Gostaríamos de agradecer a Mads Radmer Jensen por seus conselhos práticos e acadêmicos; Lau Lindqvist e Kaare Svejstrup para fornecer conhecimentos técnicos; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt e Solveig W. Harpøth para sua assistência técnica; os funcionários do ambulatório de Gentofte TB para sua formação em administração de PPD; e todos os voluntários para participar no estudo. Este projeto é financiado pelo programa Europeu Comissão H2020 [número de concessão TBVAC2020 643381], e nós gostaríamos de agradecer os parceiros do consórcio para os debates frutíferos.

Todos os métodos descritos abaixo, incluindo o uso de voluntários humanos, foram aprovados pelo Comité Dinamarquês saúde ética em pesquisa (H-15002988) e a agência de protecção de dados dinamarquês (jr.nr. 0102-2015-57). PPD deve ser um produto certificado aprovado para uso humano e administrado dentro a dosagem correcta fornecida pelo fabricante. Qualquer desvio na dosagem ou administração pode exigir aprovações éticas adicionais e voluntários devem dar o consentimento informado.
1. pele de tuberculina
<ol><li>Obter consentimento oral e escrito do voluntário. Antes da injeção, certifique-se de que o voluntário entende e aceita o procedimento, incluindo os efeitos adversos possíveis. Nota: Os critérios de inclusão específicos para este protocolo são idade > 18 anos e a vacinação de BCG documentada. Critérios de inclusão podem variar consoante a pergunta de pesquisa (ou seja, um critério de inclusão adicionais pode ser uma prova do TST positiva).</li>
	<li>Use uma solução pronta de PPD para uso humano [20 tuberculina unidades (TU) /mL]. Desinfecte a tampa de borracha do frasco com um algodão embebido em álcool.</li>
	<li>Preparar o local de injeção<ol>
<li>Localize o local da injeção no lado ventral do antebraço do voluntário.</li>
		<li>Coloque o braço palm-up sobre uma superfície lisa e escolha uma área no terço superior do antebraço, cerca de 5 a 10 cm da articulação do cotovelo. Afaste-se das cicatrizes, veias ou pele danificada.</li>
		<li>Desinfete a área usando um cotonete alcoólico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a solução-PPD<ol>
<li>Use uma seringa 1 mL estéril com 27-30G/short (por exemplo, 12 mm) fixada a agulha.</li>
		<li>Delicadamente, misture e aspire 0,1 mL da solução de PPD. Certifique-se de que não há nenhuma bolha visível.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injeção intradérmica de PPD Nota: Este passo descreve como executar um único depoimento de PPD, mas vários depoimentos de PPD no mesmo braço é possível. No entanto, isso pode exigir aprovação ética específica.<ol>
<li>Estique a pele e aponte a agulha em um ângulo de 5-15° para a pele com o bisel voltado para cima.</li>
		<li>Insira a ponta da agulha na camada dérmica da pele e verifique se que a ponta está quase visível através da epiderme.</li>
		<li>Injecte lentamente 0,1 mL da solução PPD. Nota: Se administrado corretamente, uma pápula pálida de 6-10 mm aparecerá imediatamente. A pápula desaparece após cerca de 10 min.</li>
		<li>Ao fazer dois ou mais depoimentos, aponta para uma separação máxima (5-10 cm) dos sites de injeção, mantendo-se em uma boa distância da área de cotovelo e pulso. Nota: Isto evita que um potencial confluência da resposta teste de pele e permite o posicionamento ininterrupto de duas câmaras de sucção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. avaliação da reação da pele - dia 3
<ol><li>Após 48-72 h, observe o tamanho da reação da pele. Medir o endurecimento (inchaço) e não a Eritema (vermelhidão) da reação.</li>
	<li>Palpar o difícil inchaço usando os dedos e, em seguida, marque as bordas da induração usando uma caneta esferográfica. Use uma régua para medir o diâmetro de induração e observe o resultado em mm. Nota: Uma leitura do tamanho da induração pode orientar a escolha do diâmetro do orifício para a câmara de sucção.</li>
</ol>3. aspiração Blister indução - dia 7
