Mads Radmer Jensen onun pratik ve akademik danışmanlık için teşekkür etmek istiyorum; Lau Lindqvist ve teknik uzmanlık sağlamak için Kaare Svejstrup; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt ve Solveig W. Harpøth kendi teknik yardım için; Gentofte TB polikliniğine PPD yönetim eğitimleri için de personel; ve tüm gönüllü çalışmaya katıldığınız için. Bu proje Avrupa Komisyonu H2020 program [grant numarası TBVAC2020 643381] tarafından finanse edilen ve konsorsiyum ortaklarının verimli tartışmalar için teşekkür etmek istiyorum.

Tüm yöntemler aşağıda açıklanan insan gönüllü, dahil olmak üzere sağlık araştırma etik (H-15002988) ve Danca veri koruma ajansı (jr.nr. 2015-57-0102) Danimarka Komitesi tarafından onaylanmış olması. PPD insan kullanımı için onaylanmış ve üretici tarafından sağlanan doğru dozaj içinde yönetilen sertifikalı bir ürün olması gerekir. Doz veya yönetim olarak herhangi bir sapma ek etik onayları gerektirebilir ve gönüllü onam vermelisin.
1. tüberkülin cilt testi
<ol><li>Yazılı ve sözlü onam gönüllü edinin. Enjeksiyon önce gönüllü anlar ve olası yan etkileri de dahil olmak üzere yordam kabul emin olun. Not: Dahil bu protokole özgü Yaş > 18 yaş ve belgelenmiş bir BCG aşısı ölçütlerdir. Katılım kriterleri araştırma soru bağlı olarak farklı olabilir (Örneğin, bir ek katılım kriteri olumlu TST kanıtı olabilir).</li>
	<li>PPD hazır bir çözüm insan kullanım [20 tüberkülin birimleri (TU) /mL] kullanın. Bir şişe alkol pamuklu çubuk kullanarak kauçuk kapak dezenfekte.</li>
	<li>Enjeksiyon yeri hazırlamak<ol>
<li>Gönüllünün önkol ventral tarafta enjeksiyon yeri bulun.</li>
		<li>Kol palm kadar düz bir yüzeye yerleştirin ve ön kol, dirsek eklem yaklaşık 5-10 cm üst üçte üzerinde bir alanı seçin. Yara izi, damarları veya hasarlı cilt uzak durun.</li>
		<li>Alkollü bir pamuklu çubuk kullanarak alan dezenfekte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPD-çözüm hazırlamak<ol>
<li>İğne sabit 1 mL steril enjektör ile 27-30 G/kısa (Örneğin, 12 mm) kullanın.</li>
		<li>Yavaşça karıştırın ve 0.1 mL PPD çözeltisi aspire. Hava kabarcığı yok görünür olduğundan emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İntradermal PPD enjeksiyon Not: Bu adım tek PPD ifade gerçekleştirmek açıklar, ancak birden çok ifadeleri PPD aynı kol yeri. Ancak, bu belirli etik onay gerektirebilir.<ol>
<li>Deri streç ve 5-15 ° açıyla iğneyi cilde eğimi yukarı bakacak şekilde gelin.</li>
		<li>İğne ucu cilt dermal tabaka yerleştirin ve ucu ile epidermis neredeyse görünür olduğundan emin olun.</li>
		<li>Yavaş yavaş 0.1 mL PPD çözeltisi enjekte et. Not: Eğer düzgün yönetilen, 6-10 mm soluk bir papül hemen görünür. Papül yaklaşık 10 dakika sonra kaybolur.</li>
		<li>İki veya daha fazla işlemimiz yaparken, dirsek ve bilek alan iyi bir mesafede tutarken bir maksimum ayrılması için (5-10 cm) enjeksiyon sitelerin amacı. Not: Bu cilt testi yanıt potansiyel bir izdiham engeller ve kesintisiz iki emme odaları konumlandırma sağlar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cilt reaksiyon - gün 3 değerlendirilmesi
<ol><li>48-72 saat sonra cilt reaksiyon boyutuna dikkat edin. Sertlik (şişme) ölçmek ve değil reaksiyon eritem (kızarıklık).</li>
	<li>Sabit muayene et parmaklarını kullanarak şişme ve tükenmez kalem kullanarak dizilerinin kenarları işaretleyin. Sertlik çapı ölçmek ve mm sonucu Not için bir cetvel kullanın. Not: Sertlik boyutu bir okuma seçtiğiniz delik çapı emme odası için bir yol.</li>
</ol>3. emiş Blister indüksiyon - 7 gün
<ol><li>Emme cihazı birimi bir araya getirin. Not: Vakum pompaları ile ekli salonları emme blister indüksiyon için emme cihazı birimlerdir. Bu gösteride kullanılan cihaz yapılan özel, ama emme cihazı birimleri de ticari olarak kullanılabilir. Pompa-40 kPa -20 aralığında ayarlanabilir ve istikrarlı ve güvenilir bir negatif basınç sağlamak gerekiyor. Bu yöntemi kullanarak deneyler önce bölgesel etik onay alınmalıdır.<ol>
<li>İlk olarak, alt ağız plaka ve pencere plaka odası ve bağlantı hortumu ile birleştirerek emme odası hazırlayın. Odası-bağlama hortum sıkıca vakum pompası iliştirin. Not: Odaları insan Ciltle temas uygun olmalıdır, blister indüksiyon için bir delik olan bir alt plaka ve görsel blister izlemek için izin veren bir pencere ile üst plaka içermelidir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Delik plaka Cilt tepki boyutunda görece en uygun delik çapı belirlemek; delik büyük boyutunu büyük blister.</li>
	<li>Dezenfekte orifis plaka ve gönüllü cilt alkol temizleme bezi kullanarak.</li>
	<li>Emme odası cilde iliştirin.<ol>
<li>Gönüllünün kolu rahat bulunmadığından emin olun.</li>
		<li>Böylece cilt reaksiyon Merkezi görülebilir emme odası alt plaka delik PPD tepki üzerinde yer alır emin olun.</li>
		<li>Gevşek askıları kullanarak odası güvenli: negatif basınç uygulandığında, odası cilde uygun ve konumunu korumak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Emme cihazı açmak ve -20 kPa basınç ayarlayın.</li>
	<li>30 dakika sonra-25 kPa negatif basınç artar.</li>
	<li>60 dk sonra-30 kPa negatif basınç daha da artırmak.</li>
	<li>Bir blister tam olarak kurulan kadar-30 kPa bastır. Bu protokol için sağlanan negatif basınç için özelleştirilmiş bir enstrüman belirli olduğundan emin olun. Basınç biraz diğer ayarları protokolünde uygularken ayarlamak gerekebilir. Not: Blister indüksiyon fazında Blistering kez bir kaşıntılı sansasyon ile ilişkili son 30 dk. içinde meydana gelen gerçek blister oluşumu ile 180 dk (1-3 h) 60 aralıkları. Kabarcıklar tek veya birden çok birleştirme kabarcıklar oluşabilir. Blister yırtılması ya da kanama ortaya çıktıysa, bu yavaş yavaş baskı serbest bırakarak blister indüksiyon sonlandırmak için tavsiye.</li>
	<li>Blister tam olarak kurulmuş sonra basınç ve blister rüptür olmadan emme Oda deriden dikkatli bir şekilde çıkarın.</li>
