Wir würden gerne Mads Radmer Jensen für seine praktische und akademische Beratung bedanken; Lau Lindqvist und Kaare Svejstrup für die Bereitstellung von Fachwissen; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt und Solveig W. Harpøth für ihre technische Unterstützung; Das Personal an der Gentofte TB-Ambulanz für ihre Ausbildung in der PPD-Verwaltung; und allen Helfern für die Teilnahme an der Studie. Dieses Projekt wird gefördert durch die Europäische Kommission H2020-Programm [Grant-Nummer TBVAC2020 643381], und wir möchten Konsortialpartner für fruchtbaren Diskussionen danken.

Alle Methoden beschrieben, einschließlich der Verwendung von menschlichen Probanden wurden von der dänischen Ausschuss für Gesundheit Forschungsethik (H-15002988) und der dänischen Datenschutzbehörde (jr.nr. 2015-57-0102) genehmigt. PPD-Datei muss ein zertifiziertes Produkt für den menschlichen Gebrauch zugelassen und in der richtigen Dosierung des Herstellers verabreicht werden. Abweichungen in der Dosierung oder Verabreichung erfordern zusätzliche ethische Zulassungen und freiwillige Einwilligung geben müssen.
(1) Tuberkulin-Hauttest
<ol><li>Der/die freiwillige mündliche und schriftliche Einwilligung einzuholen. Vor der Injektion stellen Sie sicher, dass der/die freiwillige versteht und akzeptiert das Verfahren einschließlich möglichen nachteiligen Auswirkungen. Hinweis: Einschlusskriterien spezifisch für dieses Protokoll sind Alter > 18 Jahre und eine dokumentierte BCG-Impfung. Einschlusskriterien können je nach Fragestellung (d.h., eine zusätzliche Aufnahme Kriterium konnte nachweislich positive TST).</li>
	<li>Verwenden Sie eine fertige Lösung der PPD-Datei für den menschlichen Gebrauch [20 Tuberkulin Einheiten (TU) /mL]. Desinfizieren Sie die Gummikappe ein Fläschchen mit einem Alkoholtupfer.</li>
	<li>Vorbereitung der Injektionsstelle<ol>
<li>Suchen Sie die Injektionsstelle auf der Bauchseite des freiwilligen Unterarm.</li>
		<li>Legen Sie den Arm Palm-Up auf eine glatte Oberfläche und wählen Sie einen Bereich im oberen Drittel des Unterarms, ca. 5-10 cm aus dem Ellenbogengelenk. Bleiben frei von Narben, Venen oder geschädigter Haut.</li>
		<li>Desinfizieren Sie den Bereich mit einem alkoholischen Tupfer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie die PPD-Lösung<ol>
<li>Verwenden Sie eine 1 mL sterile Spritze mit einem 27-30G/short (z.B. 12 mm) Nadel fixiert.</li>
		<li>Vorsichtig mischen und 0,1 mL der PPD-Lösung anstreben. Stellen Sie sicher, dass es keine sichtbaren Luftblasen gibt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Intradermale Injektion PPD Hinweis: Dieser Schritt beschreibt, wie eine einzelne PPD-Ablagerung durchführen, aber mehrere Ablagerungen der PPD-Datei in den gleichen Arm ist möglich. Dies kann jedoch bestimmten ethische Genehmigung verlangen.<ol>
<li>Spannen Sie die Haut und zeigen Sie die Nadel in einem Winkel von 5-15° auf der Haut mit der Fase nach oben.</li>
		<li>Stecken Sie die Spitze der Nadel in der dermalen Schicht der Haut und stellen Sie sicher, dass die Spitze fast durch die Epidermis sichtbar ist.</li>
		<li>Injizieren Sie langsam 0,1 mL PPD-Lösung. Hinweis: Wenn richtig verabreicht, wird eine blasse Papel von 6-10 mm sofort angezeigt. Die Papel verschwindet nach ca. 10 Minuten.</li>
		<li>Wenn Sie zwei oder mehr Ablagerungen, streben Sie eine maximale Trennung (5-10 cm) von der Injektionsstellen ohne dabei ein gutes Stück aus dem Ellenbogen und Handgelenk. Hinweis: Dadurch wird verhindert, dass einen potenziellen Zusammenfluss der Hauttest Antwort und die ununterbrochene Positionierung aus zwei Kammern, Saug.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bewertung der Hautreaktion - Tag 3
<ol><li>Beachten Sie nach 48-72 h die Größe der Hautreaktion. Die Verhärtung (Schwellung) zu messen und nicht das Erythem (Rötung) der Reaktion.</li>
	<li>Ertasten die harte Schwellung mit Fingern und dann markieren Sie die Kanten der Verhärtung mit einem Kugelschreiber. Verwenden Sie ein Lineal, Messen Sie den Durchmesser der Verhärtung und notieren sich das Ergebnis in mm. Hinweis: Eine Lesung der Verhärtung Größe kann die Wahl der Blende Durchmesser für die Ansaugkammer führen.</li>
</ol>(3) Saug-Blister Induktion - Tag 7
<ol><li>Montieren Sie die Saugvorrichtung Einheit. Hinweis: Absaugung Geräteeinheiten sind Vakuumpumpen mit beigefügten Kammern für Saug Blister Induktion. Das Gerät verwendet in dieser Demo wird individuell angefertigt, aber Absaugvorrichtung Einheiten sind auch im Handel erhältlich. Die Pumpe muss im Bereich von-20 bis-40 kPa einstellbar sein und bieten einen stabilen und zuverlässigen Unterdruck. Regionale sollte ethische Zustimmung vor der Durchführung von Experimenten mit dieser Methode.<ol>