<ol><li>Monte a unidade de dispositivo de sucção. Nota: As unidades de dispositivo de sucção são bombas de vácuo com câmaras anexadas para indução de sucção da bolha. O dispositivo utilizado nesta demonstração é feito, mas unidades de dispositivo de sucção também estão disponíveis comercialmente. A bomba deve ser ajustável dentro do intervalo de -20 a-40 kPa e fornecer uma pressão negativa constante e de confiança. Aprovação ética regional deve ser obtida antes da experimentação usando esse método.<ol>
<li>Primeiro, prepare a câmara de sucção, montar a placa de orifício inferior e a placa de janela com a câmara e a mangueira de conexão. Fixe a mangueira de conexão de câmara firmemente para a bomba de vácuo. Nota: As câmaras devem incluir uma placa inferior com um buraco para a indução da bolha, que deve ser apropriado para o contato com a pele humana, e uma placa superior com uma janela, que permite o acompanhamento visual da bolha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determine o diâmetro do orifício ideal da placa de orifício em relação ao tamanho da reação da pele; Quanto maior o tamanho do orifício, quanto maior a bolha.</li>
	<li>Desinfectar a pele do voluntário e a placa de orifício usando cotonetes de álcool.</li>
	<li>Anexe a câmara de sucção da pele.<ol>
<li>Certifique-se de que o braço do voluntário está descansando confortavelmente.</li>
		<li>Certifique-se que o orifício na placa inferior da câmara de sucção está situado sobre a reação de PPD, para que o centro da reação da pele é visível.</li>
		<li>Fixar a câmara vagamente usando cintas: quando a pressão negativa é aplicada, a câmara irá aderir à pele e manter a sua posição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligue o dispositivo de sucção e ajustar a pressão a-20 kPa.</li>
	<li>Após 30 min, aumente a pressão negativa de-25 kPa.</li>
	<li>Depois de 60 min, aumente ainda mais a pressão negativa a-30 kPa.</li>
	<li>Manter a pressão a-30 kPa até uma bolha totalmente formada. Certifique-se de que as pressões negativas previstas no presente protocolo são específicas para um instrumento personalizado. Pode ser necessário ajustar a pressão ligeiramente ao aplicar o protocolo em outras configurações. Nota: A fase de indução da bolha varia de 60 a 180 min (1-3 h) com a formação de bolha real ocorrendo dentro de 30 min. o último que empolar está frequentemente associada uma sensação de coceira. As bolhas podem ocorrer como única ou múltiplas bolhas se fundem. Se a ruptura da bolha ou hemorragia ocorre, é aconselhável terminar a indução da bolha, lentamente, liberando a pressão.</li>
	<li>Depois que a bolha totalmente formada, liberar a pressão e remover cuidadosamente a câmara de sucção da pele sem romper a bolha.</li>
	<li>Aplique um curativo macio na área de pele circundante e coloque uma tampa dura (por exemplo, de um tubo de plástico de 50 mL) sobre a bolha.</li>
	<li>Fixe a tampa com fita cirúrgica anti-alérgicos, seguida de um curativo macio e elástico.</li>
	<li>Instrua o voluntário para evitar excessiva tensão física na área da bolha para o próximo 12-24 h.</li>
</ol>4. colheita de líquido da bolha - dia 8
<ol><li>No dia 8th , delicadamente Retire o curativo protetor e desinfectar o blister com spray de desinfecção da pele.</li>
	<li>Use uma seringa estéril de 2 mL com agulha 23G para colher o conteúdo da bolha. Insira a agulha no lado superior/lateral do telhado da bolha e Aspire lentamente o líquido. Evite tocar o assoalho da cavidade, mas certifique-se de colher todo o fluido.</li>
	<li>Aplique um curativo sobre a colapso da bolha.</li>
	<li>Transfira o líquido da bolha para um tubo estéril. Anote o volume.</li>
	<li>Gire o líquido da bolha para baixo a 600 x g, utilizando uma centrífuga de mesa para 4 min.</li>
	<li>Transferir o sobrenadante para outro tubo e ressuspender as células em 500 µ l do meio celular. Nota: As células agora estão prontas para contar e ainda mais análise. Sobrenadantes podem ser armazenados em -20 a-80 ° C até o uso.</li>
</ol>5. as análises de sucção da bolha, células e fluidos
Nota: Fornecer instruções para a análise de células e fluidos obtidos de sucção bolhas na pele não é no âmbito do presente protocolo. No entanto, a fim de proporcionar resultados representativos para este relatório, mancha intracelular fluxo cytometry e multiplex análises foram realizadas. A metodologia é descrita em breve abaixo.
<ol><li>Citometria de fluxo<ol>
