نود أن نشكر مادس ينسن رادمير على نصيحته العملية والأكاديمية؛ ليندكفيست لاو وكان سفيجستروب لتوفير الخبرة التقنية؛ هيلين Bæk Juel وجوناثان فيلسكوف سيغنه ت. شميت سولفيج Harpøth الأمريكي للمساعدة التقنية؛ الموظفون في العيادة الخارجية "تنويع السل" لتدريبهم في PPD الإدارة؛ وجميع المتطوعين للمشاركة في الدراسة. هذا المشروع ممول من قبل برنامج "أفق 2020" اللجنة الأوروبية [رقم المنحة TBVAC2020 643381]، ونود أن نشكر الشركاء في الائتلاف للمناقشات المثمرة.

جميع الأساليب المذكورة أدناه، بما في ذلك استخدام متطوعين من البشر، أقرتها "اللجنة الدانمركية" في أخلاقيات البحوث الصحية (H-15002988)، والوكالة الدانمركية لحماية البيانات (jr.nr-2015-57-تغ). يجب أن تكون PPD منتج معتمد المعتمدة للاستخدام البشري وتدار داخل الجرعة الصحيحة التي توفرها الشركة المصنعة. أي انحراف في الجرعة أو الإدارة قد تتطلب اعتمادات إضافية الأخلاقية والمتطوعين يجب أن تعطي الموافقة المستنيرة.
1-اختبار الجلد السلين
<ol><li>الحصول على الموافقة المستنيرة الشفوية والخطية من المتطوعين. قبل الحقن، ضمان أن المتطوع تفهم وتقبل الإجراء بما في ذلك الآثار الضارة المحتملة. ملاحظة: هي معايير الاشتمال محددة لهذا البروتوكول سن 18 سنة > وتطعيم ضد السل موثقة. قد تختلف معايير إدراج السؤال البحثي (أي، يمكن أن تكون معياراً إضافيا إدراج أدلة إيجابية تجارة الرقيق عبر الأطلسي).</li>
	<li>استخدام أحد حلول جاهزة من PPD للاستخدام البشري [20 السلين/mL وحدات (تو)]. تطهير الغطاء المطاطي لقنينة استخدام مسحه الكحول.</li>
	<li>إعداد موقع الحقن<ol>
<li>حدد موقع موقع الحقن في الجانب البطني من الساعد المتطوعين.</li>
		<li>ضع الذراع النخيل الهاتفي على سطح عادي واختيار منطقة في ثلث الساعد، حوالي 5-10 سم من الكوع الأعلى. البقاء واضحة من ندوب أو الأوردة، أو تلف الجلد.</li>
		<li>تطهير المنطقة باستخدام مسحه كحولية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إعداد PPD-الحل<ol>
<li>استخدم 1 مل عقيمة حقنه مع ز 27-30/قصيرة (مثلاً، 12 مم) الثابتة الإبرة.</li>
		<li>بلطف المزيج وتطمح 0.1 مل الحل PPD. تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات مرئية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>الأدمة PPD حقن ملاحظة: هذه الخطوة توضح كيفية القيام ترسب PPD واحد، لكن من الممكن عدة إفادات PPD في الذراع نفسه. ومع ذلك، قد يتطلب موافقة أخلاقية محددة.<ol>
<li>تمدد الجلد وأشر الإبرة بزاوية 5-15 درجة مئوية إلى الجلد مع المجسم مشطوف الحواف التي تواجه صعودا.</li>
		<li>إدراج غيض الإبرة في الطبقة الجلدية في الجلد وتأكد من التلميح مرئياً تقريبا عن طريق البشرة.</li>
		<li>ببطء بحقن 0.1 مل من محلول PPD. ملاحظة: إذا كانت تدار بشكل صحيح، سوف تظهر حطاطة بالي من 6-10 مم فورا. حطاطة يختفي بعد حوالي 10 دقيقة.</li>
		<li>عند تقديم إفادات اثنين أو أكثر، وتهدف لفصل الحد أقصى (5-10 سم) لمواقع حقن مع الحفاظ على مسافة جيدة من ناحية الكوع والمعصم. ملاحظة: هذا يمنع التقاء محتملة لاستجابة اختبار الجلد ويسمح تحديد المواقع دون انقطاع من دائرتين شفط.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-تقييم رد فعل الجلد--يوم 3
<ol><li>بعد 48-72 ساعة، ملاحظة حجم رد فعل الجلد. قياس الرص (التورم) و لا الحمامي (الإحمرار) رد فعل.</li>
	<li>جس الثابت تورم استخدام الأصابع وثم وضع علامة حواف الرص استخدام قلم حبر جاف. استخدم مسطرة لقياس القطر متصلبة ولاحظ النتيجة في مم. ملاحظة: قراءة لحجم متصلبة قد دليل اختيار قطر الفوهة للدائرة بالشفط.</li>
</ol>3-شفط التعريفي نفطة-اليوم السابع
<ol><li>تجميع وحدة جهاز الشفط. ملاحظة: وحدات جهاز الشفط مضخات التفريغ مع الدوائر المرفقة لتحريض نفطة شفط. الجهاز المستخدم في هذه التظاهرة مخصص، ولكن وحدات جهاز الشفط أيضا متوفرة تجارياً. المضخة يحتاج إلى قابل للتعديل ضمن النطاق من-20 إلى-40 كيلو باسكال وتوفير ضغط سلبي ثابت وموثوق بها. ينبغي الحصول على الموافقة الأخلاقية الإقليمية قبل إجراء تجارب باستخدام هذا الأسلوب.<ol>
<li>أولاً، إعداد قاعة الشفط عن طريق تجميع لوحة أسفل الفوهة ولوحة نافذة مع الدائرة وخرطوم توصيل. إرفاق خرطوم توصيل دائرة محكم بمضخة فراغ. ملاحظة: ينبغي أن تشمل الدوائر أسفل لوحة مع وجود ثقب لتحريض نفطة، التي ينبغي أن تكون مناسبة للاتصال بجلد الإنسان، ولوحة العلوية مع نافذة، مما يسمح للرصد البصري لنفطه.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تحديد قطر الفوهة الأمثل لصفيحة الفوهة بالنسبة لحجم رد فعل الجلد؛ كلما كبر حجم الفوهة، كلما كبرت الفقاعات.</li>
	<li>تطهير لوحة الفوهة والجلد للمتطوعين باستخدام مسحات الكحول.</li>
	<li>إرفاق الدائرة شفط للجلد.<ol>
<li>تأكد من أن هو يستريح الذراع للمتطوعين بشكل مريح.</li>
		<li>تأكد من أن الثقب الموجود في أسفل لوحة الدائرة شفط يقع على مدى رد فعل PPD حيث يكون وسط رد فعل الجلد مرئياً.</li>
		<li>تأمين قاعة فضفاضة باستخدام الأشرطة: عندما يتم تطبيق الضغط السلبي، الدائرة ستلتزم بالجلد، وتحافظ على موقفها.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تشغيل جهاز الشفط وضبط الضغط للجيش الشعبي الكوري-20.</li>
	<li>وبعد 30 دقيقة، يزداد الضغط السلبي للجيش الشعبي الكوري-25.</li>
	<li>بعد 60 دقيقة، زيادة الضغط السلبي للجيش الشعبي الكوري-30.</li>
	<li>إبقاء الضغط على الجيش الشعبي الكوري-30 حتى يتم تشكيل نفطة تماما. التأكد من وجود الضغوط السلبية المنصوص عليها في هذا البروتوكول الخاصة بأداة مخصصة. قد يكون من الضروري لضبط الضغط قليلاً عند تطبيق البروتوكول في إعدادات أخرى. ملاحظة: المرحلة التعريفي نفطة يتراوح من 60 إلى 180 دقيقة (1-3 ح) مع تشكيل نفطة الفعلية التي تحدث داخل دقيقة 30 الأخيرة بليستيرينج وكثيراً ما يرتبط مع إحساس حكة. قد تحدث البثور بثور دمج مفرد أو متعدد. إذا كان يحدث تمزق نفطة أو نزيف، فإنه ينصح بإنهاء التعريفي نفطة ببطء الإفراج عن الضغط.</li>
	<li>بعد أن يتم تشكيل الفقاعات تماما، الإفراج عن الضغط، وإزالة بعناية الدائرة شفط من الجلد دون تمزيق نفطة.</li>
	<li>تطبيق خلع ملابس ناعمة في منطقة الجلد المحيطة ومكان قبعة الثابت (مثلاً، من أنبوب بلاستيكي 50 مل) أكثر من نفطة.</li>
	<li>تأمين الحد الأقصى مع الشريط الجراحي غير مسبب للحساسية تليها ضمادة بسط ناعمة.</li>
	<li>إرشاد المتطوعين لتجنب إجهاد المادية المفرطة في منطقة نفطة من أجل ح 12-24 القادمة.</li>
</ol>4-حصاد نفطة السائل-يوم 8
<ol><li>في اليومال 8 بلطف إزالة الملابس الواقية وتعقيمها ونفطه برذاذ تطهير الجلد.</li>
	<li>استخدام المحاقن معقمة 2 مل بإبرة ز 23 حصاد محتوى نفطة. أدخل الإبرة في الجانب العلوي/الجانبي من سقف نفطة ونضح السوائل ببطء. تجنب ملامسة أرض التجويف ولكن تأكد من حصاد جميع السائل.</li>
	<li>تطبيق خلع ملابس على نفطة المنهار.</li>
	<li>نقل نفطة السائل إلى أنبوب عقيمة. لاحظ وحدة التخزين.</li>
	<li>زيادة ونقصان السائل نفطة إلى أسفل في 600 x ز استخدام أجهزة الطرد مركزي منضدية لمدة 4 دقائق.</li>
	<li>نقل المادة طافية إلى أنبوب آخر وريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من الخلية المتوسطة. ملاحظة: الخلايا جاهزة الآن للعد وكذلك التحليل. ويمكن تخزين supernatants في-20 إلى-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.</li>
</ol>5-تحليلات لشفط نفطة الخلايا والسوائل
ملاحظة: توفير إرشادات للتحليل الخلايا والسوائل التي تم الحصول عليها من بثور شفط الجلد ليس ضمن نطاق هذا البروتوكول. ومع ذلك، بغية توفير نتائج تمثيلية لهذا التقرير، أجريت وصمة عار داخل الخلايا التدفق الخلوي ومتعدد التحليلات. المنهجية التي توصف بإيجاز أدناه.
<ol><li>التدفق الخلوي<ol>
<li>حفز المعلقات 1 × 105 خلايا جديدة معزولة عن بثور شفط من متطوع تم تطعيمهم BCG مع 10 ميكروغرام/مل من PPD واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2- تشمل الخلايا unstimulated لتفريخ التوازي.</li>
		<li>حفز المعلقات 1 × 106 ببمكس التي تم الحصول عليها من متطوع تم تطعيمهم BCG مع 10 ميكروغرام/مل من PPD واحتضان المخلوط في 37 درجة مئوية و 5% CO2- تشمل الخلايا unstimulated لتفريخ التوازي.</li>
		<li>بعد ح 2، يعامل جميع الخلايا بألف بريفالدين ومونينسين واحتضانها لهم ح 6 عند 37 درجة مئوية.</li>
		<li>وصمة عار في الخلايا مع فريق لايف/قتلى-وصمة عار-BV510 ومكافحة-CD4--AF780 والمضادة-CD3-BV421، المضادة-CD8-بيركب-Cy5.5، مكافحة--CCR7--PE، مكافحة--CD45RA-BV786، المضادة-IFN-γ-AF700، المضادة-تنف-α-PE-Cy7 ومكافحة--إيل-2-فيتك.</li>
		<li>وتشمل الضوابط FMO في لوحة ببمك.</li>
		<li>إجراء تحليل تدفق سيتوميتريك مع سيتوميتير تدفق وتحليل النتائج باستخدام البرمجيات ذات الصلة.</li>
		<li>بوابة على إنتاج سيتوكين CD3 + CD4 + CD8-المجموعات باستخدام استراتيجية النابضة التالية: نوع--> CD3 قابلة للتطبيق +--> CD4 + CD8----> IFN-γ +، تنف-α +، أو إيل-2 +.</li>
		<li>بوابة على السكان خلية ذاكرة المستجيب باستخدام استراتيجية النابضة التالية: نوع--> CD3 قابلة للتطبيق +-> CD4 + CD8----> CCR7-CD45RA-.</li>
		<li>حساب الملامح سيتوكين الفردية باستخدام النابضة منطقية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>سيتوكين الإفراج عن المظاهرات<ol>
<li>لمظاهرة سيتوكين الإفراج في فيفو، استخدم إجراء تحليل متعدد لقياس مستويات إيل-2، IFN-γ، تنف-α، إيل-10، وايل-13 في المذابة نفطة شفط السوائل التي تم الحصول عليها من المتطوعين 4.</li>
		<li>لتظاهرة إفراج سيتوكين الخلايا التي تم الحصول عليها من شفط بثور السابقين فيفو، استخدام الطازجة نفطة شفط الخلايا وببمكس التي تم الحصول عليها من متطوع تطعيم ضد السل.</li>
		<li>تصيب في ببمك وشفط الخلايا نفطة مع الوحدات المكونة للمستعمرة 100 (زيمبابوي) من H37Rv المواضيع المتميزة واحتضانها لهم لمدة 4 أيام.</li>
		<li>استخدام إجراء تحليل متعدد لقياس مستويات إيل-2، IFN-γ، تنف-α، وايل-10، وايل-13 في كل ثقافة سوبيرناتانتس.</li>