<li>Zuerst bereiten Sie den Schöpfraum durch Montage der Bodenplatte Öffnung und der fensterplatte mit der Kammer und der Verbindungsschlauch. Befestigen Sie den Kammer-Anschluss Schlauch dicht an der Vakuumpumpe. Hinweis: Die Kammern sollte auch eine Bodenplatte mit einem Loch für die Blister-Induktion, die für den Kontakt mit der menschlichen Haut geeignet sein sollte, und einer Deckplatte mit einem Fenster, so dass für die visuelle Kontrolle der Blase.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestimmen Sie die optimale Blende Durchmesser der Messblende im Verhältnis zur Größe der Hautreaktion; Je größer die Blende, desto größer die Blase.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut der/des freiwilligen und der Messblende mit Alkoholtupfer.</li>
	<li>Die Haut der Schöpfraum zuordnen.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass der freiwillige Arm bequem aufliegt.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass das Loch in die Bodenplatte der Schöpfraum Überreaktion der PPD-Datei befindet, so dass die Mitte von der Reaktion der Haut sichtbar ist.</li>
		<li>Die Kammer locker mit Gurten sichern: Wenn Unterdruck angewendet wird, wird die Kammer auf der Haut haften und zu behaupten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schalten Sie die Absaugvorrichtung und stellen Sie den Druck auf-20 kPa.</li>
	<li>Erhöhen Sie nach 30 min den Unterdruck bis-25 kPa.</li>
	<li>Nach 60 min weiter erhöhen Sie den Unterdruck bis-30 kPa.</li>
	<li>Halten Sie den Druck auf-30 kPa, bis eine Blase voll ausgebildet wird. Sicherstellen Sie, dass der Unterdruck in diesem Protokoll zur Verfügung gestellt für eine angepasste Instrument spezifisch sind. Es möglicherweise notwendig, den Druck etwas anpassen, wenn das Protokoll in anderen Situationen anwenden. Hinweis: Die Induktionsphase Blister reicht von 60 bis 180 min (1-3 h) mit den tatsächlichen Blasenbildung auftreten innerhalb der letzten 30 min., mörderisches oft mit einem juckenden Gefühl verbunden ist. Die Bläschen können als einzelne oder mehrere verschmelzenden Bläschen auftreten. Wenn Blister Ruptur oder Blutung auftritt, wird empfohlen, die Blister-Induktion zu beenden, indem Sie langsam den Druck freigeben.</li>
	<li>Nachdem die Blase voll ausgebildet ist, lassen Sie den Druck, und entfernen Sie vorsichtig die Ansaugkammer aus der Haut ohne Ruptur der Blase.</li>
	<li>Gelten Sie eine weiche Wundauflage auf der Haut-Umgebung und legen Sie eine harte Kappe (z.B.aus einem Plastikschlauch 50 mL) über die Blase.</li>
	<li>Sichern Sie die Kappe mit allergikerfreundlichen chirurgische Band, gefolgt von einer weiche elastische Bandage.</li>
	<li>Weisen Sie der Freiwilligen, übermäßige körperliche Belastung für die nächsten 12-24 h im Kommandobereich/Blister zu vermeiden.</li>
</ol>4. Ernte der Blister Fluid - Tag 8
<ol><li>Aufdem 8 Tag sanft die schützenden Verband entfernen und die Blister mit Haut Desinfektion Spray zu desinfizieren.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Spritze 2 mL mit einer Nadel 23G Blister-Inhalt zu ernten. Stechen Sie die Nadel in die Spitze/Lateral Seite des Daches Blister und abzusaugen Sie langsam die Flüssigkeit. Berühren Sie den Boden der Kavität, aber achten Sie darauf, die Flüssigkeit zu ernten.</li>
	<li>Bewerben Sie eine Dressing auf dem eingestürzten Blister.</li>
	<li>Übertragen Sie die Blister-Flüssigkeit auf ein steriles Röhrchen. Beachten Sie die Lautstärke.</li>
	<li>Drehen Sie die Blister-Flüssigkeit nach unten bei 600 X g mit einer Tischplatte Zentrifuge für 4 min.</li>
	<li>Den überstand auf eine andere Röhre übertragen und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL Zelle Medium. Hinweis: Die Zellen sind nun bereit für das zählen und weitere Analyse. Überstände können bis zur Verwendung bei-20 bis-80 ° C aufbewahrt werden.</li>
</ol>5. Analysen des Saugens Blister Zellen und Flüssigkeiten
Hinweis: Die Anweisungen für die Analyse von Zellen und Flüssigkeit erhalten Haut saugen Blasen nicht in den Anwendungsbereich dieses Protokolls ist. Um repräsentative Ergebnisse für diesen Bericht zu liefern, wurden jedoch intrazellulären Fleck Flow Cytometry und Multiplex-Analysen durchgeführt. Die Methodik wird nachfolgend kurz beschrieben.
