Vorremmo ringraziare Mads Radmer Jensen per i suoi consigli pratici e accademici; Lau Lindqvist e Kaare Svejstrup per consulenza tecnica; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt e Solveig W. Harpøth per la loro assistenza tecnica; il personale presso l'ambulatorio di Gentofte TB per la loro formazione in amministrazione PPD; e tutti i volontari per la partecipazione allo studio. Questo progetto è finanziato dal programma europeo Commissione H2020 [concessione numero TBVAC2020 643381], e vorremmo ringraziare i partner del Consorzio per le discussioni fruttuose.

Tutti i metodi descritti di seguito, compreso l'uso di volontari umani, sono stati approvati dal Comitato Danese Health Research Ethics (H-15002988) e l'Agenzia danese per la protezione dei dati (jr.nr. 2015-57-0102). PPD deve essere un prodotto certificato approvato per uso umano e somministrato entro il dosaggio corretto fornito dal produttore. Qualsiasi deviazione nel dosaggio o amministrazione può richiedere ulteriori approvazioni etiche e volontari devono dare il consenso informato.
1. pelle della tubercolina
<ol><li>Ottenere il consenso informato scritto e orale da volontario. Prima dell'iniezione, assicurarsi che il volontario capisce e accetta la procedura inclusi i possibili effetti negativi. Nota: Criteri di inclusione specifici di questo protocollo sono età > 18 anni e una documentata vaccinazione di BCG. Criteri di inclusione possono variare a seconda della domanda di ricerca (cioè, un criterio di inclusione aggiuntiva potrebbe essere la prova di TST positivo).</li>
	<li>Utilizzare una soluzione già pronta di PPD per uso umano [20 unità (TU) di tubercolina /mL]. Disinfettare il tappo di gomma del flaconcino utilizzando un tampone imbevuto di alcool.</li>
	<li>Preparare il sito di iniezione<ol>
<li>Individuare il sito di iniezione sul lato ventrale dell'avambraccio del volontario.</li>
		<li>Posizionare il braccio palm-up su una superficie piana e scegliere un'area sul terzo superiore dell'avambraccio, circa 5-10 cm dal giunto del gomito. Soggiorno chiaro di cicatrici, vene o pelle danneggiata.</li>
		<li>Disinfettare la zona utilizzando un tampone alcolico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di PPD<ol>
<li>Utilizzare una siringa da 1 mL sterile con un 27-30G/breve (ad esempio, 12 mm) fissata dell'ago.</li>
		<li>Delicatamente mescolare e aspire 0,1 mL della soluzione di PPD. Assicurarsi che non vi siano nessun bolle visibile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniezione intradermica di PPD Nota: Questo passaggio viene descritto come eseguire una singola deposizione di PPD, ma più deposizioni di PPD nel braccio stesso è possibile. Tuttavia, questo può richiedere specifica approvazione etica.<ol>
<li>Tendere la pelle e scegliere l'ago con un angolo di 5-15° la pelle con lo smusso rivolto verso l'alto.</li>
		<li>Inserire la punta dell'ago nello strato dermico della pelle e assicurarsi che la punta è quasi visibile attraverso l'epidermide.</li>
		<li>Iniettare lentamente 0,1 mL di soluzione PPD. Nota: Se somministrato correttamente, verrà visualizzato immediatamente una papula pallida di 6-10 mm. La papula scomparirà dopo circa 10 min.</li>
		<li>Quando si effettuano due o più deposizioni, obiettivo per una massima separazione (5-10 cm) i siti di iniezione, mantenendo in una buona distanza dalla zona di gomito e polso. Nota: Questo impedisce una potenziale confluenza della risposta test cutaneo e permette il posizionamento ininterrotto di due alloggiamenti di aspirazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. valutazione della reazione della pelle - giorno 3
<ol><li>Dopo 48-72 h, notare le dimensioni della reazione della pelle. Misurare l'indurimento (il gonfiore) e non l'eritema (il rossore) della reazione.</li>
	<li>Palpare il duro gonfiore usando le dita e quindi contrassegnare i bordi dell'indurimento utilizzando una penna a sfera. Usare un righello per misurare il diametro di indurimento e annotare il risultato in millimetri. Nota: Una lettura della dimensione indurimento può guidare la scelta del diametro dell'orifizio per la camera di aspirazione.</li>
</ol>3. aspirazione Blister induzione - giorno 7