	<li>Cilt çevredeki yumuşak bir soyunma uygulamak ve blister üzerinde sabit bir kap (Örneğin, 50 mL plastik tüp) yerleştirin.</li>
	<li>Bir yumuşak stretchy bandaj tarafından takip alerjik olmayan cerrahi bant ile kapağı güvenli.</li>
	<li>Sonraki 12-24 h blister alan üzerinde aşırı fiziksel yük önlemek için gönüllü talimat.</li>
</ol>4. hasat Blister sıvısı - günde 8
<ol><li>8inci gününde, yavaşça koruyucu soyunma kaldırmak ve blister cilt dezenfeksiyon sprey ile dezenfekte.</li>
	<li>2 mL steril enjektör 23 G iğne ile blister içeriğin hasat için kullanın. İğne blister çatı üst/lateral yan içine yerleştirin ve yavaş yavaş sıvı Aspire edin. Kavite katında dokunmaktan kaçının ama tüm sıvı hasat emin olun.</li>
	<li>Bir soyunma daraltılmış blister üzerinde uygulayın.</li>
	<li>Blister sıvısı için steril bir tüp aktarın. Birimin unutmayın.</li>
	<li>600 x g masa üstü bir santrifüj 4 min için kullanarak, blister sıvısı aşağı spin.</li>
	<li>Süpernatant aktarmak için başka bir tüp ve hücre Pelet cep orta 500 µL içinde resuspend. Not: Şimdi sayma ve analiz için daha fazla hazır hücrelerdir. Supernatants-20--80 ° C de kullanımı kadar saklanabilir.</li>
</ol>5. analiz emme hücreleri ve sıvıları Blister
Not: hücreleri ve cilt emme kabarcıklar elde edilen sıvı analizi için yönergeler sağlama bu protokol kapsamında değildir. Ancak, bu rapor için temsil edici sonuçlar sağlamak için hücre içi leke akış sitometresi ve multiplex analizleri yapıldı. Metodoloji aşağıda kısaca açıklanmıştır.
<ol><li>Akış Sitometresi<ol>
<li>1 x 105 taze hücre 1 BCG aşısı gönüllü 10 µg/mL PPD ile gelen emme kabarcıklar dan izole süspansiyonlar teşvik etmek ve 37 ° C ve % 5 hücreleri kuluçkaya CO2. Paralel bir kuluçka için unstimulated hücreler içerir.</li>
		<li>1 x 106 PBMCs elde edilen 1 BCG aşısı gönüllü 10 µg/mL PPD ile gelen süspansiyonlar teşvik etmek ve 37 ° C ve %5 karisimin kuluçkaya CO2. Paralel bir kuluçka için unstimulated hücreler içerir.</li>
		<li>2 h sonra Brefaldin A ve monensin içeren tüm hücreleri tedavi etmek ve onları 6 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Bir panel canlı/ölü-leke-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 ve anti-IL-2-FITC hücrelerle leke.</li>
		<li>FMO denetimler PBMC Masası'nda bulunur.</li>
		<li>Akış sitometresi ile bir akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştir ve ilgili yazılım kullanarak sonuçları çözümleyebilirsiniz.</li>
		<li>Geçit sitokin üreten CD3 + CD4 + CD8-aşağıdaki gating strateji kullanarak alt kümeleri üzerinde: gömlek - > uygun CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + veya IL-2 +.</li>
		<li>Kapı aşağıdaki gating strateji kullanarak efektör bellek hücre popülasyonlarının: gömlek - > uygun CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Boole geçişi kullanarak bireysel sitokin profilleri hesaplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sitokin yayın gösteriler<ol>
<li>Vivobir sitokin bir gösteri için yayın, IL-2, IFN-γ, TNF-α, Il düzeylerini ölçmek için çok katmanlı bir analiz kullanın-10 ve IL-13'te 4 gönüllü elde çözdürülen emme blister sıvısı.</li>
		<li>Bir gösteri olarak bir sitokin sürümü hücreleri tarafından elde edilen emme ex vivo, kullanım taze emme blister hücreleri kabarcıklar ve PBMCs 1 gönüllü BCG aşı elde.</li>
		<li>PBMC bulaştırmak ve 100 koloni oluşturan birim (CFU) Mtb H37Rv hücrelerle blister emiş ve onları 4 gündür kuluçkaya.</li>
		<li>IL-2, IFN-γ, TNF-α, Il düzeylerini ölçmek için çok katmanlı bir analiz kullanın-10 ve IL-13'te tüm kültür supernatants.</li>
		<li>Yukarıda tahlil hesaplama aralığın üst hesaplama sınırlamak için ölçümleri ayarlayın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kiistala, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+device+for+separation+of+viable+epidermis+from+dermis.">Suction blister device for separation of viable epidermis from dermis.</a> Journal of Investigative Dermatology. 50 (2), 129-137 (1968).</li><li>Akbar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+cutaneous+response+to+recall+antigen+in+humans+in+vivo.">Investigation of the cutaneous response to recall antigen in humans in vivo.</a> Clinical &amp; Experimental Immunology. 173 (2), 163-172 (2013).</li><li>Hatje, L. K., Richter, C., Blume-Peytavi, U., Kottner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blistering+time+as+a+parameter+for+the+strength+of+dermoepidermal+adhesion:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Blistering time as a parameter for the strength of dermoepidermal adhesion: a systematic review and meta-analysis.</a> British Journal of Dermatology. 172 (2), 323-330 (2015).</li><li>Smith, T. J., Wilson, M. A., Young, A. J., Montain, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+suction+blister+model+reliably+assesses+skin+barrier+restoration+and+immune+response.">A suction blister model reliably assesses skin barrier restoration and immune response.</a> Journal of Immunological Methods. 417, 124-130 (2015).</li><li>Maranda, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+management+of+leukoderma+after+burn:+A+review.">Surgical management of leukoderma after burn: A review.</a> Burns: Journal of the International Society of Burn Injuries. 44 (2), 256-262 (2017).</li><li>Wilhelm, K. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+wound+healing:+an+emphasis+on+clinical+studiea.">Models of wound healing: an emphasis on clinical studiea.</a> Skin Research and Technology: Official Journal of the International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) and the International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) and the International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).</li><li>Maini, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+Human+Neutrophils+Acquired+from+Four+Experimental+Models+of+Inflammation.">A Comparison of Human Neutrophils Acquired from Four Experimental Models of Inflammation.