<ol><li>Durchflusszytometrie<ol>
<li>Suspensionen von 1 x 105 frische Zellen isoliert saugen Blasen aus 1 BCG geimpft freiwilligen mit 10 µg/mL PPD zu stimulieren und inkubieren Sie die Zellen bei 37 ° C und 5 % CO2. Gehören Sie unstimulierte Zellen für eine parallele Bebrütung.</li>
		<li>1 x 106 PBMCs 1 BCG geimpft freiwilligen mit 10 µg/mL PPD gewonnenen Suspensionen zu stimulieren und inkubieren Sie die Mischung bei 37 ° C und 5 % CO2. Gehören Sie unstimulierte Zellen für eine parallele Bebrütung.</li>
		<li>Nach 2 h alle Zellen mit Brefaldin A und Monensin zu behandeln und ihnen 6 h bei 37° c inkubieren</li>
		<li>Färben Sie die Zellen mit einer Gruppe von Live/Dead-Fleck-BV510, Anti-CD4-AF780, Anti-CD3-BV421, Anti-CD8-PerCP-Cy5.5, Anti-CCR7-PE, Anti-CD45RA-BV786, Anti-IFN-γ-AF700, Anti-TNF-α-PE-Cy7 und Anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Gehören Sie FMO-Steuerelemente im Bereich PBMC.</li>
		<li>Durchführen einer durchflusszytometrischen Analysis mit einem Durchflusszytometer und analysieren Sie die Ergebnisse mit der entsprechenden Software.</li>
		<li>Tor auf die Zytokin-produzierenden CD3 + CD4 + CD8-Teilmengen mit Hilfe der folgenden gating Strategie: Unterhemden - > tragfähige CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + oder Il-2 +.</li>
		<li>Tor auf Effektor-Speicher-Zell-Populationen mit Hilfe der folgenden gating Strategie: Unterhemden - > tragfähige CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Berechnen Sie einzelne Cytokine Profile mit booleschen gating.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytokine Freigabe Demonstrationen<ol>
<li>Nach einer Demonstration von einem Cytokine release in Vivo, verwenden eine Multiplex-Analyse um zu quantifizieren, die Ebenen von Il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 und IL-13 in aufgetauten Saug Blister Flüssigkeit aus 4 Freiwillige gewonnen.</li>
		<li>Für eine Demonstration eines Zytokin-Release von Zellen entnommen Absaugung Blister Ex Vivo, Verwendung frisch Saug Blister Zellen und PBMCs von 1 BCG geimpft freiwilligen erhalten.</li>
		<li>Die PBMC infizieren und Saug-Blister Zellen mit 100 koloniebildenden Einheiten (KBE) von Mtb -H37Rv und inkubieren sie für 4 Tage.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Multiplex-Analyse um zu quantifizieren, die Ebenen von Il-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 und IL-13 in allen Kultur-Überstände.</li>
		<li>Passen Sie die Messungen über den Assay Berechnungsbereich bis an die Grenze der oberen Berechnung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Manuskript beschreibt eine praktische Verfahren für die Untersuchung des menschlichen Immunsystems Gedächtnis Antworten in Vivo, mit kutanen Antigen Recall und Zelle Ernte durch Induktion von Absaugen Blister. TST wurde als Beispiel intradermale Antigen Ablagerung und BCG-Impfstoff Rückruf verwendet. Schließlich war ein Beispiel für SB Probe Charakterisierung von Strömungsanalyse durchflusszytometrischen und Multiplex Zytokin vorausgesetzt zeigen, dass etwa ein Drittel der SB-Zellen wurden polyfunktionalen antigenspezifischen T-Zellen von den Effektor Erinnerung Phänotyp.
Die entscheidenden Schritte dieses Protokolls gehören die intrakutane Injektionstechnik, Saug Blister-Induktion und der Blister-Punktion. Erstens erfordert eine korrekte intradermale Abscheidung geschultes Personal. Eine falsche Aussage kann zu suboptimalen Ergebnissen führen. PPD ist in der Regel einen bekannten und sicheren kutanen Antigen, sondern seine Zusammensetzung variieren zwischen Herstellern, Begrenzung der Vergleichbarkeit13,20. Dieser Bericht enthält Anweisungen für ein einzelnes intradermale Ablagerung von 2 TU und wahlweise zwei parallele Ablagerungen (2 x 2 TU), die zusätzliche ethische Genehmigung bedürfen. Jedoch haben andere Studien 10 TU verwendet, die die Wahrscheinlichkeit einer starken Haut Reaktion10,21. Während der SB Induktion Schritt werden kleinen schrittweisen Anstieg der Unterdruck das Risiko von Blutungen und Blister Bruch. Die Chancen einer Kontamination mit roten Blutkörperchen oder Leukozyten aus dem Blut sind in der Regel gering2. Die aseptische Punktion Technik verhindert Verkeimung und Vermeidung des Kontakts zwischen der Punktionsnadel und dermalen Blister Boden reduziert Verunreinigungen von Schutt oder resident Hautzellen. Jedoch bevorzugen einige Forscher SB Flüssigkeit zu ernten, durch einen sanften Druck auf punktiert Blister10. Es möglicherweise notwendig, die Septen innerhalb der Blase zu durchbohren. Die SB-Technik selbst ist minimal invasiv; reduzierte SBs heilen ohne Narbenbildung und Infektionen sind sehr selten. 2 jedoch ein gewisses Maß an Hypo-Pigmentierung auftreten und SB Induktion sollte wohl bei Menschen mit einer Geschichte von Kolloid Narbenbildung vermieden werden.