<ol><li>Montare l'unità di dispositivo di aspirazione. Nota: Unità di dispositivo di aspirazione sono pompe per vuoto con annesso chambers per induzione aspirazione blister. Il dispositivo utilizzato in questa dimostrazione è personalizzato, ma unità di dispositivo di aspirazione sono anche disponibili in commercio. La pompa deve essere regolabile all'interno della gamma da-20 a-40 kPa e fornire una pressione negativa costante e affidabile. Approvazione etica regionale deve essere ottenuto prima conducendo esperimenti utilizzando questo metodo.<ol>
<li>In primo luogo, preparare la camera di aspirazione assemblando la piastra di orifizio inferiore e la finestra con la camera e il tubo di collegamento. Collegare il tubo di collegamento camera strettamente alla pompa del vuoto. Nota: Le camere dovrebbero includere una piastra inferiore con un foro per l'induzione della bolla, che dovrebbe essere adatto al contatto con la pelle umana, e una piastra superiore con una finestra, consentendo il monitoraggio visivo del blister.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Determinare il diametro dell'orifizio ottimale il diaframma rispetto alle dimensioni della reazione della pelle; maggiori sono le dimensioni dell'orifizio, la più grande bolla.</li>
	<li>Disinfettare il diaframma e la pelle del volontario utilizzando tamponi imbevuti di alcool.</li>
	<li>Fissare la camera di aspirazione per la pelle.<ol>
<li>Assicurarsi che il braccio del volontario sta riposando tranquillamente.</li>
		<li>Assicurarsi che il foro nella piastra di fondo della camera di aspirazione è situato sopra la reazione di PPD affinché il centro della reazione della pelle è visibile.</li>
		<li>Fissare la camera senza bloccare usando cinghie: quando viene applicata pressione negativa, la camera di aderire alla pelle e mantenere la sua posizione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Accendere il dispositivo di aspirazione e regolare la pressione di-20 kPa.</li>
	<li>Dopo 30 min, aumentare la pressione negativa di-25 kPa.</li>
	<li>Dopo 60 min, aumentare ulteriormente la pressione negativa di-30 kPa.</li>
	<li>Mantenere la pressione a-30 kPa fino a quando un blister è completamente formato. Garantire che le pressioni negative fornite in questo protocollo sono specifiche per uno strumento personalizzato. Può essere necessario regolare la pressione leggermente quando si applica il protocollo in altre impostazioni. Nota: La fase di induzione della bolla varia da 60 a 180 min (1-3 h) con la formazione di effettivo della bolla che si verificano entro gli ultimi 30 min che rigonfiamento è spesso associata a una sensazione di prurito. Le bolle possono verificarsi come bolle di fusione singole o multipla. Se la rottura della bolla o l'emorragia si verifica, si consiglia di terminare l'induzione della bolla rilasciando lentamente la pressione.</li>
	<li>Dopo il blister è completamente formato, rilasciare la pressione e rimuovere accuratamente la camera di aspirazione dalla pelle senza rompersi il blister.</li>
	<li>Applicare una medicazione morbida sulla zona di pelle circostante e mettere un cappello rigido (ad esempio, da un tubo di plastica da 50 mL) sopra il blister.</li>
	<li>Fissare il tappo con nastro chirurgico anallergici, seguita da un bendaggio elastico morbido.</li>
	<li>Istruire il volontario per evitare l'eccessivo sforzo fisico sulla zona della bolla per il prossimo 12-24h.</li>
</ol>4. raccolta del liquido della bolla - giorno 8
<ol><li>L'8° giorno, delicatamente rimuovere la medicazione protettiva e disinfettare il blister con spray di disinfezione della pelle.</li>
	<li>Utilizzare una siringa sterile da 2 mL con un ago di 23G per raccogliere il contenuto della bolla. Inserire l'ago nel lato superiore e laterale del tetto della bolla ed aspirare lentamente il liquido. Evitare di toccare il pavimento della cavità, ma assicuratevi di raccogliere tutto il liquido.</li>
	<li>Applicare una medicazione sul blister compresse.</li>
	<li>Trasferire il liquido della bolla in una provetta sterile. Nota il volume.</li>
	<li>Girare il liquido della bolla giù a 600 x g usando una centrifuga da tavolo per 4 min.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in un'altra provetta e risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di terreno cellulare. Nota: Le cellule sono ora pronte per il conteggio e ulteriori analisi. Surnatanti possono essere conservati a -20 a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>5. analisi di aspirazione Blister cellule e fluidi
