우리는 그의 실용적이 고 학문적 인 조언을; Mads Radmer 젠 슨을 감사 하 고 싶습니다. 라우 Lindqvist 및 Kaare Svejstrup 제공 전문 기술; 헬렌 Bæk Juel, 조나단 Filskov, 로그인 토니 슈미트, Solveig W. Harpøth 그들의 기술 지원; PPD 관리;에서 그들의 훈련에 대 한 젠 토 프 트 TB 외래 환자 진료소에서 직원 그리고 연구에 참여에 대 한 모든 자원 봉사자. 이 프로젝트는 유럽 위원회 H2020 프로그램 [보조금 번호 TBVAC2020 643381]와 우리 컨소시엄 파트너 유익한 토론에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

인간의 자의 사용을 포함 하 여 아래 설명 된 모든 방법은 건강 연구 윤리 (H-15002988) 및 덴마크어 데이터 보호 기관 (jr.nr. 2015-57-0102) 덴마크 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. PPD는 인간 사용을 위해 승인 하 고 제조업체에서 제공 하는 정확한 복용량에서 관리 인증된 제품 이어야 합니다. 복용량 또는 관리 모든 편차가 추가 윤리적인 승인 해야 하 고 자원 봉사자 동의 부여 해야 합니다.
1. 투베르쿨린 피부 검사
<ol><li>자원 봉사에서 구두 및 서 면 동의 얻을. 주입, 이전 지원자를 이해 하 고 수락 가능한 불리 한 효과 포함 하는 절차를 확인 합니다. 참고:이 프로토콜 특정 포함 기준 > 18 세 및 문서화 BCG 예방 접종은. 포함 기준 연구 질문에 따라 다를 수 있습니다 (즉, 추가 포함 기준 긍정적인 TST의 증거 일 수 있었다).</li>
	<li>PPD의 기성 솔루션을 사용 하 여 인간의 사용 [20 투베르쿨린 단위 (TU) /mL]에 대 한. 소독 알콜 면봉을 사용 하 여 유리병의 고무 캡.</li>
	<li>사출 사이트 준비<ol>
<li>자원 봉사자의 팔 뚝의 복 부 측에 사출 사이트를 찾습니다.</li>
		<li>일반 표면에 팜 업 팔을 놓고 팔 뚝, 팔꿈치 관절에서 약 5-10 cm의 위 세 번째 영역을 선택 합니다. 숙박은 상처, 정 맥, 또는 손상 된 피부의 선택을 취소 합니다.</li>
		<li>알코올 면봉을 사용 하 여 영역을 소독.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PPD 솔루션 준비<ol>
<li>1 mL 균 주사기 27-30 G/짧은 (예를들면, 12 m m) 바늘을 고정을 사용 합니다.</li>
		<li>부드럽게 혼합 하 고 PPD 솔루션의 0.1 mL를 갈망. 거품 없는 볼 수 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부 PPD 주사 참고:이 단계 단일 PPD 증 착을 수행 하는 방법을 설명 하지만 동일한 팔에서 PPD의 여러 증언 가능 합니다. 그러나,이 특정 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다.<ol>
<li>피부를 스트레칭 하 고 위쪽으로 향하게 하는 경사와 함께 피부에 5-15 ° 각도로 바늘을 가리킵니다.</li>
		<li>피부 피부 층에 바늘의 팁을 삽입 하 고 팁은 표 피를 통해 거의 볼 수 있는지 확인 하십시오.</li>
		<li>천천히 PPD 솔루션의 0.1 mL를 주사. 참고: 올바르게 관리 하는 경우 6 ~ 10 mm의 창백한 구 진 즉시 나타납니다. 구 진 약 10 분 후 사라진다.</li>
		<li>두 개 이상의 증언 때, 팔꿈치 및 손목 영역에서 좋은 거리에서를 유지 하면서 사출 사이트의 최대 별거 (5-10 cm)에 대 한 목표. 참고:이 피부 테스트 응답의 잠재적인 합류를 방지 하 고 있습니다 두 개의 흡입 챔버의 중단 위치.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 피부 반응-3 일의 평가
<ol><li>48-72 시간 후 note 피부 반응의 크기. 단단하게 됨 (붓기)를 측정 하지 반응의 홍 반 (적색).</li>
	<li>하드를 만져 손가락을 사용 하 여 붓기와 볼펜을 사용 하 여 단단하게 됨의 가장자리를 표시 하는 다음. 눈금자를 사용 하 여 단단하게 됨 직경을 측정 하 고 결과 m m. 참고: 단단하게 됨 크기의 흡입 챔버에 대 한 오리 피스 직경의 선택을 가이드 수 있습니다.</li>
</ol>3. 흡입 물집 유도-7 일
<ol><li>흡입 장치 단위 조립. 참고: 흡입 장치 단위는 흡입 물집 유도 대 한 연결 된 챔버와 진공 펌프. 이 데모에서 사용 되는 장치는 사용자 정의 하지만 흡입 장치 단위는 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 펌프-20 ~-40 kPa의 범위 내에서 조정 가능 하 고 안정 하 고 신뢰할 수 있는 부정적인 압력을 제공 해야 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 실험을 실시 이전 지역 윤리적인 승인을 얻은 합니다.<ol>
<li>첫째, 하단 오리 피스 플레이트와 챔버와 연결 호스 창 접시를 조립 하 여 흡입 챔버를 준비 합니다. 진공 펌프를 단단히 챔버에 연결 호스를 연결 합니다. 참고: 챔버는 인간의 피부와 접촉에 적합 해야 합니다, 물집 유도 구멍 바닥판 및 물집의 비주얼 모니터링에 대 한 허용 창 상단 플레이트 포함 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피부 반응;의 크기를 기준으로 오리 피스 플레이트의 최적의 오리 피스 직경을 결정 오리 피스, 크기가 큰 물집.</li>
	<li>오리 피스 플레이트와는 자원 봉사자의 피부 소독 알코올 면봉을 사용 하 여.</li>
	<li>피부에 흡입 챔버를 연결 합니다.<ol>
<li>자원 봉사자의 팔 편안 하 게 휴식 하 고는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>피부 반응의 센터 표시 되도록 PPD 반응을 통해 흡입 챔버의 하단 플레이트에 구멍 위치 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>안전 띠를 사용 하 여 느슨하게 챔버: 챔버 피부에 준수 되며 그 위치를 유지 때 부정적인 압력이 적용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>흡입 장치를 설정 하 고-20 kPa에 압력을 조정 합니다.</li>
	<li>30 분 후-25 kPa에 부정적인 압력을 증가.</li>
	<li>60 분 후-30 kPa에 부정적인 압력을 더욱 높일.</li>
	<li>물집은 완전히 형성 될 때까지-30 kPa에서 압력을 유지. 이 프로토콜에서 제공 하는 부정적인 압력 특정 사용자 지정 된 악기 인지 확인 합니다. 그것은 약간 다른 설정에서 프로토콜을 적용할 때 압력을 조정 해야 합니다. 참고: 물집 유도 단계 Blistering는 종종 가려움 센 세이 션과 관련 된 마지막 30 분 이내에 발생 하는 실제 물집 형성-180 분 (1-3 h) 60에서 배열 한다. 물집은 하나 또는 여러 개의 병합 물집으로 발생할 수 있습니다. 만약 물집이 파열 또는 출혈 발생, 천천히 압력을 방출 하 여 물집 유도 종료 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>물집은 완전히 형성 후 압력을 놓고 피부에서 물집 파열 없이 흡입 챔버를 조심 스럽게 제거.</li>