<li>Estimular as suspensões de 1 x 105 células frescas isoladas de sucção bolhas de 1 voluntário BCG-vacinados com 10 µ g/mL de PPD e incube as celulas a 37 ° C e 5% CO2. Inclua células unstimulated para uma incubação paralela.</li>
		<li>Estimular as suspensões 1 x 106 PBMCs obtidos de 1 voluntário BCG-vacinados com 10 µ g/mL de PPD e incubar a mistura a 37 ° C e 5% CO2. Inclua células unstimulated para uma incubação paralela.</li>
		<li>Após 2 h, tratar todas as células com Brefaldin A e monensina e incube-os durante 6 h a 37° C.</li>
		<li>Manche as células com um painel de Live/mortos-mancha-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 e anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Incluem FMO controles no painel PBMC.</li>
		<li>Realizar uma análise do fluxo cytometric com um citômetro de fluxo e analisar os resultados usando software relevante.</li>
		<li>Portal sobre produção de citocina CD3 + CD4 + CD8-subconjuntos usando a seguinte estratégia associada: camisolas - > viável CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + ou IL-2 +.</li>
		<li>Portão em populações de células efetoras memória usando a seguinte estratégia associada: camisolas - > viável CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Calcule os perfis cytokine individuais usando gating booleano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manifestações de liberação de citocinas<ol>
<li>Para uma demonstração de uma citocina lançamento na vivo, use uma multiplex análise para quantificar os níveis de Il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 no fluido descongeladas bolha sucção obtido de 4 voluntários.</li>
		<li>Para uma demonstração de uma liberação de citocinas por células obtidas de sucção bolhas ex vivo, uso fresco da bolha sucção células e PBMCs obtidos de 1 voluntário BCG-vacinados.</li>
		<li>Infectar o PBMC e sucção da bolha células com 100 unidades de formadoras de Colônia (UFC) de Mtb H37Rv e incube-os por 4 dias.</li>
		<li>Usar uma análise multiplex para quantificar os níveis de Il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 em todos os sobrenadantes de cultura.</li>
		<li>Ajuste as medições acima da faixa de cálculo do ensaio para o limite superior de cálculo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Este manuscrito descreve um procedimento prático para o estudo da memória humana imune respostas na vivo, usando a colheita de recordação e a célula antígeno cutâneo por indução de sucção da bolha. TST foi usado como um exemplo de deposição de antígeno intradérmico e BCG-vacina recall. Finalmente, um exemplo de caracterização de espécime SB por análise de fluxo cytometric e multiplex citocina foi fornecido, demonstrando que aproximadamente um terço das células SB foram antígeno-específicas polifuncionais T-células do fenótipo memória efetoras.
Os passos críticos do presente protocolo incluem a técnica de injeção intradérmica, a indução de sucção da bolha e a punção da bolha. Em primeiro lugar, uma correcta deposição intradérmica exige pessoal treinado. Uma deposição incorreta pode levar a resultados subótimos. PPD é geralmente um antígeno cutâneo seguro e bem conhecido, mas sua composição pode variar entre fabricantes, limitando a sua comparabilidade13,20. Este relatório fornece instruções para um único depoimento intradérmico de 2 TU e opcionalmente dois depoimentos paralelos (2 x 2 TU), que podem exigir a aprovação ética adicional. No entanto, outros estudos têm usado 10 TU, que aumentam a probabilidade de uma reação de pele forte10,21. Durante o passo de indução de SB, pequenos aumentos gradual na pressão negativa irão reduzir o risco de hemorragia e bolha de ruptura. As chances de contaminação com células vermelhas do sangue ou leucócitos do sangue são geralmente baixa2. A técnica de punção asséptica impede a contaminação microbiana e evitando o contato entre a agulha de punção e o chão da bolha cutâneo reduz impurezas de detritos ou residente da pele células. No entanto, alguns pesquisadores preferem colher líquido SB aplicando uma pressão de rolamento para a bolha perfurado10. Pode ser necessário perfurar os septos dentro da bolha. A técnica de SB em si é minimamente invasiva; SBs recolhidos curam sem deixar cicatrizes e infecções são muito raras. 2 no entanto, pode ocorrer algum grau de hipo-pigmentação e indução de SB provavelmente deve ser evitada em pessoas com antecedentes de cicatrizes coloidais.