		<li>ضبط القياسات أعلاه نطاق حساب المقايسة إلى الحد الأعلى من حساب.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kiistala, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+device+for+separation+of+viable+epidermis+from+dermis.">Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).</li><li>Akbar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+cutaneous+response+to+recall+antigen+in+humans+in+vivo.">Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).</li><li>Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blistering+time+as+a+parameter+for+the+strength+of+dermoepidermal+adhesion:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).</li><li>Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suction+blister+model+reliably+assesses+skin+barrier+restoration+and+immune+response.">A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response.</a> Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).</li><li>Maranda, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+management+of+leukoderma+after+burn:+A+review.">Surgical management of leukoderma after burn: A review.</a> Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).</li><li>Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studiea.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Maini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Human+Neutrophils+Acquired+from+Four+Experimental+Models+of+Inflammation.">A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation.</a> PLoS ONE. 11 (10), (2016).</li><li>Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+blister+immunocytology.+A+new+method+to+quantify+cellular+kinetics+in+vivo.">Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo.</a> Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).</li><li>Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+suction+blistering+in+human+skin+using+optical+coherence+tomography.">Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).</li><li>Belson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+clinical+and+activated+T+cell+response+to+repeat+delayed-type+hypersensitivity+skin+challenges+in+human+subjects,+with+KLH+and+PPD,+as+a+potential+model+to+test+T+cell-targeted+therapies.">Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies.</a> Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+markers+and+correlates+of+protection+for+vaccine+induced+immune+responses.">Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses.</a> Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , (2018).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella+Zoster-Specific+CD4+Foxp3++T+Cells+Accumulate+after+Cutaneous+Antigen+Challenge+in+Humans.">Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans.</a> The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).</li><li>Reed, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+erosion+in+memory+T+cells+induced+by+telomerase+inhibition+at+the+site+of+antigenic+challenge+in+vivo.">Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).</li><li>Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-Needle+Aspiration+Biopsy+of+the+Lymph+Node:+A+Novel+Tool+for+the+Monitoring+of+Immune+Responses+after+Skin+Antigen+Delivery.">Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery.</a> The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).</li><li>Bond, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+infiltrate+the+skin+in+positive+tuberculin+skin+test+indurations.">Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).</li><li>Bell, L. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Molecular+Dissection+of+the+Effects+of+HIV-1+in+Active+Tuberculosis.">In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).</li><li>Tomlinson, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+innate+and+adaptive+human+immune+responses+to+mycobacteria+in+the+tuberculin+skin+test.">Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test.</a> European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).</li><li>Nayak, S., Acharjya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+test+and+its+interpretation.">Mantoux test and its interpretation.</a> Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Menzies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+Repeated+Tuberculin+Tests.">Interpretation of Repeated Tuberculin Tests.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).</li><li>Pitzalis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+migration+of+the+human+helper-inducer+memory+T+cell+subset:+confirmation+by+in+vivo+cellular+kinetic+studies.">Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies.</a> European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).</li><li>Kool, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+fluid+as+potential+body+fluid+for+biomarker+proteins.">Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins.</a> Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).</li><li>Flynn, J. L., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+tuberculosis.">Immunology of tuberculosis.</a> Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).</li><li>Kagina, B. M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+T+cell+frequency+and+cytokine+expression+profile+do+not+correlate+with+protection+against+tuberculosis+after+bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+vaccination+of+newborns.">Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination of newborns.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).</li><li>Garc&#237;a-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+tuberculosis+vaccine+trials+under+financial+constraints.">Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).</li><li>Luabeya, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+the+post-exposure+tuberculosis+vaccine+H56:IC31+in+Mycobacterium+tuberculosis+infected+and+non-infected+healthy+adults.">First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults.</a> Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).</li><li>Tameris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+TB+vaccine,+MVA85A,+induces+highly+durable+Th1+responses.">The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses.</a> PloS One. 9 (2), e87340 (2014).</li><li>Woodworth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+vaccine+H56/CAF01+induces+a+population+of+circulating+CD4+T+cells+that+traffic+into+the+Mycobacterium+tuberculosis-infected+lung.">Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung.</a> Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).</li><li>Gideon, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists,+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization.">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).</li><li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection,+compared+with+an+interferon+&#947;+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test:+a+phase+3,+double-blind,+randomised,+controlled+trial.">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon &#947; release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+Isolation+from+Human+Skin+for+Phenotypic+Analysis+and+Ex+Vivo+Cell+Culture.">Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Koskela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blister+fluid+and+serum+cytokine+levels+in+severe+sepsis+in+humans+reflect+skin+dysfunction.">Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).</li><li>Wada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+skin+blister+fluids+from+children+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease.">Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease.</a> The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).</li><li>Andersson, C., Rajala, T., S&#228;rkk&#228;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+models+for+epidermal+nerve+fiber+data.">Hierarchical models for epidermal nerve fiber data.</a> Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).</li><li>Ramshanker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Prednisolone+on+Serum+and+Tissue+Fluid+IGF-I+Receptor+Activation+and+Post-Receptor+Signaling+in+Humans.">Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).</li><li>Bouma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL20+neutralization+by+a+monoclonal+antibody+in+healthy+subjects+selectively+inhibits+recruitment+of+CCR6++cells+in+an+experimental+suction+blister.">CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