</a> PLoS ONE. 11 (10), (2016).</li><li>Kenney, R. T., Rangdaeng, S., Scollard, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+blister+immunocytology.+A+new+method+to+quantify+cellular+kinetics+in+vivo.">Skin blister immunocytology. A new method to quantify cellular kinetics in vivo.</a> Journal of Immunological Methods. 97 (1), 101-110 (1987).</li><li>Carvalho, J. C. O., Palero, J. A., Jurna, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+suction+blistering+in+human+skin+using+optical+coherence+tomography.">Real-time imaging of suction blistering in human skin using optical coherence tomography.</a> Biomedical Optics Express. 6 (12), 4790-4795 (2015).</li><li>Belson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+the+clinical+and+activated+T+cell+response+to+repeat+delayed-type+hypersensitivity+skin+challenges+in+human+subjects,+with+KLH+and+PPD,+as+a+potential+model+to+test+T+cell-targeted+therapies.">Characterisation of the clinical and activated T cell response to repeat delayed-type hypersensitivity skin challenges in human subjects, with KLH and PPD, as a potential model to test T cell-targeted therapies.</a> Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et al.]. 65 (5), 389-404 (2016).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Thakur, A., Pedersen, L. E., Jungersen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+markers+and+correlates+of+protection+for+vaccine+induced+immune+responses.">Immune markers and correlates of protection for vaccine induced immune responses.</a> Vaccine. 30 (33), 4907-4920 (2012).</li><li>CDC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TB | Fact Sheets - Tuberculin Skin Testing for TB. , (2018).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Varicella+Zoster-Specific+CD4+Foxp3++T+Cells+Accumulate+after+Cutaneous+Antigen+Challenge+in+Humans.">Varicella Zoster-Specific CD4+Foxp3+ T Cells Accumulate after Cutaneous Antigen Challenge in Humans.</a> The Journal of Immunology. 190 (3), 977-986 (2013).</li><li>Reed, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+erosion+in+memory+T+cells+induced+by+telomerase+inhibition+at+the+site+of+antigenic+challenge+in+vivo.">Telomere erosion in memory T cells induced by telomerase inhibition at the site of antigenic challenge in vivo.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199 (10), 1433-1443 (2004).</li><li>Tatovic, D., Young, P., Kochba, E., Levin, Y., Wong, F. S., Dayan, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-Needle+Aspiration+Biopsy+of+the+Lymph+Node:+A+Novel+Tool+for+the+Monitoring+of+Immune+Responses+after+Skin+Antigen+Delivery.">Fine-Needle Aspiration Biopsy of the Lymph Node: A Novel Tool for the Monitoring of Immune Responses after Skin Antigen Delivery.</a> The Journal of Immunology. 195 (1), 386-392 (2015).</li><li>Bond, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+infiltrate+the+skin+in+positive+tuberculin+skin+test+indurations.">Plasmacytoid dendritic cells infiltrate the skin in positive tuberculin skin test indurations.</a> Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 114-123 (2012).</li><li>Bell, L. C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Molecular+Dissection+of+the+Effects+of+HIV-1+in+Active+Tuberculosis.">In Vivo Molecular Dissection of the Effects of HIV-1 in Active Tuberculosis.</a> PLoS Pathogens. 12 (3), e1005469 (2016).</li><li>Tomlinson, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+innate+and+adaptive+human+immune+responses+to+mycobacteria+in+the+tuberculin+skin+test.">Transcriptional profiling of innate and adaptive human immune responses to mycobacteria in the tuberculin skin test.</a> European Journal of Immunology. 41 (11), 3253-3260 (2011).</li><li>Nayak, S., Acharjya, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+test+and+its+interpretation.">Mantoux test and its interpretation.</a> Indian Dermatology Online Journal. 3 (1), 2-6 (2012).</li><li>Vukmanovic-Stejic, M., Reed, J. R., Lacy, K. E., Rustin, M. H. A., Akbar, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantoux+Test+as+a+model+for+a+secondary+immune+response+in+humans.">Mantoux Test as a model for a secondary immune response in humans.</a> Immunology Letters. 107 (2), 93-101 (2006).</li><li>Menzies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+of+Repeated+Tuberculin+Tests.">Interpretation of Repeated Tuberculin Tests.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 159 (1), 15-21 (1999).</li><li>Pitzalis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+migration+of+the+human+helper-inducer+memory+T+cell+subset:+confirmation+by+in+vivo+cellular+kinetic+studies.">Selective migration of the human helper-inducer memory T cell subset: confirmation by in vivo cellular kinetic studies.</a> European Journal of Immunology. 21 (2), 369-376 (1991).</li><li>Kool, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suction+blister+fluid+as+potential+body+fluid+for+biomarker+proteins.">Suction blister fluid as potential body fluid for biomarker proteins.</a> Proteomics. 7 (20), 3638-3650 (2007).</li><li>Flynn, J. L., Chan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunology+of+tuberculosis.">Immunology of tuberculosis.</a> Annual Review of Immunology. 19, 93-129 (2001).</li><li>Kagina, B. M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+T+cell+frequency+and+cytokine+expression+profile+do+not+correlate+with+protection+against+tuberculosis+after+bacillus+Calmette-Gu&#233;rin+vaccination+of+newborns.">Specific T cell frequency and cytokine expression profile do not correlate with protection against tuberculosis after bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination of newborns.