Limitações técnicas incluem célula total baixo rendimento e, consequentemente, poucas opções para armazenamento a longo prazo. Relações entre o rendimento de leucócito, respostas clínicas do TST, o tamanho da bolha e contaminação de eritrócitos tem sido exaustivamente descrito em outra parte2,10. Nas BCG-recordar experiências aqui apresentadas (Figura 1), o rendimento total médio de cada bolha era 50.000, implicando uma montagem experimental em pequena escala usando essas células, especialmente se SBCs são estudados só15. No entanto, a população de células T específica em uma amostra de SB principalmente excede o que é encontrado em amostras PBMC em ambas as contagens de célula relativa e absoluta. No exemplo apresentado na Figura 2, o número de triplo-positivos específicos PPD-células T em uma amostra de 100.000 células SB foram mais de 2 x maior que o número encontrado em 1 x 106 PBMCs do mesmo doador (dados não mostrados). Uma pontuação de visual da reação TST é o método clínico mais comum para a avaliação da memória de M. tuberculosis . Digno de nota, a reação imunológica adaptativa subjacente não pico ao mesmo tempo como a reação de pele clínica2,21. Não tudo BCG-vacinados ou Mtb-indivíduos expostos irão desenvolver fortes reações do TST e estratégias para a classificação e a manipulação das amostras dos TST não-respondedores, bem como uma sensibilização micobacteriana preexistente na população estudada, precisam ser considerados antes de iniciar um julgamento de recordação usando esse método. Também, em amostragem de SB e marcando visual, existe um potencial para um viés teórico em indivíduos com respostas de pele reduzida devido a global ou relacionados com pele prejudicada a imunidade, como visto, por exemplo, na infecção pelo HIV e certos grupos etários2, 13,18,20. Além disso, um reforço imunológicos da reação TST com testes repetidos é conhecidos20,22. No entanto, os fenótipos de célula SB permanecem bastante constantes quando TSTs são repetidas10. Esta observação apoia o papel de recordação do SB em estudos longitudinais de respostas imunes de celular.
Para imunologistas de células T, recordação do SB permite a colheita de altas frações de células antígeno-específicas. No entanto, o tempo do SB para uma amostragem de um depósito de PPD é crítico, tanto a composição celular e o microambiente cytokine mudar ao longo do tempo. Neste protocolo, bolhas eram induzido 7 dias pós-desafio e as células isoladas principalmente CD4 + efetoras memória T-células incluindo frações elevadas de células com uma expressão de IFN-γ e TNF-α IL-2 de co. Estas observações estão de acordo com estudos anteriores descrevendo como células T ativação, proliferação e diferenciação ocorre na pele PPD-aprontadas2,15,21. Os estudos cinéticos SB em indivíduos PPD-sensibilizadas sugerem que a resposta inicial de pele inespecífica; no entanto, já nos primeiros dias após o PPD-desafio, a resposta torna-se dominado por células CD4 + T-(ambos os fenótipos de memória de memória e efetoras centrais foram descritos) e, depois de 3 dias, a resposta é dominada por altas frações de PPD-específicas do cytokine produzindo células T CD4 +2,8,10,15,21. Esta resposta adaptativa cytokine permanece detectável por mais de 2 semanas2,8,10,23. Post do dia 7-TST parece ser o ponto de tempo mais ideal para a coleção do cytokine produzindo memória CD4 + células T2. No entanto, outros pontos de tempo podem, naturalmente, ser relevantes dependendo do antígeno e a resposta de interesse. De notar, em um estudo, a resposta adaptativa de PPD tem sido relatada até o máximo, um pouco mais cedo, com uma diminuição da secreção de citocinas pró-inflamatórias já em 5 dias post-TST10.
Fluido de SB contém níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias e de outras proteínas mostradas para ser representante do microambiente pele15,24. Estudos de cinética mostraram que TNF-α e IFN-γ níveis no fluido pico SB depois de 3 dias ao pico de níveis de IL-2 após 7 dias2,10, provavelmente refletindo a predominância de respostas adaptáveis nesta fase posterior. Porque as células SB foram registrados na vivo, eles exibem uma liberação de citocinas espontânea elevada, bem como um potencial para uma versão específica sobre restimulation (Figura 3 e 4).