ويصف هذه المخطوطة إجراء عملي لدراسة الذاكرة المناعية البشرية الردود في فيفو، استخدام مستضد الجلدية نذكر وخلية الحصاد بالاستقراء نفطة شفط. تجارة الرقيق عبر الأطلسي كمثال لترسب مستضد الأدمة ونذكر لقاح بي سي جي. وأخيراً، كان مثال لتوصيف العينة SB بتحليل تدفق سيتوكين سيتوميتريك ومتعدد المقدمة، تبين أن حوالي ثلث الخلايا SB كانت محددة مستضد بوليفونكشونال الخلايا التائية من النمط الظاهري الذاكرة المستجيب.
وتشمل الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول تقنية حقن داخل الأدمة واستحثاث نفطة شفط ثقب نفطة. أولاً، يتطلب ترسب الأدمة صحيح الموظفين المدربين. يمكن أن يؤدي ترسب غير صحيحة إلى نتائج دون المستوى الأمثل. PPD عموما مستضد جلدية المعروفة والآمنة، ولكن قد تختلف تركيبته بين المصنعين، يحد من إمكانية المقارنة بين13،20. ويقدم هذا التقرير التعليمات المتعلقة ترسب داخل الأدمة واحد تو 2، وترسبات موازية اختيارياً اثنين (2 × 2 تو)، التي قد تتطلب الموافقة الأخلاقية إضافية. غير أن دراسات أخرى استخدمت تو 10، التي تزيد من احتمال رد فعل الجلد قوية10،21. أثناء الخطوة التعريفي SB، زيادات تدريجية صغيرة في الضغط السلبي سوف يقلل خطر تمزق نزيف ونفطه. وهناك احتمالات التلوث مع خلايا الدم الحمراء أو leucocytes من مجرى الدم منخفضة بصفة عامة2. تقنية ثقب معقمة تمنع التلوث الميكروبي وتجنب الاتصال بين ثقب الإبرة والكلمة نفطة عن طريق الجلد يقلل من الشوائب من الحطام أو خلايا الجلد المقيمين. ومع ذلك، تفضل بعض الباحثين حصاد SB السوائل عن طريق تطبيق ضغط متداول إلى نفطة ثقب10. وقد يكون من الضروري على ثقب سيتا داخل الفقاعات. تقنية SB نفسها مينيملي؛ SBs المنهار تشفي دون ندبات والتهابات نادرة جداً. 2 ولكن قد يحدث قدر من هيبو-تصبغ وربما ينبغي تجنبها SB التعريفي في الناس مع تاريخ من تندب غروانيه.
وتشمل القيود التقنية الخلية إجمالي انخفاض غلة المحاصيل وخيارات محدودة وبالتالي للتخزين على المدى الطويل. وكانت العلاقات بين الغلة leucocyte السريرية TST الردود، وحجم نفطة، والتلوث بكرات الدم الحمراء ووصف دقيق في مكان آخر2،10. في بي سي جي-نذكر التجارب المعروضة هنا (الشكل 1)، كان متوسط العائد الإجمالي من نفطة كل 50,000، مما يعني ضمناً مجموعة تجريبية صغيرة الحجم باستخدام هذه الخلايا، لا سيما إذا كانت SBCs وحدها درس15. ومع ذلك، يتجاوز السكان تي خلية محددة في نموذج SB معظمهم ما هو موجود في عينات ببمك في كلتا الحالتين الخلية النسبي والمطلق. في المثال قدم في الشكل 2، كان عدد الثلاثي-إيجابية PPD المحددة خلايا-تي في عينة خلايا SB 100,000 أكثر من 2 × أكبر من رقم تم العثور عليها في 1 × 106 ببمكس من نفس الجهة المانحة (البيانات لا تظهر). سجل مرئي لرد فعل تجارة الرقيق عبر الأطلسي هو الأسلوب السريرية الأكثر شيوعاً لتقييم الذاكرة السل م . من المذكرة، لا ذروة رد فعل مناعية تكيفية الكامنة في نفس الوقت كرد فعل الجلد السريرية2،21. ليس كل تطعيم ضد السل أو المواضيع المتميزة-سوف تضع الأفراد المعرضين تجارة الرقيق عبر الأطلسي ردود فعل قوية واستراتيجيات للتصنيف، ومناولة العينات من غير تجارة الرقيق عبر الأطلسي المستجيبين، فضلا عن توعية المتفطرات الموجودة مسبقاً في جمهرة الدراسة، يلزم النظر فيها قبل الشروع في محاكمة التذكير باستخدام هذا الأسلوب. أيضا، في كل من بينالي الشارقة أخذ العينات والتسجيل المرئي، هناك احتمال لوجود تحيز نظرية في الأفراد مع الردود انخفاض الجلد نظراً لعالمية أو المتصلة بالجلد ضعف الحصانة كما يتضح، على سبيل المثال، في الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية وبعض الفئات العمرية2، 13،،من1820. وبالإضافة إلى ذلك، تعزيز المناعية لرد فعل تجارة الرقيق عبر الأطلسي مع التجارب المتكررة هو معروف20،22. بيد أن تعمل الخلية SB تظل ثابتة بدلاً من ذلك عندما يتم تستس المتكررة10. وتدعم هذه الملاحظة دور يذكر س. ب في الدراسات الطولية للاستجابات المناعية الخلوية.
للذيفان تي خلية، يسمح نذكر بينالي الشارقة للحصاد للكسور عالية من خلايا محددة مستضد. توقيت بينالي الشارقة لأخذ عينات من PPD شهادة غير حاسمة لتكوين الخلوية والمكرويه سيتوكين تتغير بمرور الوقت. في هذا البروتوكول، بثور كانت المستحث 7 أيام بعد انتهاء التحدي والخلايا المعزولة كانت أساسا المستجيب الذاكرة CD4 + تي الخلايا بما في ذلك الكسور عالية من الخلايا باستخدام تعبير المشارك تنف-α, IFN-γ وايل-2. هذه الملاحظات بما يتفق مع الدراسات السابقة التي تصف كيفية حدوث تي خلية التنشيط وانتشارها، والتمايز في الجلد معبي PPD2،،من1521. دراسات SB الحركية في PPD توعية الأفراد توحي بأن استجابة البشرة المبكر جداً غير محدد؛ بيد فعلا خلال الأيام الأولى التي أعقبت PPD-التحدي، يصبح تهيمن الاستجابة خلايا CD4 + تي الخلايا (كلا تعمل وسط الذاكرة في الذاكرة والمستجيب قد وصف) و، بعد 3 أيام، الرد يهيمن الكسور عالية من سيتوكين PPD الخاصة المنتجة لخلايا CD4 + الخلايا التائية2،،من810،15،21. وتظل هذه الاستجابة التكيفية سيتوكين يمكن كشفها لأكثر من 2 أسابيع2،،من810،23. بوست يوم 7-تجارة الرقيق عبر الأطلسي، على ما يبدو، نقطة الوقت الأكثر الأمثل لجمع سيتوكين إنتاج الخلايا التائية الذاكرة CD4 +2. ومع ذلك، النقاط مرة أخرى بطبيعة الحال، يمكن ذات الصلة اعتماداً على مستضد واستجابة للاهتمام. من المذكرة، في دراسة واحدة، أبلغ PPD الاستجابة التكيفية ذروة قليلاً في وقت سابق مع انخفاض في إفراز سيتوكين برو الملتهبة بالفعل في 5 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي10.