Technische Einschränkungen umfassen niedrige Ergebniszelle Erträge und daher nur begrenzte Möglichkeiten für langfristige Lagerung. Beziehungen zwischen der äußerst Ertrag, klinische TST Reaktionen, Blister Größe und Erythrozyten Kontamination wurde gründlich an anderer Stelle beschrieben,2,10. Die BCG-Rückruf-Experimente hier vorgestellten (Abbildung 1) war die mediane Gesamtausbeute von jeder Blister 50.000, impliziert eine kleine Versuchsanordnung mit diesen Zellen, vor allem, wenn SBCs studierte allein15. Spezifische T-Zell-Population in einer SB-Probe übersteigt jedoch vor allem, was in PBMC-Proben in beide relative und absolute Zellzahlen gefunden wird. Im Beispiel in Abbildung 2dargestellt wurden die Anzahl der Dreifach-positiven PPD-spezifischen T-Zellen in einer Stichprobe von 100.000 SB Zellen mehr als 2 x größer als die Zahl gefunden in 1 x 106 PBMCs vom selben Spender (Daten nicht gezeigt). Eine visuelle Bewertung der TST-Reaktion ist die häufigste klinische Methode für die Bewertung von M. Tuberculosis Speicher. Beachten ist die zugrunde liegende adaptive immunologische Reaktion nicht zur gleichen Zeit wie die klinische Haut Reaktion2,21empor. Nicht alle BCG geimpft oder Mtb-exponierten Individuen entwickeln starke TST Reaktionen und Strategien für die Klassifizierung und eine Handhabung von Proben aus TST non-Responder, sowie eine bereits vorhandene mykobakteriellen Sensibilisierung in der Studienpopulation vor der Einleitung einer Rückruf-Studie mit dieser Methode berücksichtigt werden müssen. Auch in SB-Probenahme und visuelle Bewertung, gibt es ein Potenzial für eine theoretische Bias bei Personen mit reduzierten Haut Reaktionen aufgrund von globalen oder hautverwandt Immunität beeinträchtigt, wie z. B. HIV-Infektion und bestimmte Altersgruppen2gesehen, 13,18,20. Darüber hinaus ist eine immunologische Steigerung der TST Reaktion mit umfassender Tests bekannt20,22. Die SB-Zelle-Phänotypen allerdings bleiben eher konstant, wenn TSTs wiederholte10sind. Diese Beobachtung unterstützt die Rolle von SB-Rückruf bei Längsschnittstudien der zellulären Immunantwort.
T-Zell-Immunologen ermöglicht eine SB-Rückruf für die Ernte von hohen Bruchteile von Antigen-spezifischen Zellen. Das Timing der SB für eine Stichprobe aus einer PPD-Ablagerung ist jedoch entscheidend, da die zelluläre Zusammensetzung und das Zytokin Mikroumgebung im Laufe der Zeit ändern. In diesem Protokoll Bläschen waren induzierte Post-7-Tage-Challenge und die isolierten Zellen waren in erster Linie Effektor Speicher CD4 + T-Zellen einschließlich hohe Bruchteile von Zellen mit einem Co-Ausdruck von IFN-γ, TNF-α und Il-2. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit früheren Studien, die beschreiben, wie T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Differenzierung erfolgt im PPD-vorbereitete Haut2,15,21. Kinetische SB Studien bei PPD sensibilisiert Menschen deuten darauf hin, dass die sehr frühe Haut Reaktion unspezifische; aber bereits innerhalb der ersten Tage nach der PPD-Challenge, die Antwort wird dominiert von CD4 + T-Zellen (beide zentralen Speicher und Effektor Speicher Phänotypen sind beschrieben worden), und nach 3 Tagen, die Antwort ist geprägt durch hohe Bruchteile von PPD-spezifischen Cytokine Produktion von CD4 + T-Zellen2,8,10,15,21. Diese adaptive Zytokin-Antwort bleibt für mehr als 2 Wochen2,8,10,23nachweisbar. 7. Tag Post-TST scheint der optimale Zeitpunkt für die Sammlung der Cytokine Produktion Memory CD4 + T-Zellen2sein. Jedoch können andere Zeitpunkte natürlich je nach Antigen und Antwort von Interesse relevant sein. Der Hinweis in einer Studie berichtet die Anpassungsreaktion PPD ein wenig früher mit einem Rückgang der Pro-inflammatorische Zytokin-Sekretion bereits bei 5 Tage Post-TST10einen Höchstwert.