	<li>주변 피부에 부드러운 드레싱을 적용 하 고 물집 하드 캡 (예를 들어, 50 mL 플라스틱 튜브에서) 장소.</li>
	<li>부드러운 신축성 붕대 뒤 비 알레르기 수술 테이프로 모자를 보안 합니다.</li>
	<li>다음 12-24 h에 대 한 물집 지역에 과도 한 신체 부담을 피하기 위해 자원 봉사를 하도록 지시 합니다.</li>
</ol>4. 수확 물집 유체의-주 8
<ol><li>8번째 날, 부드럽게 보호 드레싱을 제거 하 고 피부 소독 스프레이와 물집을 치료.</li>
	<li>23 G 바늘으로 2 mL의 멸 균 주사기를 사용 하 여 물집 콘텐츠를 수확. 물집의 상단/측면 쪽에 바늘을 삽입 하 고 액체를 천천히 발음. 구멍의 바닥을 만지지 마십시오 하지만 모든 액체를 수확.</li>
	<li>축소 된 물집에 드레싱을 적용 합니다.</li>
	<li>무 균 튜브에 물집 유체를 전송. 볼륨 note</li>
	<li>탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 분 600 x g에 아래로 물집 액체를 회전 합니다.</li>
	<li>다른 튜브에는 상쾌한 전송 및 셀 매체의 500 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend. 참고: 셀은 계산 및 추가 분석에 대 한 준비. Supernatants 사용까지-20-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 흡입의 분석 물집 세포 및 체액
참고:이 프로토콜의 범위 내에서 않습니다 세포와 피부 흡입 물집에서 얻은 액체의 분석에 대 한 지침을 제공. 그러나,이 보고서에 대 한 대표적인 결과 제공, 세포내 얼룩 흐름 cytometry 및 멀티플렉스 분석 수행 했다. 방법론은 아래에 간단히 설명 되어 있습니다.
<ol><li>Cytometry<ol>
<li>1 x 105 신선한 셀 1 BCG 예방 접종 자원 봉사자와 PPD의 10 µ g/mL에서에서 흡입 물집에서 절연의 현 탁 액을 자극 하 고 37 ° C, 5%에서 세포를 품 어 공동2. 병렬 부 화에 대 한 unstimulated 셀을 포함 합니다.</li>
		<li>1 x 106 PBMCs PPD의 10 µ g/mL와 함께 1 BCG 예방 접종 자원에서 얻은 정지를 자극 하 고 37 ° C에서 5% 혼합물을 품 어 공동2. 병렬 부 화에 대 한 unstimulated 셀을 포함 합니다.</li>
		<li>2 시간 후 Brefaldin A와 monensin 모든 세포를 치료 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 그들을 품 어</li>
		<li>라이브/죽은-얼룩-BV510, 안티-CD4-AF780, 안티-CD3-BV421, 안티-CD8-PerCP-Cy5.5, 안티-CCR7-PE, 안티-CD45RA-BV786, 안티-IFN-γ-AF700, 안티-TNF-α-PE-Cy7, 및 안티-일리노이-2-FITC 패널 셀 얼룩.</li>
		<li>PBMC 패널에 FMO 컨트롤을 포함 합니다.</li>
		<li>교류 cytometer와 흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 관련 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석.</li>
		<li>Cytokine 생산 CD3 + CD4 + CD8-하위 다음과 같은 제어 전략을 사용 하 여에 게이트: singlets-> 가능한 CD3 +-> CD4 + CD8--> IFN-γ +, TNF-α + 또는 일리노이-2 +.</li>
		<li>이펙터 메모리 셀 인구는 다음과 같은 제어 전략을 사용 하 여에 게이트: singlets-> 가능한 CD3 +-> CD4 + CD8--> CCR7-CD45RA-.</li>
		<li>부울 게이팅을 사용 하 여 개별 cytokine 프로필을 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cytokine 릴리스 데모<ol>
<li>Vivo에서릴리스에 cytokine의 데모에 대 한, 다중 분석을 사용 하 여 계량 일리노이-2, IFN-γ, TNF-α, 일리노이의 레벨-10, 및 IL-13 4 자원에서 얻은 해 동된 흡입 물집 액체에서.</li>
		<li>세포 cytokine 방출의 데모에서 얻은 흡입 물집 전 비보, 사용 신선한 흡입 물집 세포와 PBMCs 1 BCG 예방 접종 자원에서 얻은.</li>
		<li>감염에서 PBMC 100 콜로 니 형성 단위 (CFU) Mtb H37Rv 물집 세포를 흡입 하 고 4 일 동안 그들을 품 어.</li>
		<li>다중 분석을 사용 하 여 계량 일리노이-2, IFN-γ, TNF-α, 일리노이의 레벨-10과 IL-13 모든 문화 supernatants에.</li>
		<li>위 계산도 분석 결과 계산 범위 위의 측정을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variability+in+tuberculosis+granuloma+T+cell+responses+exists,+but+a+balance+of+pro-+and+anti-inflammatory+cytokines+is+associated+with+sterilization.">Variability in tuberculosis granuloma T cell responses exists, but a balance of pro- and anti-inflammatory cytokines is associated with sterilization.</a> PLoS Pathogens. 11 (1), e1004603 (2015).</li><li>Ruhwald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficacy+of+the+C-Tb+skin+test+to+diagnose+Mycobacterium+tuberculosis+infection,+compared+with+an+interferon+&#947;+release+assay+and+the+tuberculin+skin+test:+a+phase+3,+double-blind,+randomised,+controlled+trial.">Safety and efficacy of the C-Tb skin test to diagnose Mycobacterium tuberculosis infection, compared with an interferon &#947; release assay and the tuberculin skin test: a phase 3, double-blind, randomised, controlled trial.</a> The Lancet Respiratory Medicine. 5 (4), 259-268 (2017).</li><li>He, X., de Oliveira, V. 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저자는 공개 없다.