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 182 (8), 1073-1079 (2010).</li><li>Garc&#237;a-Basteiro, A. L., Ruhwald, M., Lange, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+tuberculosis+vaccine+trials+under+financial+constraints.">Design of tuberculosis vaccine trials under financial constraints.</a> Expert Review of Vaccines. 15 (7), 799-801 (2016).</li><li>Luabeya, A. K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First-in-human+trial+of+the+post-exposure+tuberculosis+vaccine+H56:IC31+in+Mycobacterium+tuberculosis+infected+and+non-infected+healthy+adults.">First-in-human trial of the post-exposure tuberculosis vaccine H56:IC31 in Mycobacterium tuberculosis infected and non-infected healthy adults.</a> Vaccine. 33 (33), 4130-4140 (2015).</li><li>Tameris, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+candidate+TB+vaccine,+MVA85A,+induces+highly+durable+Th1+responses.">The candidate TB vaccine, MVA85A, induces highly durable Th1 responses.</a> PloS One. 9 (2), e87340 (2014).</li><li>Woodworth, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+vaccine+H56/CAF01+induces+a+population+of+circulating+CD4+T+cells+that+traffic+into+the+Mycobacterium+tuberculosis-infected+lung.">Subunit vaccine H56/CAF01 induces a population of circulating CD4 T cells that traffic into the Mycobacterium tuberculosis-infected lung.</a> Mucosal Immunology. 10 (2), 555-564 (2016).</li><li>Gideon, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists,+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization.">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).</li><li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection,+compared+with+an+interferon+&#947;+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test:+a+phase+3,+double-blind,+randomised,+controlled+trial.">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon &#947; release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li><li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+Isolation+from+Human+Skin+for+Phenotypic+Analysis+and+Ex+Vivo+Cell+Culture.">Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564 (2016).</li><li>Koskela, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blister+fluid+and+serum+cytokine+levels+in+severe+sepsis+in+humans+reflect+skin+dysfunction.">Blister fluid and serum cytokine levels in severe sepsis in humans reflect skin dysfunction.</a> Acta Anaesthesiologica Scandinavica. 61 (1), 53-61 (2017).</li><li>Wada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+skin+blister+fluids+from+children+with+Epstein-Barr+virus-associated+lymphoproliferative+disease.">Characterization of skin blister fluids from children with Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferative disease.</a> The Journal of Dermatology. 45 (4), 444-449 (2018).</li><li>Andersson, C., Rajala, T., S&#228;rkk&#228;, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+models+for+epidermal+nerve+fiber+data.">Hierarchical models for epidermal nerve fiber data.</a> Statistics in Medicine. 37 (3), 357-374 (2018).</li><li>Ramshanker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Prednisolone+on+Serum+and+Tissue+Fluid+IGF-I+Receptor+Activation+and+Post-Receptor+Signaling+in+Humans.">Effects of Prednisolone on Serum and Tissue Fluid IGF-I Receptor Activation and Post-Receptor Signaling in Humans.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. 102 (11), 4031-4040 (2017).</li><li>Bouma, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCL20+neutralization+by+a+monoclonal+antibody+in+healthy+subjects+selectively+inhibits+recruitment+of+CCR6++cells+in+an+experimental+suction+blister.">CCL20 neutralization by a monoclonal antibody in healthy subjects selectively inhibits recruitment of CCR6+ cells in an experimental suction blister.</a> British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (9), 1976-1990 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu el yazması insan bağışıklık belleği yanıt vivo içindekutanöz antijen hatırlama ve hücre hasat emme blister indüksiyon tarafından kullanarak, çalışma için pratik bir yordam açıklanır. TST intradermal antijen ifade ve BCG aşısı hatırlama bir örnek olarak kullanılmıştır. Bu kabaca üçte biri SB hücreleri gösteren edildi sağlanan antijen spesifik Polifonksiyonel T-hücreleri efektör bellek fenotip, son olarak, bir akış sitometrik ve multiplex sitokin Analizi tarafından SB numune karakterizasyonu örnekti.
Bu protokol kritik adımlar intradermal enjeksiyon tekniği, emme blister indüksiyon ve blister ponksiyon içerir. Öncelikle, doğru intradermal ifade eğitimli personel gerektirir. Yanlış bir ifade suboptimal sonuçlara yol açabilir. PPD genellikle iyi bilinen ve güvenli kutanöz antijen, ama onun kompozisyon karşılaştırılabilir13,20sınırlama üreticileri arasında değişebilir. Bu rapor 2 TU tek intradermal birikimi ve ek etik onay gerektiren paralel isteğe bağlı olarak iki ifadeleri (2 x 2 TU) için yönergeler sağlar. Ancak, diğer çalışmalar 10 TU, güçlü cilt reaksiyon10,21olasılığını artırmak kullandık. SB indüksiyon adımı sırasında negatif basınç kademeli küçük artışlar kanama ve blister rüptürü riskini azaltacaktır. Kırmızı kan hücreleri veya leucocytes gelen kan ile kirlenme genellikle düşük2dir. Aseptik ponksiyon tekniği mikrobiyal kirlenme önler ve ponksiyon iğnesi ve dermal blister katı arasında temas kaçınarak enkaz veya ikamet cilt hücrelerini kirleri azaltır. Ancak, bazı araştırmacılar için delinmiş blister10haddeleme basınç uygulayarak SB sıvı hasat tercih ederim. Blister içinde septa ponksiyon gerekli olabilir. SB kendisi Minimal İnvasif tekniktir; daraltılmış SBs skarlasma olmaksizin iyilesmektedir ve enfeksiyonlar çok nadirdir. 2 ancak, hipo-pigmentasyon ölçüde ortaya çıkabilir ve SB indüksiyon albüminkolloid skarlasma bir geçmişi olan insanlar muhtemelen kaçınılmalıdır.