Nota: Con le istruzioni necessarie per l'analisi delle cellule e il liquido ottenuto da aspirazione bolle della pelle non è nell'ambito del presente protocollo. Tuttavia, al fine di fornire risultati rappresentativi per la presente relazione, macchia intracellulare flusso cytometry e multisala analisi sono state eseguite. La metodologia è descritta in breve qui di seguito.
<ol><li>Citometria a flusso<ol>
<li>Stimolare le sospensioni di cellule fresche di 1 x 105 isolate da aspirazione blister da 1 volontario di BCG vaccinati con 10 µ g/mL di PPD e incubare le cellule a 37 ° C e 5% CO2. Sono cellule non stimolate per un'incubazione di parallela.</li>
		<li>Stimolare sospensioni 1 x 106 PBMCs ottenuti da 1 volontario di BCG vaccinati con 10 µ g/mL di PPD e incubare la miscela a 37 ° C e 5% CO2. Sono cellule non stimolate per un'incubazione di parallela.</li>
		<li>Dopo 2 h, trattare tutte le celle con Brefaldin A e monensin e li Incubare per 6 h a 37° C.</li>
		<li>Macchia le celle con un pannello di Live/Dead-macchia-BV510, anti-CD4-AF780, anti-CD3-BV421, anti-CD8-PerCP-Cy 5.5, anti-CCR7-PE, anti-CD45RA-BV786, anti-IFN-γ-AF700, anti-TNF-α-PE-Cy7 e anti-IL-2-FITC.</li>
		<li>Includono FMO controlli nel pannello di PBMC.</li>
		<li>Eseguire un'analisi cytometric di flusso con un citometro a flusso e analizzare i risultati utilizzando il relativo software.</li>
		<li>Cancello il CD3 + CD4 + CD8-sottoinsiemi producenti citochina utilizzando la seguente strategia di gating: Canottiere - > vitali CD3 + - > CD4 + CD8 - - > IFN-γ +, TNF-α + o il-2 +.</li>
		<li>Cancello su popolazioni di cellule effettrici memoria utilizzando la seguente strategia di gating: Canottiere - > vitali CD3 + - > CD4 + CD8 - - > CCR7 - CD45RA-.</li>
		<li>Calcolare i profili di cytokine individuali usando gating booleano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dimostrazioni di rilascio di citochine<ol>
<li>Per una dimostrazione di una citochina rilascio in vivo, utilizzare un'analisi multiplex per quantificare i livelli del-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 nel liquido della bolla di aspirazione scongelati ottenuto da 4 volontari.</li>
		<li>Per una dimostrazione di un rilascio di citochine dalle cellule ottenute da aspirazione vesciche ex vivo, uso fresco aspirazione blister cellule e PBMC ottenuti da 1 volontario vaccinati BCG.</li>
		<li>Infettare i PBMC e cellule di blister con 100 unità formanti colonie (CFU) di Mtb H37Rv di aspirazione e loro Incubare per 4 giorni.</li>
		<li>Utilizzare un'analisi multiplex per quantificare i livelli del-2, IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-13 in tutti i surnatanti della cultura.</li>
		<li>Regolare le misure sopra la gamma di calcolo analisi al limite superiore di calcolo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo manoscritto descrive una procedura pratica per lo studio della memoria immunitaria umana responses in vivo, utilizzando antigene cutaneo delle cellule e richiamo raccolto tramite induzione aspirazione blister. TST è stato utilizzato come esempio di deposizione di antigene intradermica e richiamo del vaccino di BCG. Infine, un esempio di SB esemplare caratterizzazione mediante analisi di flusso cytometric e multisala citochina è stata fornita, che dimostrano che circa un terzo delle cellule SB erano polifunzionale di antigene-specifiche cellule T del fenotipo memoria effettrici.
I passaggi critici del presente protocollo comprendono la tecnica di iniezione intradermica, l'induzione di aspirazione blister e la puntura della bolla. In primo luogo, una corretta deposizione intradermica richiede personale specializzato. Una deposizione non corretta può portare a risultati non ottimali. PPD è generalmente un antigene cutaneo ben noto e sicuro, ma la sua composizione può variare tra produttori, limitando la comparabilità13,20. Questo rapporto fornisce le istruzioni per una singola deposizione intradermica di 2 TU e facoltativamente due deposizioni parallele (2 x 2 TU), che possono richiedere ulteriore approvazione etica. Tuttavia, altri studi hanno utilizzato 10 TU, che aumentano la probabilità di una pelle forte reazione10,21. Durante la fase di induzione di SB, piccolo aumento graduale della pressione negativa ridurrà il rischio di rottura di emorragia e sul blister. Le possibilità di contaminazione con globuli rossi o leucociti dal sangue sono generalmente basso2. La tecnica di puntura asettica previene la contaminazione microbica ed evitando il contatto tra l'ago puntura e il pavimento della bolla cutanea riduce le impurità di detriti o di cellule cutanee residenti. Tuttavia, alcuni ricercatori preferiscono raccogliere il fluido SB applicando una pressione di rotolamento per il blister perforato10. Può essere necessario forare i setti all'interno del blister. La stessa tecnica di SB è minimamente invasiva; SBs compresso guariscono senza cicatrici e infezioni sono molto rare. 2 tuttavia, può verificarsi un certo grado di ipo-pigmentazione e induzione di SB dovrebbe probabilmente essere evitato in persone con una storia di colloide cicatrici.