이 원고는 인간의 면역 메모리 응답에서 vivo에서, 흡입 물집 유도 함으로써 피부 항 원 회수 및 셀 수확을 사용 하 여 연구에 대 한 실질적인 절차를 설명 합니다. TST 피부 항 원 증 착 및 BCG 백신 회수의 한 예로 사용 되었다. 마지막으로, SB 표본 특성 흐름 cytometric 및 멀티플렉스 cytokine 분석의 예를 제공, 이펙터 메모리 형의 항 원 특정 polyfunctional T-세포를 했다 SB 셀의 세 번째는 대략 시연 했다.
이 프로토콜의 중요 한 단계는 피부 주입, 흡입 물집 유도 기술과 물집 펑크 포함 됩니다. 첫째, 올바른 피부 증 착 훈련된 인원을 필요합니다. 잘못 된 증 착 차선의 결과 발생할 수 있습니다. PPD는 일반적으로 잘 알려진 하 고 안전한 피부 항, 하지만 그 구성 comparability13,20제한 제조 업체 간의 다를 수 있습니다. 이 보고서는 2 TU의 단일 피부 증 착 및 필요에 따라 두 개의 병렬 증언 (2 x 2 TU), 추가 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다에 대 한 지침을 제공 합니다. 그러나, 다른 연구 사용 10 부 엉, 강한 피부 반응10,21의 가능성을 증가 하는. SB 유도 단계에서 부정적인 압력에서 작은 stepwise 증가 출혈 및 물집 파열의 위험을 줄일 것입니다. 적혈구와 백혈구 혈 류에서 오염의 기회는 일반적으로 낮은2. 무 균 바늘 기술 미생물 오염을 방지 하 고 파편 또는 거주 피부 세포의 불순물을 감소 펑크 바늘 및 피부 물집 바닥 사이의 접촉을 피하고. 그러나, 일부 연구 자들은 SB 액체 구멍이 물집10회전 압력을 적용 하 여 수확을 선호 합니다. 그것은 물집 내의 septa 펑크 필요할 수 있습니다. SB 기법 자체는 최소 침 습; 축소 된 SBs 흉터 없이 치료 하 고 감염 매우 드물다. 그러나 2 , 어느 정도의 hypo-착 색 발생할 수 있습니다 및 SB 유도 아마 콜 로이드 흉터의 역사를 가진 사람들에 피해 야 한다.
기술 한계는 낮은 총 셀 수율 및 장기 저장을 위한 따라서 제한 된 옵션을 포함합니다. 백혈구 수율, 임상 TST 응답, 물집 크기, 및 적혈구 오염 간의 관계 되었습니다 철저 하 게2,10설명 되어. BCG 회수 실험에서 여기에 제시 된 (그림 1), 각 물집에서 평균 총 수익률 50000, Sbc는15공부 혼자 하는 경우에 특히 이러한 세포를 사용 하 여 소규모 실험 설정을 암시 했다. 그러나, SB 샘플에서 특정 T 세포 인구 대부분 초과 두 상대 및 절대 셀 카운트에서 PBMC 샘플에서 무엇을 발견 합니다. 그림 2에 표시 하는 예제에서 트리플-긍정적인 PPD 전용 T-셀 100000 SB 세포의 샘플 수는 숫자에서 1 x 106 PBMCs 같은 기증자 (데이터 표시 되지 않음)에서 보다 큰 x 2 이상 했다. TST 반응은 시각적으로 채 점 하는 것은 M. 결핵 메모리 평가 대 한 가장 일반적인 임상 방법입니다. 메모의 기본 적응 면역 반응 임상 피부 반응2,21로 동시에 피크 하지 않습니다. 모든 BCG-예방 접종을 하지 또는 Mtb-노출된 개인 강한 TST 반응 및 분류, 그리고 응답자, TST 비-연구 인구에 기존 mycobacterial sensitization에서 샘플의 처리에 대 한 전략을 개발할 것입니다 이 메서드를 사용 하 여 리콜 재판을 시작 하기 전에 고려 될 필요가 있다. 또한, SB 샘플링 및 시각적 득점, 이론적인 편견 감소 피부 반응 때문에 글로벌 개인에 대 한 가능성 또는 본, 예를 들어, 특정 연령 그룹2, HIV 감염에 면역 장애 피부 관련 13,,1820. 또한, 반복 테스트와 TST 반응의 면역 증폭 잘 알려진20,22입니다. 그러나, TSTs는 반복된10SB 셀 고기 오히려 지속적인 유지 됩니다. 이 관찰 세포 면역 반응의 경도 연구에서 SB 회수의 역할을 지원합니다.
T-셀 immunologists, SB 회 항 원 특정 셀의 높은 분수의 수확 할 수 있습니다. 그러나, PPD 증 착에서 샘플링 SB의 타이밍은 세포 구성과 cytokine microenvironment 시간이 지남에 변경 중요 합니다. 이 프로토콜에서 물집 있었다 유도 7 일 후 도전과 고립 된 세포 주로 CD4 + 이펙터 메모리 T-세포 IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 공동 식 셀의 높은 분수를 포함 하 여. 이 관측은 T-세포 활성화, 확산, 그리고 차별화 준비 하는 PPD 피부2,,1521에서 발생 하는 방법을 설명 하는 이전 연구에 맞춰. PPD 응 개인 운동 SB 연구 제안 초기 피부 반응입니다. 그러나, 이미 일 내에 첫 번째 PPD 도전 다음, 응답 CD4 + T 세포 (둘 다 중앙 메모리와 이펙터 메모리 고기 설명 되었습니다)에 의해 지배 되 고, 3 일 후, 응답의 높은 분수에 의해 지배 된다 PPD 관련 cytokine 생산 하는 CD4 + T 세포2,,810,,1521. 이 적응형 cytokine 응답 2 주2,,810,23이상 감지 남아 있습니다. 7 일 게시물 TST 메모리 CD4 + T 세포2를 생산 하는 사이토카인의 컬렉션에 대 한 가장 최적의 시간 지점에 것 처럼 보인다. 그러나, 다른 시간 점 물론, 항 원 및 관심의 응답에 따라 관련성이 있을 수 있습니다. 노트, 한 연구에 적합 한 PPD 반응 5 일 포스트 TST10에 이미 프로-염증 성 cytokine 분 비 감소와 조금 일찍 절정에 보고 되었습니다.