Teknik sınırlamaları düşük toplam hücresini verimleri ve uzun süreli depolama için sonuç olarak sınırlı seçenekler içerir. Leucocyte verim, klinik TST yanıt, blister ebadı ve eritrosit kirlenme arasındaki ilişkileri oldu iyice başka bir bölümünde2,10. Burada sunulan BCG-geri çekme deneyleri (Şekil 1), ortalama toplam verim her blister üzerinden 50.000, özellikle SBCs okudu yalnız15iseniz bu hücreler kullanarak küçük ölçekli bir deneysel set-up ima yapıldı. Ancak, bir SB örnek belirli T hücreli nüfus çoğunlukla ne her iki göreceli ve mutlak hücre sayımları PBMC örnekleri bulunur aşıyor. Şekil 2' de sunulan örnekte üç kez pozitif PPD özel T-hücreleri 100.000 SB hücreleri bir örnek daha--dan 2 x numara bulunan 1 x 106 PBMCs aynı donörden (veri gösterilmez) daha büyük idi. TST tepkisi görsel bir Puanlama M. tuberculosis bellek değerlendirilmesi için en sık görülen klinik yöntemidir. Belirtmek gerekirse temel edinilmiş bağışıklık reaksiyonu klinik cilt reaksiyon2,21aynı anda zirve değil. Değil tüm BCG aşısı veya Mtb-maruz kalan bireylerin güçlü TST reaksiyonlar ve sınıflandırma ve sigara TST cevaplama yanı sıra çalışma nüfus, önceden varolan bir Mikobakteriyel Sensitizasyonu örnekleri işlenmesi için stratejiler geliştirecektir Bu yöntemi kullanarak bir geri çağırma deneme işlemini başlatmadan önce dikkate alınması gerekir. Ayrıca, hem SB örnekleme ve görsel Puanlama, küresel nedeniyle indirimli cilt yanıt-e doğru kişilerle teorik bir önyargı için bir potansiyel olduğunu veya deri ile ilgili bağışıklık, örneğin, HIV enfeksiyonu ve belirli yaş gruplarına2görüldüğü gibi Engelli, 13,18,20. Ayrıca, tekrarlanan test ile TST tepki bir bağışıklık artırılması iyi bilinen20,22yaşında. TSTs tekrarlanan10olduğunda ancak, SB hücre fenotipleri oldukça sabit kalır. Bu gözlem, hücresel bağışıklık yanıtı boyuna çalışmalarda SB hatırlama rolü destekler.
T-hücre immunologists için yüksek kesirler antijen spesifik hücre hasat için SB geri çekme sağlar. Ancak, SB zamanlaması için bir örnekleme PPD-ifade üzerinden hücresel kompozisyon ve sitokin microenvironment zaman içinde değiştikçe önemlidir. Bu protokol için kabarcıklar indüklenen 7 günlük sonrası challenge ve izole hücreler öncelikle CD4 + efektör bellek T-hücreleri idi hücreleri yüksek kesirler IFN γ, TNF-α ve IL-2 ortak bir ifade ile de dahil olmak üzere. Nasıl T-hücre harekete geçirmek, yayılması ve farklılaşma PPD astarlanmalıdır cilt2,15,21' oluşur açıklayan önceki çalışmalar doğrultusunda bu gözlemler vardır. Kinetik SB çalışmalar PPD duyarlı bireylerde çok erken cilt yanıt belirsiz olduğunu göstermektedir; Ancak, zaten PPD-meydan sonraki ilk gün içinde yanıt CD4 + T (merkezi her iki bellek ve efektör bellek fenotipleri tarif edilmiştir) hücreleri tarafından hakim olur ve, 3 gün sonra yanıt tarafından yüksek kesirler hakimdir PPD özel sitokin CD4 + T hücreleri2,8,10,15,21üreten. Bu adaptif sitokin yanıtın 2 hafta2,8,10,23' den daha fazla bilgi için algılanabilir kalır. Gün 7 mesaj-TST bellek CD4 + T hücreleri2üreten sitokin topluluğu için en uygun zaman noktası gibi görünüyor. Ancak, diğer zaman puan tabii, antijen ve yanıt ilgi bağlı olarak ilgili olabilir. Notun bir çalışmada, adaptif PPD yanıt biraz daha erken zaten de 5 gün mesaj-TST10pro-inflamatuar sitokin salgısının bir azalma ile zirve bildirilmiştir.
SB sıvı pro-inflamatuar sitokinlerin ve cilt microenvironment15,24temsilcisi olarak gösterilen diğer proteinler yüksek düzeyde içerir. TNF-α IFN γ düzeyleri ve bu SB sıvı pik IL-2 düzeyleri zirve sırasında 3 gün sonra 7 gün2,10' dan sonra muhtemelen bu daha sonraki aşamada adaptif yanıt hakimiyeti yansıtan kinetik çalışmalar göstermiştir. SB hücreleri aktif vivo içindeçünkü, onlar yüksek spontan sitokin yayın hem de restimulation (Şekil 3 ve 4) üzerine belirli bir yayın için potansiyel bir sergi.
Bu rapor CD4 + T hücre bağışıklık üzerinde duruluyor. Olarak gösterdiği Rakam2, izole T-hücreleri çoğunluğu gerçekten CD4 + vardı, oradayken neredeyse hiçbir CD8 + T-hücreleri emme sıvı blister. Düşük oranlarda ve CD8 + T-hücreleri CD4 + T hücreleri2,8,10,23için karşılaştırıldığında daha aşağı bir göçmen kapasite raporlama diğer SB PPD-hatırlama çalışmaları doğrultusunda bu. CD8 + katkı daha fazla karakterizasyonu tercih olurdu; Ancak, bu bu raporu kapsamý dýþýndadýr.