SB-Flüssigkeit enthält hohe Konzentrationen von Pro-inflammatorischen Zytokinen und anderen Proteinen, die repräsentativ für die Haut Mikroumgebung15,24gezeigt. Kinetik-Studien haben gezeigt, dass TNF-α und IFN-γ Ebenen in SB Fluid Höhepunkt nach 3 Tagen beim IL-2 Ebenen Gipfel nach 7 Tage2,10, wahrscheinlich spiegelt die Dominanz der adaptive Reaktionen zu diesem späteren Zeitpunkt. Da SB Zellen aktiviert in Vivowurden, weisen sie eine hohe spontane Zytokin-Version sowie ein Potenzial für eine bestimmte Version auf Restimulation (Abbildung 3 und 4).
Dieser Bericht konzentriert sich auf CD4 + T-Zell-Immunität. Wie in Abbildung 2gezeigt hat es waren in der Tat die Mehrzahl der isolierten T-Zellen CD4 +, zwar gab es fast keine CD8 + T-Zellen in den sog blister Flüssigkeit. Dies steht im Einklang mit anderen SB PPD-Rückruf Studien berichten von geringen Anteilen und einer minderwertigen wandernden Kapazität von CD8 + T-Zellen im Vergleich zu CD4 + T Zellen2,8,10,23. Eine weitere Charakterisierung der CD8 + Beitrag wäre vorzuziehen; Dies ist jedoch den Rahmen dieses Berichts sprengen.
T-Zellen sind essentiell für die immun Kontrolle der Mtbbetrachtet; Allerdings ist es schwierig, eine zuverlässige Korrelat des Schutzes spiegelt sich in der adaptiven Immunantwort vom Blut25,26zu identifizieren gewesen. Dieses Hindernis behindert stark die Entwicklung neuer TB Impfstoffe, da gibt es derzeit keine Alternative zu großen und sehr teuren Wirksamkeit Studien27. TB-Impfstoff-Entwickler bestimmen Impfstoff Immunogenität durch die Beurteilung kleiner und vorübergehender Veränderungen in der Impfstoff-spezifische T-Zell-Populationen in der Blut-28,-29. Es ist jedoch fraglich, ob die kleine Bruchteil der zirkulierenden Antigen-spezifische T-Zellen im Blut gefunden relevant ist (d. h.in der Lage, die Migration auf die Website einer Infektion und repräsentativ für die T-Zelle-reiche Mikroumgebung Steuerung Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basierend auf früheren Studien und die enthaltenen Daten, stellt das SB-kutanen Rückruf-Modell ein ungenutztes Potenzial für die Untersuchung der Impfstoff-spezifische T-Zellen. Nicht nur ermöglicht das Modell einen Rückruf von einem Impfstoff Antwort generiert vor Jahrzehnten, sondern ermöglicht auch die Bewertung der wahre Erinnerung Potenzial in einem Gewebe-spezifischen Kontext15,18,19,21. Roman, spezifische Hauttests, die Antigene auch umfasste der Kandidat Untereinheit TB Impfstoffe enthalten, schlagen neue Möglichkeiten für die Impfstoff-Bewertung mit diesem Modell28,32. Darüber hinaus transkriptomischen Analysen legen nahe, dass eine Zelle – Immunantwort erzeugt in PPD-herausgefordert Haut, die Antwort gefunden in der Mtb ähnelt-infizierten Lunge18.
Während Haut stanzbiopsien auch für eine Zelle Ernte aus der Haut ermöglichen und Raumdaten, verglichen mit SB-Sampling, die Methode ist mehr invasiv und erfordert eine enzymatische oder mechanische Verarbeitung, einzellige Suspensionen33vorzubereiten. Messung der Zytokine und Zelle Marker ist vergleichbar zwischen den beiden Methoden2,10.
Die Saug Blister-Methode hat bereits in vielen Bereichen der medizinischen Forschung neben Dermatologie, entweder allein oder in Kombination mit einer systemischen oder lokalen Haut Herausforderung angewendet. Beispiele hierfür sind Studien zur Sepsis, Epstein - Barr-Virus-verbundene Lymphoproliferative Krankheit, Diabetische Neuropathie, Glukokortikoid Aufnahme Effekte und Studien am Menschen Testen von therapeutischen Antikörpern oder Modelle für T-Zelle-gezielte Therapien10 ,34,35,36,37,38.
Aus therapeutischer Sicht die SB-kutanen Rückruf-Methode bietet einzigartige Vorteile den zentrale T-Zell-Speicher mögliche studieren und -aus beiden biologischen und technischen Standpunkt aus betrachtet-die Haut scheint eine entsprechende Probenahme Fach2, 15,18,19,21. Insbesondere kann im Vergleich zu traditionellen, passive Probenahme des zirkulierenden PBMCs, die SB-kutanen Rückruf-Methode für das Studium der T-Zellen, die nachweislich die Fähigkeit zum Migrieren von den Lymphknoten als Reaktion auf ihre relevanten Antigen, und füllen Sie die lokale Erweiterung und Differenzierung in einem gewebespezifischen in Vivo Kontext15,18,19,21.