السائل س. ب يحتوي على مستويات عالية من السيتوكينات الموالية التحريضية والبروتينات الأخرى تبين أن الممثل الجلد المكروية15،24. وقد أظهرت الدراسات الحركية أن تنف-α و IFN-γ المستويات في ذروة SB السوائل بعد 3 أيام بينما إيل-2 مستويات الذروة بعد 7 أيام2،10، ربما يعكس هيمنة استجابات التكيف في هذه المرحلة بعد. لأن الخلايا SB قد تم تفعيلها في فيفو، هم يعرضون إطلاق سراح سيتوكين عفوية عالية، فضلا عن احتمال إطلاق سراح محددة عند ريستيموليشن (الشكل 3 و 4).
ويركز هذا التقرير على الحصانة CD4 + تي خلية. كما يتبين في الشكل 2، وكانت غالبية تي-الخلايا المعزولة في الواقع خلايا CD4 +، بينما كانت هناك تقريبا لا CD8 + الخلايا التائية في الشفط نفطة السائل. وهذا ما يتفق مع دراسات أخرى نذكر SB PPD الإبلاغ عن نسب منخفضة وقدرة المهاجرة أقل شأنا من CD8 + تي الخلايا CD4 + "تي" الخلايا2،،من810،23بالمقارنة. وصف مزيد من مساهمة CD8 + سيكون من الأفضل؛ ومع ذلك، هذا خارج نطاق هذا التقرير.
خلايا تي تعتبر أساسية لمراقبة محصنة من المواضيع المتميزة؛ ومع ذلك، كان من الصعب التعرف ربط موثوقة لحماية يتجلى في الاستجابة المناعية التكيفية من25،الدم26. هذا الحاجز شدة يعرقل تطوير لقاحات السل الجديدة، كما أن هناك حاليا أي بديل لفعالية كبيرة ومكلفة للغاية محاكمات27. تحديد مطوري لقاح السل لقاح الاستمناع بتقييم التغييرات الصغيرة وعابر في السكان تي خلية خاصة باللقاح في28،الدم29. ومع ذلك، من المشكوك فيه ما إذا كان جزء صغير من تعميم محددة مستضد خلايا تي في الدم الصلة (أي، قادرة على الانتقال إلى موقع الإصابة والممثل لمراقبة المكروية T الخلية-الغنية المواضيع المتميزة) 27 , 30 , 31 .
استناداً إلى الدراسات السابقة والبيانات المقدمة في هذه الوثيقة، نموذج استدعاء الجلدي SB يمثل بإمكانيات غير مستغلة لدراسة الخلايا التائية الخاصة باللقاحات. ليس فقط تمكين النموذج أذكر منذ عقود اللقاحات الاستجابة التي تم إنشاؤها، كما يسمح تقييم الذاكرة الحقيقية المحتملة في سياق الخاص بالانسجة15،18،،من1921. الرواية، واختبارات الجلد المحددة، التي تشمل المستضدات تتألف أيضا من المرشح فرعية للقاحات السل، تشير إلى فرص جديدة لتقييم اللقاحات باستخدام هذا النموذج28،32. علاوة على ذلك، توحي التحليلات ترانسكريبتوميك أن الخلية – mediated استجابة المناعية المتولدة في الجلد PPD، تحدي مشابه للرد في المواضيع المتميزة-إصابة الرئة18.
بينما خزعات الجلد لكمه أيضا السماح لحصاد خلية من الجلد وتوفير المعلومات المكانية، بالمقارنة مع أخذ العينات بينالي الشارقة، الأسلوب أكثر الغازية ويتطلب المعالجة الانزيمية أو ميكانيكي لإعداد تعليق خلية واحدة33. قياسات علامات السيتوكينات وخلية قابلة للمقارنة بين أسلوبي2،10.
فعلا طبق طريقة الشفط نفطة في العديد من مجالات البحوث الطبية إلى جانب الأمراض الجلدية، أما وحدها أو في تركيبة مع تحدي جلد الجهازية أو المحلية. وتشمل الأمثلة الدراسات الانتان والأمراض المرتبطة بفيروس ابشتاين-بار ليمفاوية، واعتلال الأعصاب السكري، جلوكوكورتيكويد تناول الآثار والتجارب البشرية اختبار الأجسام المضادة العلاجية أو نماذج للعلاجات تي-الخلية المستهدفة10 ،34،35،36،،من3738.
من وجهة نظر علاجية، يقدم الأسلوب نذكر الجلدي SB مزايا فريدة من نوعها لدراسة الذاكرة تي خلية وسط المحتملة ومن كلا بيولوجية والتقنية الجلد من وجهة نظر، ويبدو أن توفير حجرة عينات ذات صلة2، 15،18،،من1921. على وجه الخصوص، بالمقارنة مع أخذ العينات التقليدية السلبية، وتعميم ببمكس، الأسلوب نذكر الجلدي SB يسمح لدراسة الخلايا التائية التي أثبتت قدرة على ترحيل من العقدة الليمفاوية ردا على مستضد ذات الصلة بهم، وإكمال المحلي التوسع والتمايز في الأنسجة على حدة في فيفو سياق15،18،،من1921.
وفي الختام، أظهر النموذج هنا يمكن أن تكون ذات صلة للباحثين داخل ميدان الإنسان مناعة التكيفية وتي خلية استهداف عملاء (أي، في بحوث اللقاحات أو سرطان الأمراض المعدية). تجارة الرقيق عبر الأطلسي النموذج المطبق في هذا البروتوكول، بطبيعة الحال، ذات أهمية خاصة في مجال اللقاحات السل. بيد أن المفهوم الأساسي لهذا النموذج ينطبق عاليا في ميادين أخرى من البحوث.