Este relatório concentra-se na imunidade de células T CD4 +. Como demonstrado na Figura 2, a maioria das células-T isoladas foram de fato CD4 +, enquanto não havia quase nenhum CD8 + células T na sucção da bolha fluido. Isto está em consonância com outros estudos de PPD SB-Lembre-se, relatando proporções baixas e uma inferior capacidade migratória de CD8 + células T em comparação com as células T CD4 +2,8,10,de23. Uma caracterização mais da contribuição CD8 + seria preferível; no entanto, isso está além do escopo deste relatório.
As células T são consideradas essenciais para o controle imune de Mtb; no entanto, tem sido difícil identificar uma correlação confiável da proteção refletida na resposta imune adaptativa de sangue25,26. Neste bloqueio severamente dificulta o desenvolvimento de novas vacinas de TB, como não há atualmente nenhuma alternativa aos ensaios de eficácia de grande e muito dispendiosa27. Os desenvolvedores de vacina TB determinam imunogenicidade da vacina avaliando transitórias e pequenas mudanças nas populações de células T vacina específica no sangue28,29. No entanto, é questionável se a pequena fração de células T antígeno-específicos encontradas no sangue em circulação é relevante (ou seja, capaz de migrar para o local de uma infecção e representante de controlar o microambiente de T-celular-ricos Mtb) 27 , 30 , 31 .
Baseado em estudos anteriores e os dados aqui apresentados, o modelo de recuperação cutânea SB representa um potencial inexplorado para o estudo de células-T de vacina específica. Não só o modelo permite um recall de uma vacina resposta gerada décadas, também permite a avaliação da memória verdadeira potencial em um contexto de tecido-específica15,18,19,21. Romance, testes específicos da pele, que inclui antígenos também compostos de vacinas de TB de subunidade de candidato, sugerir novas oportunidades para avaliação de vacina usando este modelo28,32. Além disso, transcriptomic análises sugerem que uma célula – mediada por resposta imune gerada em pele PPD-desafiado é semelhante à resposta encontrada no Mtb-infectados pulmão18.
Enquanto biópsias de pele soco também permitem uma colheita de células da pele e fornecem informações espaciais, em comparação com amostragem de SB, o método é mais invasivo e requer processamento mecânico ou enzimático para preparar suspensões de célula única33. Medições de marcadores citocinas e células são comparáveis entre os dois métodos de2,10.
O método de sucção da bolha já foi aplicado em muitas áreas de pesquisa médica, além de Dermatologia, sozinho ou em combinação com um desafio de pele local ou sistêmica. Exemplos incluem estudos de sepse, doença linfoproliferativa associada a vírus de Epstein - Barr, neuropatia diabética, efeitos de ingestão de glicocorticoide e testes em humanos teste de anticorpos terapêuticos ou modelos para terapias T-célula-alvo10 ,34,35,36,37,38.
Do ponto de vista terapêutico, o método de recuperação cutânea SB oferece vantagens exclusivas para estudar a memória central de células T potencial e -de ambos um biológico e técnica do ponto de vista, a pele parece oferecer uma amostragem relevante do compartimento2, 15,18,19,21. Em particular, comparado a amostragem tradicional, passiva circulantes de PBMC, o método de recuperação cutânea SB permite o estudo de células-T que provaram que a capacidade de migrar a partir do nó de linfa em resposta ao seu antígeno relevante e completar o local expansão e diferenciação em um tecido-específica no vivo contexto15,18,19,21.
Em conclusão, o modelo demonstrou que aqui pode ser relevante para os investigadores no campo da imunidade adaptativa humana e agentes de direcionamento de células T (ou seja, na investigação de doenças infecciosas Vacinologia ou câncer). O modelo TST aplicado neste protocolo é, naturalmente, de especial relevância no campo da Vacinologia TB. No entanto, o conceito básico deste modelo é altamente aplicável em outros campos de pesquisa.