T-hücreleri Mtbbağışıklık denetim için temel olarak kabul edilir; Ancak, güvenilir bir ilişkili kan25,26edinilmiş bağışıklık yanıtındaki yansıyan koruma tanımlamak zor olmuştur. Şu anda olduğu gibi büyük ve çok pahalı etkinlik denemeleri27hiçbir alternatif bu barikatı ciddi yeni TB aşıların geliştirilmesi engel. TB aşı geliştiriciler aşı özel T-hücre popülasyonlarının kan28,29küçük ve geçici değişikliklerinin değerlendirilmesi tarafından aşı immünojenisite belirlemek. Ancak, antijen spesifik T-hücreleri kanda bulunan dolaşan küçük kısmını ilgili olup olmadığı sorgulanabilir (yani, bir enfeksiyon ve T hücre zengin microenvironment kontrol temsilcisinin siteye geçirme yeteneğine sahip Mtb) 27 , 30 , 31 .
Önceki çalışmalarda ve burada sunulan veriler temel alınarak, SB kutanöz geri çekme modeli aşı özel T-hücrelerinin incelenmesi için bir kullanılmayan potansiyeli temsil eder. Sadece model bir aşı üretilen yanıt on yıl önce bir geri çağırma izin vermez, aynı zamanda gerçek bellek değerlendirilmesi bir doku özel bağlam15,18,19,21potansiyel sağlar. Roman, aynı zamanda oluşan antijenleri aday alt birim TB aşıların dahil, belirli Cilt testleri bu model28,32kullanarak aşı değerlendirme için yeni fırsatlar öneririz. Ayrıca, bir hücre - mediated bağışıklık yanıtı PPD meydan ciltte oluşturulan Mtbiçinde bulunan Yanıt benzer olduğunu transcriptomic analizleri öneririz-enfekte akciğer18.
Cilt punch biyopsi de deriden bir hücre hasat için izin ve SB örnekleme ile karşılaştırıldığında mekansal bilgi sağlamak belgili tanımlık yöntem daha invaziv ve tek hücreli süspansiyonlar33hazırlamak için enzimatik veya mekanik işlem gerektirir. Sitokinler ve hücre işaretleri ölçümleri arasında iki yöntem2,10karşılaştırılabilir.
Emme blister yöntemi zaten Dermatoloji, yanı sıra tıbbi araştırma birçok alanda tek başına veya birlikte bir sistemik veya yerel cilt meydan okuma ile uygulanmış. Sepsis, Epstein - Barr virüsü ilişkili lenfoproliferatif hastalığı, diyabetik nöropati, glukokortikoid alımı etkileri ve insan denemeler terapötik antikorlar veya modelleri T hücre hedeflenmiş tedaviler10 için test çalışmaları örnek gösterilebilir ,34,35,36,37,38.
Terapötik bir bakış açısından SB kutanöz geri çekme yöntemi merkezi T-hücre bellek potansiyel çalışmaya benzersiz avantajlar sunuyor ve -her iki biyolojik ve teknik bakış açısı-cilt ilgili örnekleme yuvası2, sağlamak gibi görünüyor 15,18,19,21. Özellikle, PBMCs dolaşan geleneksel, pasif örnekleme kıyaslandığında, SB kutanöz geri çekme yöntemi yanıt-e doğru onların ilgili antijen lenf düğümünde geçirmek ve yerel tamamlamak yeteneği kanıtlanmış T-hücreleri çalışma için sağlar genişleme ve farklılaşma bir doku özgü vivo içinde bağlam15,18,19,21.
Sonuç olarak, model burada insan edinilmiş bağışıklığın ve T hücreli hedefleme aracılarının (yani, bulaşıcı hastalık vaccinology veya kanser araştırma) alanındaki araştırmacılar için ilgili olabilir gösterdi. Bu protokol için uygulanan TST modeli olduğunu, tabii ki, TB vaccinology alanında özel konu ile ilgili. Ancak, bu model temel kavramı diğer araştırma alanlarında son derece geçerlidir.

Cilt SB hücrelerin ve sıvı cilt üzerinden doğrudan hasat için sağlar bir yapay indüklenen blister olduğu. SBs vakum tarafından yetiştirme tekniği Dermatoloji deri İmmünoloji sağlığı ve hastalıkları1,2,3,4,5, incelenmesi için kullanılan alanı içinde iyi bilinen bir araçtır 6 , 7 , 8. bu raporu nasıl kutanöz antijenik hatırlama (SB kutanöz geri çekme yöntemi) ile kombine SB tekniği doğrudan edinilmiş bağışıklık yanıtı içinde vivokazandırabileceğini gösterir.
SB indüksiyon arkasındaki prensip basittir: bir ışık vakum cildin küçük bir alana uygulanır. Negatif basınç sonunda epidermis ile sıvı ve hücreleri1,2,9dolu bir yerel blister oluşturma dermis, ayırmak için zorlar. Blister sıvısı tarafından ince iğne aspirasyon hasat edilebilir ve içerik-ebilmek var olmak kullanılmış için daha fazla vitroçalışma.
Son yıllarda SB yöntemi vivo içinde bağışıklık yanıtı cilt10,11' e kısıtlanmış hastalıkları dışında çalışma için artan bir ilgi olmuştur. İnsanlarda edinilmiş bağışıklığın çalışmanın lenf nodu veya gastrointestinal mukozal doku invaziv bir örnektir ve etik olmayan kabul edilemez olduğu için hücreleri ve sitokinler ilgi periferik kan örnek ki gerçeği ile sınırlıdır. Bir örnek aşı12' den sonra uzun ömürlü insan hafızası T hücreli yanıt çalışmadır. Bu tür çalışmalarda aracılık bağışıklık hücrelerinin ilgili nüfus lenfoid dokusunda bulunduğundan örnekleme ilgili T-hücrelerinin büyük bir meydan okuma olabilir ve sadece çok sınırlı sayıda belirli T-hücrelerinin periferik kan dolaşımını.