SB جلد هو نفطة المستحثة اصطناعياً، مما يسمح لحصاد الخلايا والسوائل مباشرة من الجلد. تقنية رفع SBs بفراغ أداة معروفة جيدا في مجال الأمراض الجلدية المستخدمة لدراسة علم المناعة البشرة في الصحة والمرض1،2،3،،من45، 6 , 7 , 8-يوضح هذا التقرير كيف يمكن أن توفر تقنية SB جنبا إلى جنب مع استدعاء مستضدي الجلدية (SB الجلدي استدعاء الأسلوب) رؤى مباشرة في الاستجابات المناعية التكيفية في فيفو.
المبدأ الكامن وراء تحريض SB بسيط: فراغ خفيفة يتم تطبيقها على منطقة صغيرة من الجلد. في نهاية المطاف سيفرض الضغط السلبي على البشرة لفصل من باطن الجلد، إنشاء نفطة محلية مليئة بالسوائل والخلايا2،،من19. يمكن أن تحصد السائل نفطة مطمح إبرة دقيقة ويمكن استخدام المحتوى لمواصلة الدراسة في المختبر.
في السنوات الأخيرة، كان هناك اهتمام متزايد في أسلوب بينالي الشارقة للدراسة في فيفو الاستجابات المناعية عدا أمراض يقتصر على10،الجلد11. دراسة مناعة التكيفية في البشر محدود بحقيقة أن الخلايا والسيتوكينات من الاهتمام هي عينات من الدم المحيطي لأنه قد يكون أخذ عينات الغازية من العقدة الليمفاوية أو الأنسجة المخاطية المعدية المعوية غير مقبول وغير أخلاقي. على سبيل مثال هو دراسة استجابات الذاكرة البشرية المعمرة تي خلية بعد التطعيم12. في مثل هذه المحاكمات، أخذ عينات خلايا تي ذات الصلة يمكن أن يكون تحديا كبيرا، نظراً لأن السكان ذات الصلة للخلايا التي تتوسط الحصانة يتواجد في الأنسجة اللمفاوية، وتعمم إلا عدد محدود جداً من خلايا T معينة في الدم المحيطي.
الأسلوب SB يوفر فرصة فريدة لدراسة الذاكرة خلايا تي وغيرهم من السكان خلية محددة. عقب التطعيم الجلدي من مستضد، محددة خلايا تي للمستضد يعينون من مكامنها اللمفاوية بهم على الجلد ويمكن بسهولة أن عينات من بينالي الشارقة. ووصفت التطبيقات المنهجية والبحوث من هذا الطراز الجلدي نذكر أكبر et al. في2من عام 2013. مستضد استخداماً يتذكر الجلد هو المشتقة المتاحة تجارياً البروتين المنقاة (PPD) للبكتيريا المستخدمة لإجراء اختبار الجلد (TST) السلين13، حيث يتم حقن PPD في طبقة الجلد للجلد. في الأفراد مع ذاكرة مناعية القائمة نحو PPD [مثلاً، الأفراد المصابين بعدوى بكتريا السل (Mtb) أو تطعيم عصيات لقاح السل (BCG) سابقة]، يؤدي ترسب مستضد أذكر استجابة مع الهجرة للجلد و في فيفو الاستنساخ توسيع نطاق خلايا CD4 + تي-PPD الخاصة2،11،،من1415. نتيجة لذلك الكسور عالية من بوليفونكشونال محددة PPD CD4 + T-الخلايا تتراكم في الجلد جاهزة لأخذ العينات س. ب. T-الخلايا التي يتم جمعها بهذه الطريقة قد ثبت أن تكون قوية ووفيرة بما فيه الكفاية تتسم بمجموعة من تحديدكم والمدى الطويل في المختبر ثقافة15. وهكذا، قد يكون النموذج نذكر الجلدي والتعريفي SB وسيلة قيمة لدراسة الاستجابات في فيفو تي خلية السابقين فيفو تحليلات، وزيادة المعرفة بهذا النهج قد يستفيد الباحثون مع مصالح في علم المناعة الخلوية واللقاحات.
يقدم هذا التقرير أول دليل تدريجي عن كيفية حمل جلد الإنسان شفط بثور في الجلد حقن PPD. ويتجلى النموذج نذكر مستضد الجلدية استخدام تجارة الرقيق عبر الأطلسي في تطعيم ضد السل المتطوعين. أخيرا، هو تحليل الصلة السابقين فيفو الخلايا والسيتوكينات تم عزلة بواسطة SB يتجلى. الخصائص الشكلية والفنية لخلايا تي PPD المحددة التي تم الحصول عليها بواسطة الأسلوب SB بدقة في أماكن أخرى ووصف2،،من1011،،من1617، 18 , 19-ويهدف هذا التقرير مناقشة الجوانب العملية والمناعية لمنهجية لتسهيل تطبيق هذا الأسلوب من المجموعات البحثية الأخرى.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