SB 액체 프로 염증 성 cytokines과 피부 microenvironment15,24의 대표자를 표시 하는 다른 단백질의 높은 수준을 포함 합니다. 활동 연구는 TNF-α와 IFN-γ 레벨 SB 유체 피크에 일리노이-2 레벨 피크 동안 3 일 후 7 일2,10, 후 아마 반영 하는 적응형 응답의 지배력이 나중 단계에서 나타났습니다. 때문에 SB 세포 활성화 vivo에서, 그들은 높은 자발적인 cytokine 방출으로 restimulation (그림 3 및 4)에 따라 특정 릴리스에 대 한 잠재력을 전시.
이 보고서는 CD4 + T 세포 면역에 주력합니다. 그림 2에서 설명 된, 격리 된 T-세포의 대부분은 실제로 CD4 +, 동안 있었다 거의 아무 CD8 + T-세포는 흡입에 물집이 액체. 이 낮은 비율 및 CD8 + T 세포 CD4 + T 세포2,8,,1023에 비해 열 등 한 철새 용량 보고 다른 SB PPD 리콜 연구 라인. CD8 + 기여의 더 특성 더 좋을 것 이다; 그러나,이이 보고서의 범위를 벗어납니다.
T-세포는 Mtb;의 면역 제어에 대 한 필수적인 것으로 간주 그러나, 그것은 혈액25,26에서 적합 한 면역 반응에 반영 하는 보호의 믿을 수 있는 상관을 식별 하기 위해 어렵게 되었습니다. 이 바리 케이트로 현재 크고 매우 비용이 많이 드는 효능 실험27대안이 새로운 결핵 백신의 개발을 심각 하 게 방해. 결핵 백신 개발자는 백신 immunogenicity 혈액28,29에 백신 관련 T 세포 인구에 있는 작은, 일시적인 변화를 평가 하 여 결정 합니다. 그러나, 그것은 의심 항 원 특정 T-세포는 혈액에 순환의 작은 분수 관련 인지 (즉, 감염 및 T-세포-풍부한 microenvironment 제어의 대표 사이트로 마이그레이션 가능 Mtb) 27 , 30 , 31 .
이전 연구와 여기에 소개 하는 데이터를 바탕으로, SB 피부 리콜 모델 백신 관련 T-세포의 연구에 대 한 미 개발된 잠재력을 나타냅니다. 뿐만 아니라 않는 모델 사용 전 백신 생성 된 응답 수십 회, 그것은 또한 조직 관련 컨텍스트15,18,,1921에 잠재적인 실제 메모리의 평가 있습니다. 소설, 특정 피부 테스트 후보 소 단위 결핵 백신의 구성 또한 항을 포함 하는이 모델28,32를 사용 하 여 백신 평가 위한 새로운 기회를 제안 합니다. 또한, transcriptomic 분석 PPD 도전 피부에 생성 된 셀-중재 면역 응답은 유사 Mtb에 응답 제안-폐18감염.
피부 펀치 생체 검사는 피부에서 세포 수확에 대 한 허용 하 고 SB 샘플링에 비해 공간 정보를 제공 하는 동안 메서드를 사용 하면 더 많은 침략 및 효소 또는 기계 처리 단일 셀 정지33준비 필요. Cytokines 및 셀 마커의 측정 두 가지 방법2,10사이 비교할 수 있습니다.
흡입 물집 방법 단독으로 또는 함께 조직 또는 지역 피부 도전 외에 피부과, 의료 연구의 많은 분야에서 적용 된 이미. 예로 패 혈 증, 엡 스타인-바 바이러스 관련 lymphoproliferative 질병, 당뇨병 신경 병, glucocorticoid 섭취 효과 및 치료 항 체 또는 T-세포 타겟 요법10 모델을 테스트 하는 인체 실험의 연구 ,3435,36,,3738.
치료 관점에서 SB 피부 리콜 방법 이점이 독특한 잠재적인 중앙 T-셀 메모리를 공부 하 고-의 관점-스킨 제공 관련 샘플링 구획2, 것 두 생물에서 및 기술 15,18,,1921. 특히, PBMCs 순환의 전통, 수동 샘플링에 비해, SB 피부 리콜 메서드를 수 있습니다 로컬을 완료 하 고 그들의 관련 항 원에 대 한 응답에서 림프절에서 마이그레이션할 능력 입증 된 T-세포의 연구에 대 한 확장 그리고 vivo에서 조직 관련 컨텍스트15,18,,1921에서 차별화.
결론적으로, 모델 여기 분야 내에서의 인간의 적응 면역과 T-셀 대상 에이전트 (즉, 전염병 백신 또는 암 연구에서) 연구자에 대 한 관련 될 수 있는 시연. TST 모델이이 프로토콜에 적용 되는, 물론, 결핵 백신 분야에 특별 한 관련성 의입니다. 그러나,이 모델의 기본적인 개념 연구의 다른 분야에도 적용 됩니다.