Limitazioni tecniche includono basso cellulare totale rendimenti e conseguenza limitati opzioni per l'archiviazione a lungo termine. Le relazioni tra la resa del leucocita, le risposte cliniche di TST, la dimensione della bolla e contaminazione dell'eritrocito è stato accuratamente descritto altrove2,10. Negli esperimenti BCG-richiamo qui presentati (Figura 1), la resa totale mediana da ogni blister era 50.000, implicando un set-up sperimentale e su piccola scala, utilizzando queste cellule, soprattutto se SBCs sono studiati da solo15. Tuttavia, la popolazione di cellule T specifica in un campione di SB supera per lo più quello che è trovato in campioni di PBMC in entrambi i conteggi relativi e assoluti delle cellule. Nell'esempio presentato nella Figura 2, il numero di cellule T specifiche PPD triple-positivi in un campione di 100.000 SB cellule era più di 2 x maggiore rispetto al numero trovato in 1 x 106 PBMCs dallo stesso donatore (dati non mostrati). Un segnare visivo della reazione TST è il più comune metodo clinico per la valutazione della memoria di M. tuberculosis . Della nota, la reazione immunologica adattiva sottostante non picco allo stesso tempo come la clinica pelle reazione2,21. Non tutti i vaccinati BCG o Mtb-gli individui esposti svilupperà forti reazioni di TST e strategie per la classificazione e una gestione dei campioni da TST non-responder, come pure una preesistenza sensibilizzazione micobatterica nella popolazione di studio, devono essere considerati prima di iniziare un processo di richiamo utilizzando questo metodo. Inoltre, in entrambi campionamento SB e segnare visivo, c'è un potenziale per una polarizzazione teorica in individui con le risposte di pelle riduttrice dovuto globale o dermo-affine alterato l'immunità, come si è visto, per esempio, l'infezione da HIV e determinate fasce di età2, 13,18,20. Inoltre, un'amplificazione immunologica della reazione con ripetuti test TST è ben noto20,22. Tuttavia, i fenotipi cellulari SB rimangono piuttosto costanti quando TSTs sono ripetute10. Questa osservazione sostiene il ruolo di richiamo di SB in studi longitudinali delle risposte immunitarie cellulari.
Per immunologi T-cellula, richiamo SB permette la raccolta delle frazioni alte di cellule antigene-specifiche. Tuttavia, i tempi di SB per un campionamento da un PPD-deposizione sono critico come sia la composizione cellulare e il microambiente di citochina cambiano nel tempo. In questo protocollo, vesciche erano indotto 7 giorni post-sfida e le cellule isolate erano principalmente CD4 + effettrici cellule T di memoria tra cui alte frazioni delle cellule con una co-espressione di IFN-γ, TNF-α e il-2. Queste osservazioni sono in linea con precedenti studi che descrivono come attivazione, proliferazione e differenziazione delle cellule T si verifica nella pelle di PPD-innescato2,15,21. Studi cinetici di SB in individui sensibilizzati PPD suggeriscono che la risposta di pelle molto precoce è aspecifica; Tuttavia, già entro i primi giorni dopo la sfida di PPD, la risposta diventa dominata da T-cells CD4 + (entrambi fenotipi di memoria memoria ed effettrici centrali sono state descritti) e, dopo 3 giorni, la risposta è dominata da alte frazioni di PPD specifiche citochine producendo i T-cells di CD4 +2,8,10,15,21. Questa risposta adattativa citochina rimane rilevabile per più di 2 settimane2,8,10,23. Giorno 7 post-TST sembra essere il punto di tempo ottimo per la raccolta della citochina producendo le cellule di T di memoria CD4 +2. Tuttavia, altri punti di tempo possono, naturalmente, essere pertinenti a seconda dell'antigene e la risposta di interesse. Da notare, in uno studio, la risposta adattativa di PPD è stata segnalata per un po' prima di picco con una diminuzione della secrezione di citochina pro-infiammatoria già a 5 giorni post-TST10.