مستضد الجلدي-أذكر النماذج تسمح للدراسات المتعلقة بالذاكرة البشرية الردود فيفو. عندما جنبا إلى جنب مع الجلد التعريفي نفطة الشفط (SB)، يوفر هذا النموذج إمكانية الوصول إلى السكان نادرة محددة مستضد خلايا تي الممثل لاستجابة الذاكرة الخلوية، فضلا عن سيتوكين المكروية في الموقع.
ويصف هذا التقرير الإجراء العملي لأذكر جلدي، تحريض SB، وحصاد من خلايا تي حدة مستضد. لتجسيد الأسلوب، يستخدم الجلد واختبار السلين لنذكر مولده في الأفراد الذين، قبل هذه الدراسة، وخضع لقاح السل تطعيم ضد التهاب مع متفطره. وأخيراً، ترد أمثلة لمتعدد وتدفق سيتوميتريك تحاليل العينات SB، توضح عالية وأجزاء محددة مستضد بوليفونكشونال CD4 + T-الخلايا المتوفرة بهذا الأسلوب أخذ العينات بالمقارنة مع الخلايا المعزولة من الدم.
الأسلوب الموصوفة هنا آمنة وكسبها، ويوفر فرصة فريدة لدراسة كل الاستجابات المناعية الفطرية والتكيف في فيفو، وقد تكون مفيدة لمجتمع واسع من الباحثين العاملين مع الخلية بوساطة الحصانة والإنسان الذاكرة الردود، في سياق تطوير اللقاحات.