SB teknik bellek T-hücrelerinin incelenmesi için eşsiz bir fırsat ve diğer belirli hücre popülasyonlarının sunar. Kutanöz Aşı antijen, T-hücreleri özel antijen için onların lenfoid Dinlenme mekanlari cilt için işe ve kolayca SB tatmak mümkündür. Bu kutanöz geri çekme modeli metodolojisi ve araştırma uygulamaları Akbar ve ark. tarafından tarif edildi 20132' de. Cilt geri çağırmak için yaygın olarak kullanılan bir antijen mikobakteriler bir tüberkülin cilt testi (TST)13, nerede PPD deri deri tabakası enjekte edilir gerçekleştirmek için kullanılan piyasada bulunan saf protein türev (PPD) biridir. PPD [Örneğin, Mycobacterium tüberküloz (Mtb) enfeksiyon veya bir önceki Bacillus Calmette-Guerin (BCG) aşısı olan bireyler] doğru varolan bir immünolojik bellek ile bireylerde, antijen ifade sonuçlanan bir cilt ve in vivo klonal genişlemesi PPD özel CD4 + T hücreleri2,11,14,15geçiş ile yanıt hatırlayın. Sonuç olarak, PPD özel Polifonksiyonel yüksek kesirler SB örnekleme için hazır deride CD4 + T hücreleri birikir. T-hücreleri bu yöntem tarafından toplanan sağlam olduğu kanıtlanmıştır ve yeterince uzun bir dizi ve bir uzun vadeli vitro kültür15tarafından karakterize edilebilir bol miktarda bulunmaktadır. Bu nedenle, kutanöz geri çekme modeli ve SB indüksiyon vivo içinde T-hücre yanıt ex vivo analizleri tarafından eğitim için değerli bir yöntem ispat edebilir ve bu yaklaşımın artan bilgi araştırmacılar hücresel immünoloji çıkarları ile yararlanabilir ve vaccinology.
Bu rapor, insan derisi emme kabarcıklar cilt PPD enjekte ikna etmek ilk kademeli kılavuzu sağlar. Kutanöz antijen geri çekme modeli TST BCG aşısı gönüllü olarak kullanarak gösterilmiştir. Son olarak, ilgili ex vivo hücre ve SB tarafından izole sitokinler analizidir örneği. PPD özel T-hücreleri SB yöntemi ile elde edilen phenotypical ve fonksiyonel özellikleri nelerdir iyice başka bir bölümünde2,10,11,16,17, 18 , 19. bu raporu diğer araştırma grupları tarafından bu tekniğin uygulanması kolaylaştırmak için metodoloji, pratik ve immünolojik yönünü amaçlamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Kutanöz antijen-geri çekme modelleri insan hafızası yanıt içinde vivoçalışmalar için izin. Cilt emme blister (SB) indüksiyon ile birleştirildiğinde, bu model antijen spesifik T-hücreleri temsilcisi hücresel hafıza yanıt yanı sıra sitokin microenvironment in situnadir nüfus için erişilebilirlik sunmaktadır.
Bu rapor kutanöz bir hatırlama, bir SB indüksiyon ve antijen spesifik T-hücrelerinin bir hasat pratik yordamı açıklar. Yöntem örneklemek için tüberkülin cilt testi kim, bu çalışmada önce bir enfeksiyonla karşı Bacillus Calmette-Guerin aşı uygulanan bireylerde antijenik geri çağırmak için kullanılan Mycobacterium tüberküloz. Son olarak, kandan izole hücreler ile karşılaştırıldığında bu örnekleme yöntemi tarafından antijen spesifik Polifonksiyonel CD4 + T hücreleri mevcut yüksek kesirler gösteren multiplex ve akış sitometrik analizleri SB örneklerin örnekleri sağlanır.
Burada açıklanan yöntemi güvenli ve minimal invaziv, her ikisi de doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı vivo içindeeğitim için eşsiz bir fırsat sağlar ve geniş bir hücre-aracılı bağışıklık ve insan ile çalışan araştırmacılar topluluğu için yararlı olabilir aşı geliştirme bağlamında bellek yanıtları.

Sekiz sağlıklı yetişkin gönüllü (Medyan yaş: 30 yıl, aralığı: 26-43 yıl) belgelenen önceki BCG aşı ile (BCG aşısı ortalama zaman: 5.5 yıl, aralığı: 1-30 yıl) dahil edildi. Katılımcılar intradermally günde 3 TST değerlendirme ardından PPD 2 TU ile meydan. SBs 7 günde indüklenen ve günde 8 hasat ve 10 mm delik çapları ile emme blister Chambers'ı kullanarak tüm kabarcıklar yetiştirildik. Yedi bireyler verildi 2 ayrı PPD aşı aynı anda 2 paralel SB indüksiyon tarafından takip aynı kol (birden çok PPD işlemimiz Protokolü1.4 adımda aşağıda ilgili not başvurun). Periferik kan yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından günde 7 plazma ve PBMCs yalıtım için çizilmiştir. Plazma ve sıvı supernatants SBs den-20 ° C'de depolanmış Taze SB hücreleri (SBCs) nigrosine leke ve mikroskobu kullanılarak sayıldı.
Klinik TST yanıt ve SBC verim Şekil 1' de sunulmaktadır. 10,25 mm medyan büyüklüğündeydi TST indurations (aralığı: 0 - 20 mm) ve medyan cep numarası blister başına 50.000 (aralığı: 15.000-210.000 hücreleri, kabarcık sayısı: 15). İki gönüllü klinik yanıt 2 TSTs birini ve 15.000 hücreler/blister bir karşılık gelen düşük toplam hücre verim içinde vardı. Hücre verim TST ortalama klinik Yanıt ile ilişkili (Spearman'ın r 0.643, p = 0.094 =).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Resim 1 : Emme blister hücre verim. (bir) Bu panel bir temsilcisi SBs izole nigrosine lekeli hücrelerinin mikroskopisi 7 gün sonrası-TST kaldırdı gösterir. (b) Bu panel 8 BCG aşısı gönüllü olarak ortalama TST sertlik (mm) ve ortalama hücre verim (n/blister) arasındaki ilişkileri gösterir (kabarcık sayısı = 15). Noktalar tek tek ortalama ölçümleri temsil. Unutmayın ki 0 mm TST sertlik ve bir hücre verim 15.000 2 gönüllü olduğu gibi 2 nokta örtüşmez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Akış sitometrik SB karakterizasyonu göstermek için SBCs 30 yıl önce BCG aşısı olan bir Yaş 43 gönüllü elde edilmiştir ve Mtb. SBCs bilinen hiçbir maruz vardı bir tek blister (İndüksiyon takip izole Sertlik: 1.4 mm/100.000 SBCs). Şekil 2 hücre içi sitokin SBCs karşı PBMCs boyama temsilcisi araziler gösterir.
