the main media of information communication and energy transfer between plant roots and the surrounding environment. The change in ...

Environment

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

استراتيجية phosphoproteomic لتوصيف الإشارات الإجهاد التناضح في arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Biochemistry

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

تحليل خلية معينة من<em&gt; ل arabidopsis</em&gt; يترك طريق الإسفار خلية المنشط الفرز

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em&gt; الثقافات تعليق خلية

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق<em&gt; فاصيلوس الشائع</em&gt; كمثال

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

لحاء Sap أخذ العينات من كرنب نابوس 3D-صفحة من البروتين ومجمعات ريبونوكليوبروتين

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

تحليل "سلوك نمو" نبات التمويل في "نوعيات مختلفة من الضوء"

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Stomata Tape-Peel: An Improved Method for Guard Cell Sample Preparation

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is often difficult to isolate and thus studying them often provides a challenge. 
This study establishes a stomatal guard cell enrichment method. The protocol utilizes Scotch tape to isolate guard cells and extract proteins from the cells. This method improves the integrity and yield of guard cell during isolation and provides a reliable sample for the study of cell signaling processes and how they correlate to stomatal movement phenotypes. In this method, the plant leaves were partitioned between two portions of tape and peeled apart to remove the abaxial side. This protocol was applied to Arabidopsis leaf tissue to isolate guard cells. The cells were treated with fluorescein diacetate (FDA) to determine viability and with abscisic acid (ABA) to assess stomata movement in response to ABA. In conclusion, this protocol proves useful for preparing enriched stomatal guard cells and isolating proteins. The quality of the cells and proteins obtained here enable physiological and other biological studies.

This protocol describes a method of preparing enriched stomatal guard cells that is useful for physiological and other biological studies.

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

The study of guard cells is essential to the knowledge of the specific contributions of this cell type to the overall function of plants. However, it is ...

طريقة محسنة لقياس ملامح ترطيب حبوب اللقاح في أرابيدوبسيس ثاليانا

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is established between the interacting partners. Studies across a range of species have revealed that a series of molecular checkpoints regulate the pollen-stigma interaction to ensure that only compatible, generally intraspecific pollen is successful in effecting fertilization. In species that possess a 'dry stigma', such as the model plant Arabidopsis thaliana, the first post-pollination, prezygotic compatibility checkpoint is the establishment of pollen hydration. 
This phase of pollination is tightly regulated, whereby signals from the pollen grain elicit the release of water from the stigma, thus permitting pollen hydration. The ability to accurately measure and track pollen hydration over time is key to the design of experiments directed at understanding the regulation of this critical step in reproduction. Published protocols frequently utilize flowers that have been excised from the parent plant, maintained on liquid or solid media, and bulk pollinated. 
This paper describes a noninvasive, in vivo pollination bioassay that permits minute-by-minute hydration tracking of individual A. thaliana pollen grains at high resolution. The assay is highly reproducible, able to detect very subtle variations of pollen hydration profiles, and thus is suitable for the analysis of mutants that affect pathways regulating pollination. Although the protocol is lengthier than those described for bulk pollinations, the precision and reproducibility it provides, along with its in vivo nature, make it ideal for the detailed dissection of pollination phenotypes.

تسليط الضوء على المؤلف: اختبار حيوي عالي الدقة ، أحادي الحبة ، في الجسم الحي لترطيب حبوب اللقاح لأرابيدوبسيس ثاليانا  

An improved method to measure pollen hydration profiles in Arabidopsis thaliana is described here. The new method offers higher resolution, is noninvasive, and is highly reproducible. The protocol represents a new tool for a finer dissection of the processes that regulate the early stages of pollination.

اختبار حيوي عالي الدقة ، أحادي الحبة ، في الجسم الحي لترطيب حبوب اللقاح لأرابيدوبسيس ثاليانا

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

جمع وتحليل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

مجموعة من إفرازات جذر البرسيم لدراسة تأثير ثنائي (2-إيثيل هكسيل) الفثالات على إنتاج الأيض

استراتيجية phosphoproteomic لتوصيف الإشارات الإجهاد التناضح في arabidopsis

التحقيق في الأنسجة والجهاز محددة الردود فيتوكروم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية بمساعدة خلية من نوع التنميط معينة في التعبير thaliana Arabidopsis

تحليل خلية معينة من

الأيضية وصفها وغشاء التقطير للالمقارن تحليل البروتين من

تقنية تسلل الطرد المركزي لاستخراج Apoplastic السوائل من أوراق النبات عن طريق

لحاء Sap أخذ العينات من كرنب نابوس 3D-صفحة من البروتين ومجمعات ريبونوكليوبروتين

تحليل "سلوك نمو" نبات التمويل في "نوعيات مختلفة من الضوء"

الشريط الثغور-التقشير: طريقة محسنة لإعداد نموذج خلية الحرس

اختبار حيوي عالي الدقة ، أحادي الحبة ، في الجسم الحي لترطيب حبوب اللقاح لأرابيدوبسيس ثاليانا