SB liquido contiene alti livelli di citochine pro-infiammatorie e di altre proteine indicati per essere rappresentante della pelle microambiente15,24. Studi di cinetica hanno dimostrato che TNF-α e IFN-γ livelli nel picco fluido SB dopo 3 giorni mentre il picco dei livelli IL-2 dopo 7 giorni2,10, probabilmente riflettendo la dominanza di risposte adattative in questa fase successiva. Perché le cellule SB sono stati attivati in vivo, esibiscono un rilascio di citochine spontaneo alta così come un potenziale per un rilascio specifico su restimolazione (Figura 3 e 4).
Questa relazione si concentra sulla immunità delle cellule T CD4 +. Come dimostrato nella Figura 2, la maggior parte delle T-cellule isolate era infatti CD4 +, mentre non c'erano quasi nessun CD8 + cellule T nell'aspirazione blister fluido. Questo è in linea con altri studi di SB PPD-richiamo reporting proporzioni basse e un'inferiore capacità migratoria delle T-cellule CD8 + rispetto a cellule T CD4 +2,8,10,23. Un'ulteriore caratterizzazione del CD8 + contributo sarebbe preferibile; Tuttavia, questo esula dall'ambito della presente relazione.
Le cellule T sono considerate essenziali per il controllo immune di Mtb; Tuttavia, è stato difficile identificare un affidabile correlato della tutela riflettuto nella risposta immunitaria adattativa dal sangue25,26. Questo blocco impedisce gravemente lo sviluppo di nuovi vaccini di TB, come attualmente non esiste alcuna alternativa all'efficacia di grandi dimensioni e molto costose prove27. Gli sviluppatori di vaccino TB determinano l'immunogenicità del vaccino valutando cambiamenti piccoli e transitori nelle popolazioni vaccino-specifiche cellule T nel sangue28,29. Tuttavia, è lecito chiedersi se sia rilevante la piccola frazione di cellule T antigene-specifiche nel sangue di circolazione (cioè, in grado di migrazione verso il sito di un'infezione e rappresentante del microambiente di T-cellula-ricco, il controllo Mtb) 27 , 30 , 31 .
Basato su studi precedenti e i dati presentati nel presente documento, il modello di richiamo cutaneo SB rappresenta un potenziale non sfruttato per lo studio delle cellule T specifiche del vaccino. Non solo il modello consente un richiamo di un vaccino risposta generata da decenni, permette anche la valutazione della memoria vera potenziale in un contesto di tessuto-specifica15,18,19,21. Romanzo, specifici test cutanei, che includono antigeni compreso anche dei vaccini subunità TB, suggerire nuove opportunità per la valutazione del vaccino utilizzando questo modello28,32. Inoltre, analisi trascrittomica suggeriscono che una risposta comunicata per cellule immunitarie generata nella pelle di PPD-sfidati sia simile alla risposta trovata in Mtb-infettato del polmone18.
Mentre biopsie di pelle anche consentono una raccolta delle cellule della pelle e forniscono informazioni spaziali, confrontati con campionamento SB, il metodo è più invasivo e richiede trattamento enzimatico o meccanico per preparare sospensioni unicellulari33. Misurazioni dei marcatori delle cellule e citochine sono comparabili tra i due metodi2,10.
Il metodo di aspirazione blister è già stato applicato in molti settori della ricerca medica oltre alla dermatologia, da solo o in combinazione con una sfida di pelle sistemica o locale. Gli esempi includono studi di sepsi, malattia linfoproliferativa associata al virus di Epstein - Barr, neuropatia diabetica, gli effetti di assunzione di glucocorticoidi e prove umane test anticorpi terapeutici o modelli per terapie mirate T-cellula10 ,34,35,36,37,38.
Da un punto di vista terapeutico, il metodo di richiamo cutaneo SB offre vantaggi unici per studiare la memoria centrale di T-cellula potenziale e -da entrambi un biologiche e tecniche il punto di vista, la pelle sembra fornire un campione rilevante vano2, 15,18,19,21. In particolare, rispetto al tradizionale campionamento passivo di PBMCs di circolazione, il metodo di richiamo cutaneo SB consente lo studio delle cellule T che hanno dimostrato la capacità di migrare dal linfonodo in risposta al loro antigene pertinenti e completare il locale espansione e differenziazione in un tessuto-specifica in vivo contesto15,18,19,21.
In conclusione, il modello ha dimostrato qui potrebbe essere rilevante per i ricercatori nel campo dell'immunità adattiva umana e agenti mirati della T-cellula (cioè, nella ricerca di vaccinologia o cancro malattia infettiva). Il modello TST applicato in questo protocollo è, naturalmente, di particolare rilevanza nel campo della vaccinologia TB. Tuttavia, il concetto di base di questo modello è fortemente applicabile in altri campi di ricerca.