Um pele SB é uma bolha induzida artificialmente, o que permite a colheita de células e fluido diretamente da pele. A técnica de criar SBs por vácuo é uma ferramenta bem conhecida no campo da dermatologia, usado para o estudo da Imunologia da pele na saúde e na doença,1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. este relatório demonstra como a técnica de SB combinada com recuperação antigênica cutânea (método de recuperação cutânea SB) pode fornecer insights diretos em respostas imunes adaptáveis em vivo.
O princípio por trás da indução de SB é simples: uma ligeira depressão é aplicado a uma pequena área da pele. A pressão negativa eventualmente forçará a epiderme para separar da derme, criando uma bolha local preenchida com líquido e células de2,1,9. O líquido da bolha pode ser colhido por uma punção aspirativa por agulha fina e o conteúdo pode ser usado para mais estudo em vitro.
Nos últimos anos, tem havido um crescente interesse no método para o estudo na vivo respostas imunes diferentes doenças restringidas a pele10,11SB. O estudo da imunidade adaptativa em humanos é limitado pelo fato de que as células e citocinas de interesse são amostradas de sangue periférico, porque uma amostragem invasiva do linfonodo ou do tecido da mucosa gastrointestinal pode ser antiético e inaceitável. Um exemplo é o estudo da memória humana long-lived células T respostas após vacinação12. Em tais ensaios, a amostragem de células-T relevantes pode ser um grande desafio, porque a população relevante de células que medeiam a imunidade reside no tecido linfoide, e apenas um número muito limitado de células T específicas circula no sangue periférico.
A técnica de SB oferece uma oportunidade única para o estudo de células T de memória e outras populações de células específicas. Após a inoculação cutânea do antígeno, células T específicas para o antígeno são recrutados de seus esconderijos linfoides na pele e pode facilmente ser amostrados de SB. Os aplicativos de pesquisa e metodologia deste modelo de recuperação cutânea foram descritos por Akbar et al em 2013,2. Um antígeno comumente usado para retirada de pele é o derivado de proteína purificada comercialmente disponíveis (PPD) de micobactérias usadas para executar um teste cutâneo (TST) de tuberculina13, onde o PPD é injetado na camada dérmica da pele. Em indivíduos com uma memória imunológica existente para PPD [por exemplo, indivíduos com uma infecção de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ou uma vacinação prévia de Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], a deposição de antígeno resulta em um Lembre-se resposta com a migração para a pele e na vivo expansão clonal de células T CD4 + PPD específico2,11,14,15. Como resultado, altas frações de PPD específico polifuncionais células T CD4 + se acumulam na pele pronta para amostragem de SB. T-células coletadas por esse método provaram para ser robusto e são suficientemente abundantes para ser caracterizada por uma variedade de imunoensaios e por um longo prazo na vitro cultura15. Assim, o modelo de recuperação cutânea e a indução de SB podem provar um valioso método para estudar na vivo células T respostas por análises ex vivo , e aumento do conhecimento desta abordagem pode beneficiar pesquisadores com interesses em imunologia celular e Vacinologia.
Este relatório fornece o primeiro guia passo a passo sobre como induzir bolhas sucção na pele humana em pele PPD-injetado. O modelo de recuperação de antígeno cutâneo é demonstrado usando o TST em voluntários vacinados BCG. Finalmente, a análise relevante ex vivo das células e citocinas isoladas por SB é exemplificado. Características fenotípica e funcionais de células T específicas PPD obtidas pelo método de SB são minuciosamente descrito em outra parte2,10,11,16,17, 18 , 19. este relatório visa discutir os aspectos práticos e imunológicos da metodologia para facilitar a aplicação desta técnica por outros grupos de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Recolhimento do antígeno cutâneo modelos permite para estudos da memória humana respostas em vivo. Quando combinado com indução de sucção da bolha (SB) de pele, este modelo oferece acessibilidade às populações raras do representante de células T antígeno-específicas de resposta a memória celular, bem como o cytokine microambiente em situ.
Este relatório descreve o procedimento prático de um recall cutâneo, uma indução de SB e uma colheita de células T antígeno-específicas. Para exemplificar o método, o teste cutâneo de sensibilidade é usado para recuperação antigênica em indivíduos que, antes deste estudo, foi submetido a uma vacinação de Bacillus Calmette-Guérin contra uma infecção com Mycobacterium tuberculosis. Finalmente, são fornecidos exemplos de multiplex e fluxo cytometric análises de amostras de SB, ilustrando a altas frações de antígeno-específicas polifuncionais células CD4 + T disponíveis por este método de amostragem em comparação com células isoladas do sangue.
O método descrito aqui é seguro e minimamente invasiva, oferece uma oportunidade única de estudar ambas as respostas de imune inata e adaptativa na vivoe pode ser benéfico para uma ampla comunidade de pesquisadores que trabalham com humanos e imunidade mediada por células respostas de memória, no contexto do desenvolvimento de vacinas.