피부 SB는 인위적으로 유도 물집 세포와 피부에서 직접 액체의 수확에 대 한 허용 하는. 진공으로 SBs를 올리기의 기술이 이다 피부과 피부 면역학 건강과 질병1,2,3,,45, 의 연구에 대 한 사용의 분야에서 잘 알려진 도구 6 , 7 , 8.이 보고서 보여줍니다 어떻게 피부 항 원 리콜 (SB 피부 리콜 방법)와 결합 된 SB 기술을 적응 면역 반응 비보에 직접적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.
SB 유도 뒤에 원리는 간단 하다: 가벼운 진공 피부의 작은 영역에 적용 됩니다. 부정적인 압력은 결국 표 피 및 셀1,,29가득 로컬 물집을 만드는 진 피에서 분리를 강제 합니다. 물집 액체 정밀한 바늘 포부에 의해 수확 수 있습니다 고 추가 연구에서 시험관에대 한 콘텐츠를 사용할 수 있습니다.
최근 몇 년 동안에 SB 방법 질병 피부10,11제한 이외의 면역 반응 생체 내에서 의 연구에 대 한 관심이 증가 되었습니다. 인간의 적응 면역의 연구는 세포 그리고 cytokines의 샘플링 말 초 혈액에서 림프 노드 또는 위장 점 막 조직에의 한 침략 샘플링 용납 하 고 비 윤리적인 수 있기 때문에 사실에 의해 제한 됩니다. 예를 들어는 예방 접종12후 긴 인간의 기억 T 세포 응답의 연구 이다. 이러한 시련에 관련 T-세포의 샘플링 관련 인구 면제를 중재 하는 셀의 림프 조직에 존재 하기 때문에 큰 도전 수 고만 매우 제한 된 수의 특정 T-세포는 말 초 혈액에서 순환.
SB 기술은 메모리 T-세포의 연구는 독특한 기회 및 다른 특정 세포 인구를 제공합니다. 항 원 피부 접종 다음 T-세포는 항 원에 대 한 특정 피부 림프 그들의 은신처에서 모집 하 고 SB에서 쉽게 샘플링할 수 있다. 이 피부 리콜 모델의 방법론 및 연구 응용 프로그램 아크 바르 외. 에 의해 설명 했다 20132에서. 피부 회수에 대 한 일반적으로 사용 되는 항 mycobacteria PPD 피부 피부 층에 주입은 투베르쿨린 피부 검사 (TST)13, 수행 하는 데 사용의 상용 순화 된 단백질 유도체 (PPD)입니다. PPD [예를 들어, 개인 결핵균 (Mtb) 감염 또는 이전 균 메 게 랭 (BCG) 접종]으로 기존 면역 메모리를 가진 개인, 항 원 증 착에서 결과 피부 하 비보에 클론 확장 PPD 특정 CD4 + T 세포2,11,,1415의 마이그레이션 응답을 기억 합니다. 그 결과, PPD 특정 polyfunctional의 높은 분수 CD4 + T 세포는 SB 샘플링에 대 한 준비 피부에 누적 됩니다. 이 방법에 의해 수집 된 T-세포는 강력한 것을 입증 되며 immunoassays의 범위 및 장기 생체 외에서 문화15특징을 충분히 풍부. 따라서, 피부 리콜 모델과 SB 유도 비보 전 분석에 의해 vivo에서 T 세포 응답을 공부 하는 귀중 한 방법을 증명할 수 있습니다. 그리고이 방법의 증가 지식 세포 면역학에 관심을 가진 연구자 혜택을 수 있습니다. 그리고 백신입니다.
이 보고서는 PPD 주사 피부에 인간 피부 흡입 물집을 유도 하는 방법에 첫 번째 단계적 가이드를 제공 합니다. 피부 항 원 리콜 모델은 BCG 예방 접종 자원 봉사자에서는 TST를 사용 하 여 보여 줍니다. 마지막으로, 세포의 cytokines SB에 의해 분리 관련 비보 전 분석은 exemplified. SB 메서드에서 얻은 PPD 전용 T-세포의 phenotypical 및 기능적 특성은 철저 하 게 설명 되어2,,1011,,1617, 18 , 19.이 보고서 다른 연구 그룹에 의해이 기술의 응용 프로그램 완화 방법의 실용적이 고 면역 측면을 논의 하는 것을 목표로.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gloves for laboratory use</td>
			<td>Imtex, Denmark</td>
			<td>1013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection spray&#160;</td>
			<td>Apotek, Denmark</td>
			<td></td>
			<td>82% alcohol, with glycerin, for human skin&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol swaps</td>
			<td>Mediq, Denmark</td>
			<td>1131892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPD RT 23 &#34;SSI&#34; (2 T.U./0.1ml)</td>
			<td>AJ Vaccines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Myjector syringe with fixed needle&#160;</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>A236</td>
			<td>1 ml/29G/12mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ruler&#160;</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ballpoint pen</td>
			<td>not relevant</td>
			<td></td>
			<td>&#160;for skin reaction evaluation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Lung Suction Unit</td>
			<td>Laerdal Medical, Denmark</td>
			<td>78000011</td>
			<td>NOTE.&#160; Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge&#160; (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative Pressure Instrument Seal Kit</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Negative pressure Chamber Strap&#160;</td>
			<td>Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA</td>
			<td></td>
			<td>12 inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropore Surgical tape</td>
			<td>&#160;3M</td>
			<td>1533-1</td>
			<td>2.5cm x 9.1m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap from 15ml plastic tube</td>
			<td>Sarstedt, Germany</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubigrip bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care, Sweden</td>
			<td>1443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cosmopor steril adhesive dressing</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>9008337</td>
			<td>7.2 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2ml Syringe Concentric Luer Slip&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson&#160;</td>
			<td>300185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance 23G/30mm needle</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>&#160;0030120086</td>
			<td>Autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minispin plus centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5453000011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco AIM V Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12055-091</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a suction blister protocol to study human t-cell recall responses in vivo