Una pelle SB è un blister artificialmente indotto, che permette per la raccolta delle cellule e fluidi direttamente dalla pelle. La tecnica di innalzamento SBs di vuoto è uno strumento ben noto nel campo della dermatologia, utilizzato per lo studio sull'immunologia della pelle in salute e malattia1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. questo rapporto dimostra come la tecnica di SB combinata con richiamo antigenica cutaneo (metodo di richiamo cutaneo SB) può fornire intuizioni diretta in risposte immunitarie in vivo.
Il principio dietro l'induzione di SB è semplice: una leggera depressione viene applicata ad una piccola zona della pelle. La pressione negativa alla fine costringerà l'epidermide per separare dal derma, creando una bolla locale piena di liquido e cellule1,2,9. Il liquido della bolla può essere raccolto da un'aspirazione fine dell'ago e il contenuto può essere utilizzato per ulteriore studio in vitro.
Negli ultimi anni, c'è stato un crescente interesse nel metodo SB per lo Studio in vivo le risposte immunitarie diverso da malattie limitate alla pelle10,11. Lo studio dell'immunità adattativa in esseri umani è limitato dal fatto che le cellule e citochine di interesse vengono campionate da sangue periferico perché un prelievo invasivo del linfonodo o tessuto mucoso gastrointestinale può essere inaccettabile e immorale. Un esempio è lo studio delle risposte di memoria umana longevo della T-cellula dopo vaccinazione12. A tali prove, il campionamento delle T-cellule può essere una grande sfida, perché la relativa popolazione di cellule che mediano l'immunità risiede nel tessuto linfoide, e solo un numero molto limitato di T-cellule specifiche circolazione nel sangue periferico.
La tecnica di SB offre un'opportunità unica per lo studio delle cellule T di memoria e altre popolazioni cellulari specifici. Dopo l'inoculazione cutanea dell'antigene, le cellule T specifiche per l'antigene sono reclutati dai loro nascondigli linfoide alla pelle e possono facilmente essere campionati da SB. Le applicazioni di ricerca e metodologia di questo modello di richiamo cutaneo sono stati descritti da Akbar et al. nel 20132. Un antigene comunemente usato per il richiamo di pelle è derivato commercialmente disponibili proteico purificato (PPD) di micobatteri utilizzati per eseguire un test cutaneo (TST) tubercolina13, dove PPD viene iniettato nello strato dermico della pelle. In individui con una memoria immunologica esistente verso PPD [ad esempio, gli individui con un'infezione di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) o una precedente vaccinazione di Bacillus Calmette-Guérin (BCG)], la deposizione di antigene si traduce in un ricordare la risposta con la migrazione alla pelle e un'espansione clonale in vivo di cellule CD4 + T-PPD specifiche2,11,14,15. Di conseguenza, alte frazioni di PPD specifico polifunzionale i T-cells di CD4 + si accumulano nella pelle pronta per il campionamento di SB. T-cellule prelevate da questo metodo hanno dimostrato di essere robusto e sono sufficientemente abbondanti per essere caratterizzato da una gamma di test immunologici e da un lungo periodo in vitro cultura15. Così, il modello di richiamo cutaneo e l'induzione di SB può rivelarsi un metodo prezioso per lo Studio in vivo delle cellule T risposte dalle analisi ex vivo , e una maggiore conoscenza di questo approccio può avvantaggiare i ricercatori con interessi in immunologia cellulare e vaccinologia.
Questo rapporto fornisce la prima guida graduale su come indurre il blister aspirazione di pelle umana in pelle di PPD-iniettato. Il modello di richiamo di antigene cutaneo è dimostrato usando la TST in volontari vaccinati BCG. Infine, l'analisi pertinenti ex vivo delle cellule e citochine isolate da SB è esemplificato. Caratteristiche fenotipiche e funzionali delle cellule T specifiche PPD ottenute con il metodo di SB sono accuratamente descritti altrove2,10,11,16,17, 18 , 19. questa relazione mira a discutere gli aspetti pratici e immunologici della metodologia per facilitare l'applicazione di questa tecnica da altri gruppi di ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