Abschließend zeigte das Modell hier für Forscher auf dem Gebiet der menschlichen adaptiven Immunität und T-Zell-targeting Agenten (d. h.in der ansteckenden Krankheit Vaccinology oder Krebs) relevant sein können. Die TST-Modell in diesem Protokoll angewendet ist natürlich von besonderer Bedeutung auf dem Gebiet der TB Impfstoffentwicklung. Das Grundkonzept dieses Modells ist jedoch in anderen Bereichen der Forschung sehr zutreffend.

Ein Haut-SB ist eine künstlich herbeigeführte Blister, die für die Ernte von Zellen und Flüssigkeit direkt von der Haut ermöglicht. Die Technik der Erhöhung der SBs durch Vakuum ist eine bekannte Tool auf dem Gebiet der Dermatologie verwendet für die Untersuchung der Haut Immunologie in Gesundheit und Krankheit1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. dieser Bericht zeigt, wie die SB-Technik in Kombination mit kutanen Antigenen Rückruf (SB-kutanen Rückruf-Methode) direkte Einblicke in adaptive Immunantworten in Vivoliefern kann.
Das Prinzip hinter der SB-Induktion ist einfach: ein leichtes Vakuum auf einen kleinen Bereich der Haut angewendet wird. Der Unterdruck wird schließlich die Epidermis von der Dermis, erstellen eine lokale Blase gefüllt mit Flüssigkeit und Zellen1,2,9trennen zwingen. Die Blister-Flüssigkeit durch eine Feinnadelpunktion geerntet werden kann und die Inhalte können für weitere Studie in Vitroverwendet werden.
In den letzten Jahren gab es ein zunehmendes Interesse in der SB-Methode für die Untersuchung von in Vivo Immunantworten als Krankheiten, die auf die Haut10,11beschränkt. Die Studie der adaptiven Immunität beim Menschen ist durch die Tatsache begrenzt, dass die Zellen und Zytokine von Interesse aus dem peripheren Blut abgetastet werden, weil eine invasive Probenahme von Lymphknoten oder Magen-Darm-Schleimhaut möglicherweise nicht akzeptabel und unethisch. Ein Beispiel ist das Studium der langlebigen menschlichen Gedächtnisses T-Zell-Reaktionen nach Impfung12. In solchen Studien kann die Probenahme von entsprechenden T-Zellen eine große Herausforderung, weil die Population der betreffenden Zellen, die Immunität zu vermitteln im lymphatischen Gewebe befindet sich, und nur eine sehr begrenzte Anzahl von spezifischen T-Zellen im peripheren Blut zirkulieren.
Die SB-Technik bietet eine einzigartige Gelegenheit zum Studium der Memory T-Zellen und andere spezifische Zellpopulationen. Im Anschluss an die kutane Impfung von Antigen T-Zellen spezifisch für das Antigen werden auf die Haut von ihrer lymphatischen Hideaways rekrutiert und probieren Sie einfach aus dem SB. Die Methodik und Forschung Anwendungen dieses kutanen Rückruf-Modells wurden von Akbar Et Al. beschrieben. in 20132. Eine häufig verwendete Antigen für Haut Rückruf ist der im Handel erhältlichen gereinigtes Protein-Derivat (PPD) von Mykobakterien verwendet, um ein Tuberkulin-Hauttest (TST)13durchzuführen wo PPD in der dermalen Schicht der Haut injiziert. Bei Personen mit einer bestehenden immunologisches Gedächtnis zu PPD [z.B., Personen mit Mycobacterium Tuberculosis (Mtb) Infektion oder eine vorherige Impfung Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], die Antigen-Ablagerung führt zu einer erinnern Sie Reaktion bei der Migration auf die Haut und eine in Vivo klonalen Expansion der PPD-spezifische CD4 + T-Zellen2,11,14,15. Folglich sammeln hohe Bruchteile von PPD-spezifische polyfunktionalen CD4 + T-Zellen in der Haut bereit für die SB-Probenahme. T-Zellen, die mit dieser Methode gesammelt haben sich als robust erwiesen und sind ausreichend reichlich, geprägt durch eine Reihe von Immunoassays und eine langfristige in-vitro- Kultur15. So das kutane Rückruf-Modell und die SB-Induktion erweisen eine wertvolle Methode, um in Vivo T-Zell-Antworten von ex-Vivo -Analysen zu studieren, und mehr wissen dieses Ansatzes kann Forscher mit Interessen in der zellulären Immunologie profitieren und Impfstoffentwicklung.
Dieser Bericht enthält die ersten schrittweise Anleitung zum Menschenhaut Saug Bläschen im PPD injiziert Haut zu induzieren. Das Kutane Antigen-Rückruf-Modell wird mit der TST bei BCG-geimpften Probanden demonstriert. Schließlich ist die relevanten ex-Vivo -Analyse der Zellen und Zytokine durch SB isoliert beispielhaft. Phänotypische und funktionelle Eigenschaften von PPD-spezifischen T-Zellen durch die SB-Methode abgerufen werden gründlich an anderer Stelle beschrieben,2,10,11,16,17, 18 , 19. Ziel dieses Berichts ist es, die praktische und immunologische Aspekte der Methodik, die Anwendung dieser Technik von anderen Forschergruppen erleichtern zu diskutieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Kutane Antigen-Rückruf Modelle erlauben für Studien des menschlichen Gedächtnisses Antworten in Vivo. In Verbindung mit Haut Saug Blister (SB) Induktion bietet dieses Modell Zugänglichkeit zu selten Populationen von antigenspezifischen T-Zellen Vertreter des zellgedächtnisses Reaktion sowie das Zytokin Mikroumgebung in Situ.