피부 항 원-리콜 모델 인간의 메모리 응답 비보의 연구에 대 한 수 있습니다. 피부 흡입 물집 (SB) 유도 결합 하 여,이 모델은 셀룰러 메모리 응답으로는 cytokine microenvironment에서 현장에서의 항 원 특정 T-세포 대표의 드문 인구를 내게 필요한 옵션을 제공 합니다.
이 보고서에서는 피부 리콜, SB 유도 및 항 원 특정 T-세포의 수확의 실질적인 절차를 설명합니다. 방법을 예증, 투베르쿨린 피부 검사 사용 개인,이 연구에 앞서 수술 감염 접종 균 메-게 랭에 항 원 리콜 결핵균. 마지막으로, 예제 SB 표본의 멀티 플렉스 및 흐름 cytometric 분석의 제공 됩니다, 세포는 혈액에서 분리에 비해이 샘플링 방법으로 항 원 특정 polyfunctional CD4 + T 세포 수의 높은 분수를 보여주는.
여기 설명 하는 방법을 안전 하 고 최소한 침략 적 공부를 모두 타고 난 및 적응형 면역 응답 vivo에서, 독특한 기회를 제공 합니다 이며, 셀 중재 면역과 인간의 협력 연구의 광범위 한 지역 사회에 도움이 될 수 있습니다. 메모리 응답, 백신 개발의 맥락에서.