Antigene cutaneo-ricordano modelli consentono studi di memoria umana responses in vivo. Quando combinato con induzione della bolla di aspirazione (SB) della pelle, questo modello offre l'accessibilità alle popolazioni rare del rappresentante di cellule T antigene-specifiche della risposta di memoria cellulare nonché la citochina microambiente in situ.
Questo rapporto descrive la procedura pratica di un richiamo cutaneo, un'induzione di SB e un raccolto delle cellule T antigene-specifiche. Per esemplificare il metodo, il test cutaneo alla tubercolina viene utilizzato per il richiamo antigenico in individui che, prima di questo studio, ha subito una vaccinazione di Bacillus Calmette-Guérin contro un'infezione con tubercolosi del micobatterio. Infine, vengono forniti esempi di analisi cytometric di flusso e multisala degli esemplari di SB, illustrandone alte frazioni di polifunzionale antigene-specifici CD4 + T-cellule disponibili con questo metodo di campionamento rispetto con cellule isolate dal sangue.
Il metodo qui descritto è sicuro e mini-invasiva, offre un'opportunità unica di studiare entrambi immunitaria innata e adattativa in vivoe può essere utile per una vasta comunità di ricercatori che lavorano con umani e immunità cellulo-mediata memoria di risposte, nel contesto di sviluppo di un vaccino.