CD3 + CD4 + CD8-PBMCs kısmını sabit kaldı, ancak bu gönüllü, CD3 + CD4 + CD8-SBCs kısmını unstimulated hücrelerde % 67 > %90 PPD vitro restimulation üzerine yükselmiştir (~ % 51, Şekil 2). Üzerinde %92-in vitro PPD-yanı sıra unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs, efektör bellek türü vardı (CCR7 - CD45RA-, veri gösterilmez). Belirli CD3 + CD4 + CD8 hücreleri PPD-stimülasyon tarafından indüklenen genel kesirler için PBMCs karşılaştırıldığında SBCs olarak yüksek bulundu (33.1 vs. %0,2, unstimulated örnekleri çıkartılır). PBMCs, Polifonksiyonel PPD özel CD3 + CD4 + CD8-hücreler kesirler tüm < %0,05 idi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Resim 2 : SBCs temsilcisi akış sitometresi araziler karşı PBMCs. Panelleri bir ve b göstermek temsilcisi yoğunluğu CD8 + ve CD4 + nüfus (bir) ve araziler unstimulated vs. PPD uyarılmış PBMCs ve (c) SBCs. panelleri b ve d yavaş çizer, hücre içi sitokin (b) PBMCs için PPD uyarılmış CD3 + CD4 + CD8-hücrelerindeki boyama ve (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">lütfen bir daha büyük görmek için buraya tıklayın Bu rakam sürümü.</a>
Beklendiği gibi CD3 + CD4 + CD8-SBCs aktif vivo içindeyüksek oranda upregulated sitokinler (%12), boyama hücreleri tarafından resimli, TNF-α ve IFN γ olmak baskın sitokinler ile vardı. Ancak, PPD-stimülasyon hücreleri salgılayan sitokin bir üçlü veya çift-pozitif doğru kaymıştır IFN γ + TNF-α + IL-2 + (% 17) ve IFN γ + TNF-α + (% 15) profil (Şekil 3b, PBMC profilleri aynı donörden buna karşılık için dahil Şekil 3a). Sitokin ifade profilleri PPD uyarılmış efektör bellek CD4 + T hücre alt kümeleri için (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) sunulan rakamlar 2 ve 3 (veri gösterilmez) CD3 + CD4 + CD8-nüfus için karşılaştırılabilir olduğunu.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Şekil 3: PBMCs karşı CD4 + PPD uyarılmış ve unstimulated SBCs profillere sitokin.  Bu paneller sitokin üretmek için bireysel profilleri göster (bir) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs hücreleri ve (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Çubuklar kesirler antijen spesifik sitokin profilleri unstimulated hücrelerde (beyaz çubukları) ve üzerine bir vitro stimülasyon PPD (renkli çubuklar) ile gösterir.
SB sıvı cilt test sitesinde sitokin microenvironment üzerinde bir bilgi kaynağı keşfetmek için SBs indüklenen 7 gün sonrası-TST (4a rakam) hasat sıvı sitokin düzeyleri ölçüldü. 339 pg/mL, 19 pg/mL ve 1 pg/mL, IFN γ, TNF-α ve IL-2 ortalama düzeyde idi (n = 6). Plazma düzeyleri genellikle çok düşük olduğunu. SBs izole hücreler pro-inflamatuar sitokinlerin ex vivo (Şekil 4b) yüksek düzeyde üretti. 1 gönüllü gelen SBCs titrations öldürücü M. tuberculosis huzurunda 4 gün için kültürlü ± otolog PBMCs. IFN γ seviyeleri > SBCs, PBMCs durum ne olursa olsun içeren kültürde 30-fold daha yüksek.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Şekil 4 : SB sıvı, plazma, sitokin düzeyleri ve MTB -enfekte kültür supernatants. (bir) Bu panel sitokin düzeyleri SB sıvı supernatants ve plazma 6 BCG aşısı gönüllüler gösterir. Çubuklar medyan sitokin düzeyleri gösterir; hata çubukları aralığı temsil eder. (b) Bu panel sitokin düzeyleri supernatants kültürlerden 4 paralel 600 µl ex vivo 4 günlük 1 x 106 PBMCs (siyah çubuklar), 1.75 x 105 SBCs (beyaz çubukları) ve 1 x 106 PBMCs 0,5 veya 1.75 x 10 ile çivili gösterir 5 SBCs (gri bar) Mtbile enfekte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo at JoVE.com

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Burada, bir gösteri emme blister kutanöz geri çekme modeli sağlamak. Model insan vivo içinde edinilmiş bağışıklık yanıtı, örneğin aşı geliştirme bağlamında incelemek basit bir erişim sağlar.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

a-suction-blister-protocol-to-study-human-t-cell-recall-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

11.9K Görüntüleme.  Statens Serum Institut. Burada, bir gösteri emme blister kutanöz geri çekme modeli sağlamak. Model insan vivo içinde edinilmiş bağışıklık yanıtı, örneğin aşı geliştirme bağlamında incelemek basit bir erişim sağlar.

Video: A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Farelerde allojenik CD4 + T hücre Cevapları Eğitim için Kuyruk Cilt Nakli

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Virüslü Ifnar1- / - farelerin Immunoprivileged organlarında Zika virüs özgü T hücreli yanıt-e doğru değerlendirilmesi

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

En iyi duruma getirilmiş Interferon-gamma ELISpot tahlil ölçü birimi T hücre yanıtları sonrasi hipererjik eskiden şiling şimdi domuz modelinde

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...