Oito voluntários adultos saudáveis (idade mediana: variam de 30 anos,: 26-43 anos) com uma vacinação de BCG anterior documentada (tempo médio de vacinação BCG: faixa de 5,5 anos,: 1-30 anos) foram incluídos. Os participantes foram desafiados por via intradérmica com 2 TU de PPD, seguido por uma avaliação do TST no dia 3. SBs foram induzidas no dia 7 e colhidas no dia 8, e todas as bolhas foram levantadas usando câmaras de sucção da bolha com diâmetros de orifício de 10 mm. Sete indivíduos receberam 2 inoculações de PPD separadas simultaneamente no mesmo braço seguido por 2 induções paralelas de SB (consulte a nota sobre vários depoimentos de PPD passo 1.4 no protocoloa seguir). Sangue periférico foi desenhado no dia 7 para o plasma e um isolamento de PBMC por centrifugação gradiente de densidade. Sobrenadantes de plasma e fluido do SBs foram armazenadas a-20 ° C. As pilhas novas SB (SBCs) foram contadas usando microscopia e mancha de nigrosine.
As respostas clínicas do TST e rendimento SBC são apresentadas na Figura 1. O tamanho médio da indurações TST foi 10,25 mm (intervalo: 0 - 20 mm) e o número de célula mediana por bolha era 50.000 (intervalo: 15.000-210.000 células, o número de bolhas: 15). Dois dos voluntários não tinham nenhuma resposta clínica em algum dos 2 TSTs e um correspondente rendimento baixo célula total de 15.000 células/bolha. O rendimento da célula foi associado com a resposta clínica média do TST (Spearman r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figura 1 : Rendimento de célula de bolha sucção. (um) este painel mostra um representante microscopia das células manchadas de nigrosine isolado do SBs levantadas 7 dias post-TST. (b) este painel mostra as relações entre a induração TST média (mm) e o rendimento médio da célula (/blistern) em 8 voluntários vacinados BCG (número de bolhas = 15). Os pontos representam medidas individuais. Por favor, note que os 2 pontos se sobrepõem como 2 voluntários ambos tinham uma induração TST de 0 mm e um rendimento de célula de 15.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para demonstrar a caracterização fluxo cytometric SB, SBCs foram obtidos de um voluntário de 43 anos que tinha sido vacinados BCG 30 anos antes e tinha nenhuma exposição conhecida para Mtb. O SBCs foram isolados após a indução de uma bolha única ( endurecimento: 1,4 mm/100.000 SBCs). A Figura 2 mostra a parcela representativa da coloração de citocinas intracelulares do SBCs contra PBMCs.
Neste voluntário, a fração de CD3 + CD4 + CD8-SBCs aumentou de 67% nas células unstimulated para > 90% em cima de um PPD em vitro restimulation, Considerando que a fração de CD3 + CD4 + CD8-PBMCs permaneceu constante (~ 51%, Figura 2). Mais de 92% do em vitro PPD-, bem como os CD3 + CD4 + CD8-SBCs unstimulated, foram do tipo memória efetoras (CCR7 - CD45RA-, dados não mostrados). As frações globais de CD3 + CD4 + CD8-células específicas induzidas pela PPD-estimulação foram maiores nos SBCs em comparação com os PBMCs (33.1 vs. 0,2%, unstimulated amostras subtraídas). No PBMC, as frações de polifuncionais PPD específico CD3 + CD4 + CD8-células foram todos < 0,05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figura 2 : Parcelas de citometria de fluxo representativo da SBCs contra PBMCs. Painéis a e b mostram representativa densidade unstimulated parcelas das populações de CD8 + e CD4 + em (um) vs. PPD-estimulada PBMCs e (c) SBCs. painéis b e d lento de citocinas intracelulares coloração em PPD-estimulada CD3 + CD4 + CD8-células para (b) PBMCs parcelas e (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">por favor clique aqui para ver um maior versão desta figura.</a>
Como esperado, CD3 + CD4 + CD8-SBCs foram registrados na vivo, ilustrado por uma elevada proporção das células mancha para upregulated citocinas (12%), com as citocinas predominantes, sendo o TNF-α e IFN-γ. No entanto, em cima de PPD-estimulação, o cytokine secretoras células deslocado para um triplo ou duplo-positivo IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) e IFN-γ + TNF-α + (15%) perfil (Figura 3b, PBMC perfis do mesmo doador são incluídos para comparação no Figura 3a). Os perfis de expressão de citocinas para subconjuntos de células T de memória CD4 + PPD-estimulada effector (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) eram comparáveis à população-CD3 + CD4 + CD8 apresentada nas figuras 2 e 3 (dados não mostrados).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figura 3: perfis de citocinas para CD4 + PPD-estimulada e unstimulated SBCs contra PBMCs.  Estes painéis mostram perfis individuais para a produção de citocinas (um) CD3 + CD4 + CD8-PBMC células e (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. As barras representam fracções de perfis cytokine antígeno-específicas em células unstimulated (barras brancas) e após uma estimulação em vitro com PPD (barras coloridas).
Para explorar o fluido SB como fonte de informações sobre o microambiente de citocinas no local do teste a pele, os níveis de citocinas foram medidos no fluido colhido do SBs induzido 7 dias post-TST (figura 4a). Os níveis medianos de IFN-γ, TNF-α e IL-2 foram 339 pg/mL, 19 pg/mL e 1 pg/mL, respectivamente (n = 6). Os níveis de plasma eram geralmente muito baixos. Células isoladas de SBs produziram níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias ex vivo (figura 4b). Titulações dos SBCs de 1 voluntário foram cultivadas por 4 dias na presença de virulenta de M. tuberculosis ± PBMCs autólogos. Os níveis de IFN-γ foram > 30-fold maior em culturas contendo SBCs, independentemente da presença de PBMC.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figura 4 : Os níveis de citocinas no fluido de SB, plasma, e MTB -infectados sobrenadantes cultura. (um) este painel mostra níveis de citocinas no plasma e sobrenadantes fluidos SB de 6 voluntários vacinados BCG. As barras representam os níveis de citocina mediana; as barras de erro representam o intervalo. (b) este painel mostra os níveis de citocinas em sobrenadantes de 4 paralelo 600 µ l ex vivo 4 dias culturas de 1 x 106 PBMCs (barras pretas), 1,75 x 105 SBCs (barras brancas) e 1 x 106 PBMCs cravado com 0,5 ou 1,75 x 10 5 SBCs (barras cinzentas) infectados com Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Aqui, nós fornecemos uma demonstração do modelo sucção bolha cutâneo de recordação. O modelo permite um acesso simples ao estudo humano na vivo adaptável respostas imunes, por exemplo, no contexto do desenvolvimento de vacinas.