Otto volontari adulti sani (età media: 30 anni, gamma: 26-43 anni) con una documentata precedente vaccinazione BCG (tempo mediano dalla vaccinazione di BCG: 5,5 anni, gamma: 1-30 anni) sono stati inclusi. I partecipanti sono stati sfidati per via intradermica con 2 TU di PPD seguita da una valutazione di TST il giorno 3. SBs erano indotto il giorno 7 e raccolto il giorno 8, e tutte le bolle sono state sollevate utilizzando camere di aspirazione blister con diametri di foro di 10 mm. Sette individui sono stati dati 2 inoculazioni di PPD separati contemporaneamente nel braccio stesso seguito da 2 parallele induzioni di SB (fare riferimento alla nota per quanto riguarda più PPD deposizioni sotto passo 1.4 nel protocollo). Sangue periferico è stato disegnato il giorno 7 per plasma e un isolamento di PBMCs da centrifugazione in gradiente di densità. I surnatanti plasma e liquido da SBs sono stati conservati a-20 ° C. Cellule fresche di SB (SBCs) sono stati contati usando microscopia e Nigrosina macchia.
Le risposte cliniche TST e resa SBC sono presentati nella Figura 1. Il formato mediano del indurimenti TST era 10,25 mm (gamma: 0 - 20 mm) e il numero di cellulare mediano per blister era 50.000 (gamma: 15.000-210.000 celle, numero di bolle: 15). Due dei volontari ha avuto nessuna risposta clinica in entrambi i 2 TSTs e un corrispondente rendimento basso cella totale di 15.000 cellule/blister. Il rendimento delle celle è stato associato con la risposta clinica media di TST (Spearman r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> Figura 1 : Rendimento delle celle aspirazione blister. (un) questo pannello mostra un rappresentante microscopia di Nigrosina-macchiato le cellule isolate da SBs generato 7 giorni post-TST. (b) questo pannello mostra le relazioni tra l'indurimento di TST medio (mm) e il rendimento medio delle cellule (n/blister) in 8 volontari vaccinati BCG (numero di vesciche = 15). I punti rappresentano misurazioni medie individuali. Siete pregati di notare che i 2 punti sono sovrapposte come 2 volontari entrambi avevano un indurimento di TST di 0 mm e un rendimento delle celle di 15.000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per illustrare la caratterizzazione di flusso cytometric SB, SBC sono stati ottenuti da un volontario di 43 anni che era stati vaccinati BCG 30 anni prima e non aveva alcuna esposizione conosciuta per Mtb. The SBC sono stati isolati dopo l'induzione di una singola bolla ( indurimento: 1,4 mm/100.000 SBCs). La figura 2 Mostra trame rappresentativi della colorazione intracellulare cytokine del SBCs contro PBMCs.
In questo volontario, la frazione di CD3 + CD4 + CD8-SBCs aumentato dal 67% in cellule non stimolate a > 90% su un PPD in vitro restimolazione, considerando che la frazione di CD3 + CD4 + CD8-PBMCs è rimasto costante (~ 51%, Figura 2). Oltre il 92% della in vitro PPD-, come pure non stimolate CD3 + CD4 + CD8-SBCs, erano del tipo memoria effettrici (CCR7 - CD45RA-, dati non mostrati). Le frazioni complessive di CD3 + CD4 + CD8-cellule specifiche indotte da PPD-stimolazione erano più alti in SBCs rispetto ad i PBMCs (33,1 vs. 0,2%, non stimolati campioni sottratti). In PBMCs, le frazioni di polifunzionale PPD specifiche cellule CD3 + CD4 + CD8 erano tutti < 0.05%.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> Figura 2 : Rappresentante flusso cytometry appezzamenti di SBC contro PBMCs. Pannelli a e b mostrano densità rappresentativa appezzamenti di popolazioni di CD8 + e CD4 + a (un) stimolate vs. PPD-stimolato PBMC e (c) SBCs. pannelli b e d lento appezzamenti di macchiatura in cellule CD3 + CD4 + CD8 PPD-stimolato per (b) PBMCs intracellulari di cytokine e (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">per favore clicca qui per vedere una più grande versione di questa figura.</a>
Come previsto, CD3 + CD4 + CD8-SBC sono stati attivati in vivo, illustrato da una proporzione elevata delle cellule macchiando per sovraregolati citochine (12%), con il predominante citochine, TNF-α e IFN-γ. Tuttavia, PPD-stimolazione, la citochina che secernono le cellule spostata verso un triple - o doppio-positivo IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%) e IFN-γ + TNF-α + (15%) profilo (Figura 3b, profili PBMC dallo stesso donatore sono inclusi per il confronto in Figura 3a). I profili di espressione di citochina per sottoinsiemi di PPD-stimolata effettrici memoria CD4 + cellule T (CD3 + CD4 + CD8-CCR7 - CD45RA-) erano paragonabili a CD3 + CD4 + CD8-popolazione presentata nelle figure 2 e 3 (dati non mostrati).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> Figura 3: profili di Cytokine per CD4 + PPD-stimolato e non stimolate SBCs contro PBMCs.  Questi pannelli mostrano profili individuali per la produzione di citochina (un) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs cellule e (b) CD3 + CD4 + CD8-SBCs. Le barre rappresentano frazioni di profili di cytokine antigene-specifici in cellule non stimolate (barre bianche) e una stimolazione in vitro con PPD (barre colorate).
Per esplorare il fluido di SB come fonte di informazioni sul microambiente citochina al sito della prova della pelle, sono stati misurati i livelli di citochine nel liquido raccolto da SBs indotto 7 giorni post-TST (Figura 4a). I livelli mediani di IFN-γ, TNF-α e il-2 erano 339 pg/mL, 19 pg/mL e 1 pg/mL, rispettivamente (n = 6). I livelli del plasma sono stati generalmente molto bassi. Cellule isolate da SBs prodotto gli alti livelli di citochine pro-infiammatorie ex vivo (Figura 4b). Titolazioni di SBCs da 1 volontario sono state coltivate per 4 giorni in presenza di virulento M. tuberculosis ± PBMCs autologo. I livelli di IFN-γ erano > 30 volte superiore in colture contenenti SBCs, indipendentemente dalla presenza di PBMC.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> Figura 4 : Livelli di citochine nel liquido di SB, al plasma, e MTB -infettati surnatanti. (un) questo pannello mostra i livelli di citochina in surnatanti fluidi SB e plasma da 6 volontari vaccinati BCG. Le barre rappresentano i livelli di citochine mediano; le barre di errore rappresentano la gamma. (b) questo pannello mostra i livelli di citochina in surnatanti da 4 600 µ l ex vivo 4 giorni culture parallele di 1 x 106 PBMCs (barre nere), 1.75 x 105 SBCs (barre bianche) e 1 x 106 PBMCs a spillo con 0,5 o 1.75 x 10 5 SBCs (barre grigie) infettato da Mtb. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Qui, forniamo una dimostrazione del modello cutaneo richiamo della bolla di aspirazione. Il modello consente un semplice accesso a studiare umano in vivo risposte immunitarie, per esempio nel contesto di sviluppo di un vaccino.

Un protocollo di aspirazione Blister per studiare T-cellula umana richiamo Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

11.9K Views.  Statens Serum Institut. Qui, forniamo una dimostrazione del modello cutaneo richiamo della bolla di aspirazione. Il modello consente un semplice accesso a studiare umano in vivo risposte immunitarie, per esempio nel contesto di sviluppo di un vaccino.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

Competitivo saggi Homing allo Studio Gut-tropico Migrazione cellulare T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

Induzione di Graft-versus-host disease e<em&gt; In Vivo</em&gt; T monitoraggio cellulare Utilizzando un MHC-abbinato modello murino

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

L&#39;uso di fluorescenti target matrici per la valutazione delle cellule T risposte<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

Il trapianto di coda della pelle per studiare allogenico di cellule T CD4 risposte in topi

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolamento di Salmonella typhimurium-contenente fagosomi dai macrofagi

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

Valutazione delle risposte a cellula T Zika Virus-specifici in organi di nuova di Ifnar1 infetti- / - Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

Ottimizzazione del interferone-gamma ELISpot analisi di risposte a cellula T misura nel modello cavia dopo la vaccinazione

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...