8 건강 한 성인 자원 봉사자 (평균 나이: 30 년 범위: 26-43 년) 문서화 이전 BCG 예방 접종으로 (BCG 예방 접종에서 중간 시간: 5.5 년, 범위: 1-30 년) 포함 했다. 참가자는 2 TU PPD TST 평가 3 일에 의해 다음의 intradermally 도전 되었다. SBs는 7 일에 유도 되었고 8, 당일 수확 그리고 모든 물집 물집 흡입 챔버를 사용 하 여 10mm 구멍 직경을 제기 했다. 7 개인 2 병렬 SB inductions 뒤 같은 팔에서 동시에 분리 되 2 PPD 예방 접종을 부여 했다 (단계 1.4 프로토콜아래 여러 PPD 증언에 관한 참고를 참조 하십시오). 주변 혈액 플라스마 및 PBMCs 절연 제 7 일에 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 그려진 했다. SBs에서 플라즈마와 액체 supernatants-20 ° c.에 저장 된 신선한 SB 셀 (SBCs) nigrosine 얼룩 현미경 검사 법을 사용 하 여 계산 했다.
임상 TST 반응과 SBC 수익률 그림 1에 표시 됩니다. TST indurations의 평균 크기는 10.25 m m (범위: 0-20 m m) 그리고 물집 당 평균 휴대폰 번호 50000 (범위: 15000-210000 셀, 물집의 수: 15). 2 자원 봉사자 2 TSTs 중 고 15000 셀/물집의 해당 낮은 총 셀 수익률에 임상 응답을 했다. 셀 항복 TST의 평균 임상 응답와 관련 되었다 (Spearman의 r = 0.643, p = 0.094).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig1.jpg"> 그림 1 : 흡입 물집 세포 수확량. (한)이이 패널이 보여줍니다 대표 SBs에서 격리 nigrosine-얼룩진 세포의 현미경 7 일 게시물 TST 제기. (b)이이 패널에서는 평균 TST 단단하게 됨 (mm)와 평균 셀 생산량 (n/blister) 사이의 관계 8 BCG 예방 접종 자원 봉사자 (물집의 수 = 15). 점 들 개별 비 열 측정을 나타냅니다. 2 자원 봉사자 모두 0 m m의 TST 단단하게 됨 및 15, 000의 셀 항복 했다 2 점 겹치며 note 하시기 바랍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
흐름 cytometric SB 특성을 보여 SBCs BCG 예방 접종 30 년 전에 었 었던 43-올해-옛 자원 봉사에서 가져온 고 Mtb. 는 SBCs를 알려진된 노출 없이 단일 물집 (의 유도 따라 격리 했다 단단하게 됨: 1.4 m m/100000 SBCs). 그림 2 는 SBCs 대 PBMCs의 얼룩이 지는 세포내 cytokine의 대표 작을 보여준다.
이 자원 봉사자 CD3 + CD4 + CD8-Sbc의 분수에서에서 증가 unstimulated 세포에서 67%는 PPD 생체 외에서 restimulation 시 > 90% 반면 CD3 + CD4 + CD8-PBMCs의 일부분 남아 일정 (~ 51%, 그림 2). 이펙터 메모리 종류의 92%는 체 외에서 PPD-뿐 아니라 unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs 했다 하는 이상 (CCR7-CD45RA-, 데이터 표시 되지 않음). PPD 자극에 의해 유도 된 특정 CD3 + CD4 + CD8 세포의 전반적인 분수는 PBMCs에 비해 SBCs에서 높았다 (33.1 vs. 0.2%, unstimulated 샘플 빼고). PBMCs에서 polyfunctional PPD 특정 CD3 + CD4 + CD8 세포의 분수 모든 < 0.05%는 이었다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig2.jpg"> 그림 2 : Sbc의 대표적인 흐름 cytometry 플롯 대 PBMCs. 패널은 a 와 b 표시 대표 밀도 플롯 CD8 +와 CD4 + 인구 (a)의 unstimulated vs. PPD 자극 PBMCs 및 (c) SBCs. 패널 b 와 d 느린 PPD 자극 CD3 + CD4 + CD8-셀 (b) PBMCs에에서 얼룩이 지는 세포내 cytokine의 플롯 및 (d) SBCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig2large.jpg" target="_blank">제발 큰 보려면 여기 클릭 이 그림의 버전.</a>
예상 했던 대로, CD3 + CD4 + CD8-SBCs 주된 cytokines TNF-α와 IFN-γ와 활성화 된 vivo에서, 얼룩 upregulated cytokines (12%), 대 한 세포의 높은 비율에 의해 그림 했다. 그러나, PPD 자극에 따라 세포를 은닉 하는 cytokine 이동 쪽으로 트리플 또는 더블-양성 IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%)와 IFN-γ + TNF-α + (15%) 프로필 (그림 3b, 같은 기증자에서 PBMC 프로필 포함 된다 에에서 비교에 대 한 그림 3a). PPD 자극 이펙터 메모리 CD4 + T 세포 부분 집합에 대 한 cytokine 식 프로필 (CD3 + CD4 + CD8-CCR7-CD45RA-) CD3 + CD4 + CD8-인구 그림 2와 3 (데이터 표시 되지 않음)에 비교 했다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig3.jpg"> 그림 3: PBMCs 대 자극 하는 CD4 + PPD와 unstimulated SBCs Cytokine 프로필.  이 패널 표시 cytokine 생산에 대 한 개별 프로필 (한) CD3 + CD4 + CD8-PBMCs 세포와 (b) CD3 + CD4 + CD8-Sbc. 막대 항 원 특정 cytokine 프로필 unstimulated 셀 (흰색 막대)와 PPD (컬러 바)와 생체 외에서 자극 시의 분수를 나타냅니다.
피부 테스트 사이트에서 cytokine microenvironment에 정보의 소스로 SB 액체를 탐험, cytokine 수준 SBs 유도 7 일 게시물-TST (그림 4a)에서 수확 하는 유체에서 측정 되었다. IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 중간 레벨 339 pg/mL, 되었고 19 pg/mL, 1 pg/mL, 각각 (n = 6). 플라스마 수준은 일반적으로 매우 낮은 했다. SBs에서 고립 된 셀 프로 염증 성 cytokines 비보 전 (그림 4b)의 높은 수준의 생산. 1 자원 봉사에서 Sbc의 titrations 4 일 악성 M. 결핵 의 존재에 대 한 교양 했다 ± 헌 PBMCs. IFN-γ 수준 > 30-fold SBCs, PBMCs의 존재에 관계 없이 포함 된 문화에서 더 높은.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57554/57554fig4.jpg"> 그림 4 : SB 유체, 플라즈마, Cytokine 수준 및 Mtb -문화 supernatants 감염. (한)이이 패널 cytokine 수준을 보여줍니다 SB 유체 supernatants 및 플라즈마 6 BCG 예방 접종 자원 봉사자에서. 바 대표 중간 cytokine 수준; 오차 막대 범위를 나타냅니다. (b)이이 패널에서는 cytokine 레벨 4 병렬 600 µ l 비보 전 4 일간의 문화 1 x 106 PBMCs (검은 막대), 1.75 x 10에서에서 supernatants5 SBCs (흰색 막대), 및 1 x 106 PBMCs 아군 0.5 또는 1.75 x 10 5 SBCs (회색 막대) Mtb에 감염. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57554/57554fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