Um protocolo de aspiração da bolha para estudar células T humanas Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

11.9K visualizações.  Statens Serum Institut. Aqui, nós fornecemos uma demonstração do modelo sucção bolha cutâneo de recordação. O modelo permite um acesso simples ao estudo humano na vivo adaptável respostas imunes, por exemplo, no contexto do desenvolvimento de vacinas.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Competitiva Ensaios Homing para Estudar Gut trópico-Migração de Células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Imunologia e Infecção

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Indução de enxerto-versus-hospedeiro de Doenças e<em&gt; Em Vivo</em&gt; Monitoramento celular T Usando um modelo murino de MHC de correspondência

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Um<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar a heterogeneidade de diferenciação de macrófagos humanos e Polarização

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

O Uso de fluorescentes alvo Matrizes para a Avaliação de respostas de células T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

O transplante de pele da cauda para estudar as respostas das células T CD4 alogênico em camundongos

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culturas placentária e Decidual órgão humano para estudar Infecções na interface materno-fetal

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento de Salmonella typhimurium-contendo Phagosomes de macrófagos

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Avaliação das respostas de células T Zika vírus específicos em órgãos Immunoprivileged de infectados Ifnar1- / - ratos

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ensaio de ELISpot otimizado de Interferon-gama às respostas de célula T medida no modelo de porquinho da Índia após a vacinação

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...