ثمانية من المتطوعين البالغين صحية (متوسط العمر: تتراوح من 30 عاماً،: 26-43 سنة) مع تطعيم ضد السل سابقة موثقة (متوسط الوقت من التلقيح ضد السل: 5.5 سنة، تتراوح: 1-30 سنة) أدرجت. المشاركون طعن intradermally مع تو 2 من PPD متبوعاً بتقييم تجارة الرقيق عبر الأطلسي في اليوم 3. SBs المستحث في يوم 7 وتحصد في يوم 8، وأثيرت بثور جميع استخدام الدوائر نفطة شفط مع أقطار الفوهة 10 ملم. سبعة أفراد أعطيت 2 تطعيم PPD منفصلة في نفس الوقت في نفس الذراع تليها 2 الحث SB موازية (يرجى الرجوع إلى المذكرة المتعلقة بإفادات PPD متعددة أدناه الخطوة 1.4 في البروتوكول). في يوم 7 البلازما وعزل ببمكس رسمها الكثافة المتدرجة الطرد المركزي الدم المحيطي. سوبيرناتانتس البلازما والسوائل من SBs كانت مخزنة في-20 درجة مئوية. أحصى الطازجة SB الخلايا (SBCs) باستخدام نيجروسيني وصمة عار والفحص المجهري.
ويعرض السريرية TST الردود والغلة أمانة اتفاقية بازل في الشكل 1. متوسط حجم إيندوريشنز تجارة الرقيق عبر الأطلسي كانت مم 10.25 (النطاق: 0-20 مم) وكان عدد متوسط الخلية الواحدة نفطة 50,000 (النطاق: الخلايا 15,000-210,000، وعدد بثور: 15). اثنين من المتطوعين قد لا توجد استجابة سريرية في أي من تستس 2 وعائد انخفاض مجموع خلية مقابلة من الخلايا 15,000/نفطة. العائد خلية ارتبط يعني الاستجابة السريرية لتجارة الرقيق عبر الأطلسي (سبيرمان 's r = 0.643، ف = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> الشكل 1 : شفط نفطة خلية الغلة. () هذا الفريق يظهر ممثل وآثار الفحص المجهري الملون نيجروسيني الخلايا المعزولة من SBs 7 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي. (ب) هذا الفريق توضح العلاقات بين متصلبة TST يعني (مم) وخلية متوسط العائد (/blisterن) في 8 من متطوعي تطعيم ضد السل (عدد بثور = 15). وتمثل النقاط يعني في القياسات. يرجى ملاحظة أن النقاط 2 هي متداخلة المتطوعين 2 على حد سواء كان الرص TST مم 0 وعائد خلية 15000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
إظهار وصف سيتوميتريك SB التدفق، SBCs تم الحصول عليها من متطوعة عمرها 43 عاماً الذين تم تطعيمهم BCG قبل 30 عاماً وقد لا التعرض المعروفة إلى Mtb. SBCs كانت معزولة بعد الحث نفطة واحدة ( الرص: 1.4 ملم/100,000 SBCs). ويبين الشكل 2 قطع تمثيلية لتلطيخ سيتوكين داخل الخلايا SBCs مقابل ببمكس.
في هذا المتطوع، جزء صغير من CD3 + CD4 + CD8-SBCs زادت من 67% في الخلايا unstimulated > 90% عند PPD في المختبر ريستيموليشن، بينما ثابتاً جزء صغير من CD3 + CD4 + CD8-ببمكس (~ 51%، الشكل 2). ما يزيد على 92 في المائة من في المختبر PPD-فضلا عن unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs، كانت من نوع ذاكرة المستجيب (CCR7-CD45RA-، المعطيات غير معروضة). كسور CD3 + CD4 + CD8-خلايا معينة الناجمين عن طريق تحفيز PPD عموما كانت أعلى في SBCs مقارنة ببمكس (33.1 مقابل. 0.2 ٪، أونستيمولاتيد عينات مطروحاً). في ببمكس، كانت كسور بوليفونكشونال محددة PPD CD3 + CD4 + CD8-خلايا جميع < 0.05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> الشكل 2 : الممثل التدفق الخلوي قطع SBCs مقابل ببمكس- لوحات و ب إظهار كثافة الممثل أونستيمولاتيد المؤامرات للسكان CD8 + و CD4 + في () مقابل. المؤامرات حفزت PPD ببمكس ولوحات (ج) SBCs. ب د بطيئة من سيتوكين داخل الخلايا تلطيخ في حفز PPD CD3 + CD4 + CD8-خلايا (ب) ببمكس و (د) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم-</a>
كما هو متوقع، كانت CD3 + CD4 + CD8-SBCs المنشط في فيفو، يتضح من نسبة عالية من الخلايا تلطيخ السيتوكينات upregulated (12 في المائة)، مع السيتوكينات الغالبة التي تنف-α و IFN-γ. بيد على PPD-التحفيز، تحولت سيتوكين إفراز الخلايا نحو الثلاثي-أو مزدوجة-إيجابي IFN-γ + تنف-α + إيل-2 + (17 في المائة) و IFN-γ + تنف-α + (15 ٪) الشخصية (الشكل 3b، الملامح ببمك من الجهة المانحة نفسها مدرجة للمقارنة في الشكل 3a). ملامح التعبير سيتوكين لحفز PPD المستجيب الذاكرة CD4 + تي خلية فرعية (CD3 + CD4 + CD8-CCR7-CD45RA-) كانت مماثلة ل CD3 + CD4 + CD8-السكان في الأرقام 2 و 3 (البيانات لا تظهر).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> الشكل 3: مواصفات سيتوكين SBCs حفز خلايا CD4 + PPD وأونستيمولاتيد مقابل ببمكس-  هذه اللوحات إظهار الملامح الفردية لإنتاج سيتوكين () CD3 + CD4 + CD8-ببمكس الخلايا و (ب) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. الأشرطة تمثل كسور ملامح محددة مستضد سيتوكين في الخلايا أونستيمولاتيد (أشرطة بيضاء) وعند تحفيز في المختبر مع PPD (أشرطة ملونة).
لاستكشاف السائل SB كمصدر للمعلومات عن المكروية سيتوكين في موقع اختبار الجلد، قيست مستويات سيتوكين في السائل المقطوع من SBs المستحث 7 أيام بوست-تجارة الرقيق عبر الأطلسي (الشكل 4 أ). كان متوسط مستويات تنف-α, IFN-γ وايل-2 339 بيكوغرام/مل و 19 بيكوغرام/مل و 1 بيكوغرام/مل، على التوالي (n = 6). وكانت مستويات البلازما منخفضة جداً بصفة عامة. إنتاج خلايا معزولة من SBs مستويات عالية من السيتوكينات الالتهابية للمحترفين السابقين فيفو (الشكل 4 باء). كانت مثقف المعايرة SBCs من متطوع لمدة 4 أيام حضور ضراوة السل م ± ببمكس الذاتي. وكانت مستويات IFN-γ > 30-fold أعلى في الثقافات التي تتضمن SBCs، بغض النظر عن وجود ببمكس.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> الشكل 4 : مستويات سيتوكين في بينالي الشارقة السائل، والبلازما، و المواضيع المتميزة --إصابة supernatants ثقافة. () هذا الفريق يبين مستويات سيتوكين في supernatants SB السوائل والبلازما من 6 متطوعين تطعيم ضد السل. الأشرطة تمثل مستويات سيتوكين الوسيط؛ أشرطة الخطأ تمثل النطاق. (ب) هذا الفريق يبين مستويات سيتوكين في supernatants من 4 موازية 600 ميليلتر السابقين فيفو 4 أيام ثقافات 1 × 106 ببمكس (أشرطة سوداء)، 1.75 × 105 SBCs (أشرطة بيضاء)، و 1 × 106 ببمكس ارتفعت مع 0.5 أو 1.75 x 10 5 SBCs (القضبان الرمادية) مصاب المواضيع المتميزة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