Dieser Bericht beschreibt das praktische Verfahren der kutanen Rückruf, ein SB-Induktion und eine Ernte von antigenspezifischen T-Zellen. Um die Methode zu veranschaulichen, dient der Tuberkulin-Hauttest Antigenen Rückruf bei Personen, die vor dieser Studie wurde eine Bacillus Calmette-Guérin-Impfung gegen eine Infektion mit Mycobacterium Tuberculosis. Zu guter Letzt vorgesehen sind, Beispiele für Multiplex und Flow durchflusszytometrischen Analyse der SB Exemplare illustrieren hohe Bruchteile von antigenspezifischen polyfunktionalen CD4 + T-Zellen zur Verfügung durch dieses Sampling-Methode im Vergleich zu Zellen aus dem Blut isoliert.
Die hier beschriebene Methode ist sicher und minimal-invasive, bietet eine einzigartige Gelegenheit, sowohl angeborene und adaptive Immunantworten in Vivozu studieren und kann vorteilhaft sein, einer breiten Gemeinschaft von Forschern, die mit zellvermittelte Immunität und Mensch Speicher-Antworten im Zusammenhang mit der Entwicklung von Impfstoffen.

Acht Erwachsene Probanden (Durchschnittsalter: 30 Jahre reichen: 26-43 Jahre) mit einer dokumentierten frühere BCG-Impfung (mediane Zeit von BCG-Impfung: 5,5 Jahre reichen: 1-30 Jahre) waren im Preis inbegriffen. Die Teilnehmer waren mikrodialysemembranen mit 2 TU PPD, gefolgt von einer TST-Bewertung am 3. Tag herausgefordert. SBs wurden am 7. Tag induzierte am 8. Tag geerntet und alle Bläschen waren mit Saug Blister Kammern mit 10 mm Bohrung Durchmesser angehoben. Sieben Personen erhielten 2 separate PPD Impfungen gleichzeitig in den gleichen Arm, gefolgt von 2 parallelen SB Induktionen (siehe den Hinweis auf mehrere PPD Ablagerungen unter Schritt 1.4 im Protokoll). Peripheren Blut wurde am 7. Tag für Plasma und einem PBMCs Isolation durch Dichte-Gradienten-Zentrifugierung gezogen. Plasma und Flüssigkeit Überstände von SBs wurden bei-20 ° c gelagert. SB-Frischzellen (SBCs) wurden gezählt mit nigrosin Fleck und Mikroskopie.
Die klinische TST Reaktionen und SBC Ertrag sind in Abbildung 1dargestellt. Die mittlere Größe der TST Verhärtungen war 10,25 mm (Bereich: 0 - 20 mm) und die mittlere Zellzahl pro Blister war 50.000 (Reichweite: 15.000-210.000 Zellen, Anzahl der Bläschen: 15). Zwei der freiwilligen hatte kein klinisches Ansprechen in entweder 2 TSTs und einer entsprechenden niedrigen Ergebniszelle Ausbeute von 15.000 Zellen/Blister. Die Zellausbeute war verbunden mit der mittlere klinische Antwort der TST (Spearmans R = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Abbildung 1 : Absaugung Blister Zellausbeute. (ein) zeigt dieses Panel einem Vertreter Mikroskopie nigrosin-gefärbten Zellen isoliert von SBs 7 Tage Post-TST angehoben. (b) dieses Panel zeigt Beziehungen zwischen den mittleren TST Verhärtung (mm) und die mittlere Zellausbeute (n/blister) bei 8 BCG-geimpften Probanden (Anzahl der Bläschen = 15). Die Punkte stehen für mittlere Einzelmessungen. Bitte beachten Sie, dass 2 Punkte überlappen, da beide 2 Freiwillige eine TST-Verhärtung von 0 mm und einer Zelle Ausbeute von 15.000 hatte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Um die Strömung durchflusszytometrischen SB Charakterisierung zu demonstrieren, SBCs stammen aus freiwilliger 43-j hrige, die BCG geimpft 30 Jahre früher gewesen und hatte keine bekannten Exposition zu Mtb. die SBCs wurden isoliert nach der Induktion von einem einzigen Blister ( Verhärtung: 1,4 mm/100.000 SBCs). Abbildung 2 zeigt repräsentative Grundstücke der intrazellulären Zytokin Färbung der die SBCs versus PBMCs.