여기, 우리는 흡입 물집 피부 리콜 모델의 데모를 제공합니다. 모델에는 인간의 vivo에서 적응 면역 반응, 예를 들어 백신 개발의 맥락에서에서 연구 간단한 액세스할 수 있습니다.

인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

11.9K 조회수.  Statens Serum Institut. 여기, 우리는 흡입 물집 피부 리콜 모델의 데모를 제공합니다. 모델에는 인간의 vivo에서 적응 면역 반응, 예를 들어 백신 개발의 맥락에서에서 연구 간단한 액세스할 수 있습니다.

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Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial cells and tissue extravasation is a multistep process controlled by different adhesion molecules (homing receptors) expressed on lymphocytes and their respective ligands (addressins) displayed on endothelial cells 1 2. Even though the function of these adhesion receptors can be partially studied ex vivo, the ultimate test for their physiological relevance is to assess their role during in vivo lymphocyte adhesion and migration. Two complementary strategies have been used for this purpose: intravital microscopy (IVM) and homing experiments. Although IVM has been essential to define the precise contribution of specific adhesion receptors during the adhesion cascade in real time and in different tissues, IVM is time consuming and labor intensive, it often requires the development of sophisticated surgical techniques, it needs prior isolation of homogeneous cell populations and it permits the analysis of only one tissue/organ at any given time. By contrast, competitive homing experiments allow the direct and simultaneous comparison in the migration of two (or even more) cell subsets in the same mouse and they also permit the analysis of many tissues and of a high number of cells in the same experiment.
Here we describe the classical competitive homing protocol used to determine the advantage/disadvantage of a given cell type to home to specific tissues as compared to a control cell population. We chose to illustrate the migratory properties of gut-tropic versus non gut-tropic T cells, because the intestinal mucosa is the largest body surface in contact with the external environment and it is also the extra-lymphoid tissue with the best-defined migratory requirements. Moreover, recent work has determined that the vitamin A metabolite all-trans retinoic acid (RA) is the main molecular mechanism responsible for inducing gut-specific adhesion receptors (integrin a4b7and chemokine receptor CCR9) on lymphocytes. Thus, we can readily generate large numbers of gut-tropic and non gut-tropic lymphocytes ex vivoby activating T cells in the presence or absence of RA, respectively, which can be finally used in the competitive homing experiments described here.

Competitive homing experiments allow to directly assessing the migratory properties of two different cell populations in a single mouse. Here we illustrate this procedure by comparing the migration of ex vivo-generated gut-tropic versus non-gut tropic T cells.

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

연구

면역학 및 감염병학

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological deficiencies. GVHD is caused by mature alloreactive T cells present in the bone marrow graft that are infused into the recipient and cause damage to host organs. However, in mice, T cells must be added to the bone marrow inoculum to cause GVHD. Although extensive work has been done to characterize T cell responses post transplant, bioluminescent imaging technology is a non-invasive method to monitor T cell trafficking patterns in vivo. 
Following lethal irradiation, recipient mice are transplanted with bone marrow cells and splenocytes from donor mice. T cell subsets from L2G85.B6 (transgenic mice that constitutively express luciferase) are included in the transplant. By only transplanting certain T cell subsets, one is able to track specific T cell subsets in vivo, and based on their location, develop hypotheses regarding the role of specific T cell subsets in promoting GVHD at various time points. At predetermined intervals post transplant, recipient mice are imaged using a Xenogen IVIS CCD camera. Light intensity can be quantified using Living Image software to generate a pseudo-color image based on photon intensity (red = high intensity, violet = low intensity). 
Between 4-7 days post transplant, recipient mice begin to show clinical signs of GVHD. Cooke et al.1 developed a scoring system to quantitate disease progression based on the recipient mice fur texture, skin integrity, activity, weight loss, and posture. Mice are scored daily, and euthanized when they become moribund. Recipient mice generally become moribund 20-30 days post transplant. 
Murine models are valuable tools for studying the immunology of GVHD. Selectively transplanting particular T cell subsets allows for careful identification of the roles each subset plays. Non-invasively tracking T cell responses in vivo adds another layer of value to murine GVHD models.

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Murine bone marrow transplantation is a widely used technique to study immunological mechanisms governing graft-versus-host disease in humans. The ability to monitor T cell trafficking patterns in vivo allows for detailed analysis of the development and perpetuation of T cell responses during graft-versus-host disease.

이식 - 대 - 호스트 질병의 유도 및<em&gt; 생체 내</emMHC 검색 손쥐 모델을 사용&gt; T 셀 모니터링

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T 세포 반응의 평가를위한 형광 대상 배열의 사용<em&gt; 생체 내</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Transplantation of Tail Skin to Study Allogeneic CD4 T Cell Responses in Mice

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and host T cells, to easily monitor the graft, and to adapt the system in order to answer different immunological questions. Medawar and colleagues established allogeneic tail-skin transplantation in mice in 1955. Since then, the skin transplantation model has been continuously modified and adapted to answer specific questions. The use of tail-skin renders this model easy to score for graft rejection, requires neither extensive preparation nor deep anesthesia, is applicable to animals of all genetic background, discourages ischemic necrosis, and permits chemical and biological intervention. 
In general, both CD4+ and CD8+ allogeneic T cells are responsible for the rejection of allografts since they recognize mismatched major histocompatibility antigens from different mouse strains. Several models have been described for activating allogeneic T cells in skin-transplanted mice. The identification of major histocompatibility complex (MHC) class I and II molecules in different mouse strains including C57BL/6 mice was an important step toward understanding and studying T cell-mediated alloresponses. In the tail-skin transplantation model described here, a three-point mutation (I-Abm12) in the antigen-presenting groove of the MHC-class II (I-Ab) molecule is sufficient to induce strong allogeneic CD4+ T cell activation in C57BL/6 mice. Skin grafts from I-Abm12 mice on C57BL/6 mice are rejected within 12-15 days, while syngeneic grafts are accepted for up to 100 days. The absence of T cells (CD3-/- and Rag2-/- mice) allows skin graft acceptance up to 100 days, which can be overcome by transferring 2 x 104 wild type or transgenic T cells. Adoptively transferred T cells proliferate and produce IFN-&#947; in I-Abm12-transplanted Rag2-/- mice.

Tail-skin transplantation is a powerful model for studying T cell-dependent rejection and tolerance induction during allogeneic immune responses in mice. The advantages of this protocol are minor invasive surgery, and ease of monitoring with no need to sacrifice the recipient mouse.

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

The study of T cell responses and their consequences during allo-antigen recognition requires a model that enables one to distinguish between donor and ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

살 모 넬 라 typhimurium의 절연-대 식 세포에서 Phagosomes를 포함 하

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

예방 접종 후 기니 돼지 모델에서 측정 T 세포 응답에 최적화 된 인터페론-감마 ELISpot 분석 결과

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...