هنا، نحن نقدم تظاهرة نموذج استدعاء الجلدي نفطة شفط. النموذج يسمح وصول بسيطة لدراسة الإنسان في فيفو الاستجابات المناعية التكيفية، على سبيل المثال في سياق تطوير اللقاحات.

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

a-suction-blister-protocol-to-study-human-t-cell-recall-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

11.9K Views.  Statens Serum Institut. هنا، نحن نقدم تظاهرة نموذج استدعاء الجلدي نفطة شفط. النموذج يسمح وصول بسيطة لدراسة الإنسان في فيفو الاستجابات المناعية التكيفية، على سبيل المثال في سياق تطوير اللقاحات.

Video: A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; مراقبة الخلايا T باستخدام نموذج MHC المطابقة الفئران

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي<em&gt; في الجسم الحي</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1-/-

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

محسن انترفيرون-غاما السبت المقايسة لاستجابات الخلية تي التدبير في نموذج خنزير غينيا بعد التطعيم

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

بروتوكول نفطة شفط لدراسة الخلية تي البشرية استدعاء الاستجابات في فيفو

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

تحريض الطعم ضد المضيف المرض و

على

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

استخدام المصابيح الفلورية الهدف صالحة لتقييم T الردود الخليوي

زرع الجلد الذيل لدراسة خيفي CD4 T الردود الخليوي في الفئران

الثقافات المشيمة وساقطي الجهاز الإنسان لدراسة العدوى في واجهة الأم والجنين

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

تقييم الاستجابات الخاصة بفيروس زيكا تي خلية في أجهزة إيمونوبريفيليجيد من الفئران المصابة Ifnar1^-/-

محسن انترفيرون-غاما السبت المقايسة لاستجابات الخلية تي التدبير في نموذج خنزير غينيا بعد التطعيم