In dieser freiwilligen der Bruchteil der CD3 + CD4 + CD8-SBCs stieg von 67 % in unstimulierte Zellen auf > 90 % bei einer PPD in Vitro Restimulation, während der Anteil der CD3 + CD4 + CD8-PBMCs konstant geblieben (~ 51 %, Abbildung 2). Mehr als 92 % der in-vitro- PPD-, als auch die unstimulierte CD3 + CD4 + CD8-SBCs, waren die Effektor-Speicher-Typ (CCR7 - CD45RA-, Daten nicht gezeigt). Die allgemeine Brüche bestimmter CD3 + CD4 + CD8-Zellen induziert durch PPD-Stimulation lagen in der SBCs im Vergleich zu der PBMCs (33,1 Vs. 0,2 %, unstimulierte Proben abgezogen). In der PBMCs wurden die Fraktionen von polyfunktionalen PPD-spezifische CD3 + CD4 + CD8-Zellen alle < 0,05 %.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative Flow Cytometry Grundstücke SBCs im Vergleich zu PBMCs. Paneele ein und b zeigen repräsentative Dichte unstimulierte Grundstücke CD8 + und CD4 + Populationen in (einem) Vs. PPD-stimulierten PBMCs und (c) SBCs. Platten b und d langsam Grundstücke der intrazellulären Zytokin Färbung in PPD-stimulierten CD3 + CD4 + CD8-Zellen (b) PBMCs und (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Wie erwartet, waren CD3 + CD4 + CD8-SBCs aktivierten in Vivo, illustriert durch einen hohen Anteil der Zellen Beflecken für hochreguliert Zytokine (12 %), mit der vorherrschenden Zytokine, TNF-α und IFN-γ. Doch nach PPD-Stimulation, die Cytokine sezernierenden Zellen verschoben in Richtung ein Triple - oder Doppel-positiven TNF-α, IFN-γ + IL-2 + (17 %) und IFN-γ + TNF-α + (15 %) Profil (Abb. 3 b, PBMC Profile vom selben Spender gehören zum Vergleich in Abbildung 3a). Die Zytokin-expressionsprofile für PPD-stimulierten Effektor Speicher CD4 + T-Zelle Teilmengen (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) waren vergleichbar mit der CD3 + CD4 + CD8-Bevölkerung in den Abbildungen 2 und 3 (Daten nicht gezeigt) vorgestellt.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Abbildung 3: Cytokine Profile für CD4 + PPD angeregt und unstimulierte SBCs versus PBMCs.  Diese Tafeln zeigen individuelle Profile für die Herstellung von Zytokin (ein) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs Zellen und (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Die Balken repräsentieren Bruchteile von Antigen-spezifischen Cytokine Profile in unstimulierte Zellen (weiße Balken) und auf eine in-vitro- Stimulation mit PPD (farbige Balken).
Zur Erkundung die SB-Flüssigkeit als eine Quelle von Informationen auf der Zytokin-Mikroumgebung an der Stelle der Haut testen, wurden die Zytokin-Ebenen in Flüssigkeit geerntet von SBs induzierten 7 Tage Post-TST (Abbildung 4a) gemessen. Die mittlere Höhe der IFN-γ, TNF-α und Il-2 wurden 339 Pg/mL, 19 Pg/mL und 1 Pg/mL, bzw. (n = 6). Die Plasmaspiegel waren im Allgemeinen sehr gering. Zellen, die isoliert von SBs produziert hohe Pro-inflammatorischen Zytokinen ex Vivo (Abbildung 4 b). Titrationen SBCs von 1 Freiwillige waren für 4 Tage im Beisein von virulenten M. Tuberculosis kultiviert ± autologe PBMCs. Die IFN-γ lagen > in Kulturen mit SBCs, unabhängig vom Vorhandensein von PBMCs 30-fache höher.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Abbildung 4 : Zytokin Ebenen in SB Flüssigkeit, Plasma, und MTB -Kultur Überstände infiziert. (ein) zeigt dieses Panel Zytokin Ebenen in SB Fluid Überstände und Plasma von 6 BCG-geimpften Probanden. Die Balken repräsentieren die mediane Zytokin Ebenen; die Fehlerbalken darstellen den Bereich. (b) zeigt dieses Panel Zytokin Ebenen in Überstände aus 4 parallelen 600 µl ex Vivo 4-tägigen Kulturen von 1 x 106 PBMCs (schwarze Balken), 1,75 x 10,5 SBCs (weiße Balken) und 1 x 106 PBMCs gespickt mit 0,5 oder 1,75 x 10 5 SBCs (graue Balken) mit Mtbinfiziert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Hier bieten wir eine Demonstration des Modells Saug Blister kutanen erinnern. Das Modell ermöglicht einen einfachen Zugang zu menschlichen in-Vivo adaptive Immunantworten, zum Beispiel im Rahmen der Entwicklung von Impfstoffen zu studieren.

Ein Saug Blister-Protokoll, menschliche T-Zelle Recall Antworten In Vivo zu studieren

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

11.9K Aufrufe.  Statens Serum Institut. Hier bieten wir eine Demonstration des Modells Saug Blister kutanen erinnern. Das Modell ermöglicht einen einfachen Zugang zu menschlichen in-Vivo adaptive Immunantworten, zum Beispiel im Rahmen der Entwicklung von Impfstoffen zu studieren.

Serie: A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

Die Verwendung von fluoreszierenden Ziel Arrays zur Beurteilung der T-Zell-Antworten<em&gt; In-vivo-</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolierung von Salmonella Typhimurium-mit Phagosom von Makrophagen

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Bewertung der Zika-Virus-spezifischen T-Zell-Reaktionen in Organe der Immunabwehr von infizierten Ifnar1- / - Mäusen

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...