الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه قبل التحفيز ، يتم تفريق الخلايا بالتساوي ثم تحفيزها بالتساوي في التصاق الخلايا جنبا إلى جنب. ومن خلال هذا الإجراء سيكون أزوما كيمورا، وهو طالب دراسات عليا من مختبرنا. لبدء هذا الإجراء، نقل ستة ملليلترات من RPMI 1640 في أنبوب تبريدها إلى أربع درجات مئوية على الجليد.
باستخدام تبريد المليلتر ماصة نصائح، إضافة ملليغرام اثنين من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. تخلط جيدا عن طريق pipetting لطيف لجعله غشاء مصفوفة الطابق السفلي مع تركيز 0.33 ملليغرام لكل ملليلتر. بعد ذلك، استخدم ماصة لنقل مليلترين من مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخففة إلى كل بئر من لوحة ثقافة الخلايا ذات الستة بئرًا.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 60 إلى 90 دقيقة. بعد ذلك، حافظ على الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى ثلاث ساعات، حتى تصبح جاهزة للاستخدام. أولاً، pirate المتوسطة المستخدمة واستخدام ماصة لإضافة ملليلترين من 0.5 ملليمولار EDTA إلى كل بئر لغسل hPCSs مثقف في لوحة ستة بئر.
ثم، الطامح EDTA من الآبار وإضافة ملليلتر من 0.5 ملليمولار EDTA الطازجة إلى كل بئر. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد هذا، الطامح EDTA من كل بئر.
إضافة ملليلتر واحد من hPSC صيانة المتوسطة في درجة حرارة الغرفة، مع تكملة 10 ميكرومولار Y27632 إلى كل بئر. الماصات بلطف ولكن بسرعة لتفجير الخلايا المرفقة على لوحة وتفكك أي خلايا تكتل في خلايا واحدة. نقل تعليق الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر يحتوي على أربعة ملليلترات من hPSC صيانة المتوسطة تكملها 10 ميكرومولار Y27632 في البئر ومزيج عن طريق الأنابيب.
المقبل، مزيج 15 ميكرولترات من تعليق الخلية مع 15 ميكرولترات من الأزرق trypan في الأنبوب. استخدام ماصة 10 ميكرولتر لنقل 10 ميكرولترات من تعليق الخلية المخففة في شرائح عد الخلايا في مكررة. باستخدام عداد خلية تلقائي، عد رقم الخلية واحسب كثافة الخلية في تعليق الخلية.
تخصيص تعليق الخلية في أنبوب 50 ملليلتر في كثافة من واحد إلى واحد ونصف مليون خلية لكل بئر لاستخدامها. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 200 مرة G وفي درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، استخدم ماصة لpirmate supernatate و إعادة تعليق الخلايا باستخدام ملليلتر واحد من المرحلة 1A المتوسطة في البئر.
الماص بلطف تعليق الخلية ثم إضافة آخر ملليلتر من المرحلة 1A المتوسطة في البئر. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، استلهم مصفوفة غشاء الطابق السفلي المخفف من آبار لوحة ثقافة الخلية المعدة مسبقًا. على الفور ماصة تعليق في أنبوب بلطف ونقل مليلترين في كل بئر من لوحة ستة جيدا.
غطي الطبق بورق الألومنيوم لحمايته من الضوء ووضع اللوحة على مقعد نظيف في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. بعد ذلك، قم بنقل اللوحة بعناية إلى حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و جو مرطب لمدة 24 ساعة. أولا، يهز بلطف لوحة واستخدام ماصة لpirpirate المتوسطة المستخدمة.
ثم، إضافة ملليلتر اثنين من DPBS إلى كل بئر. يهز بلطف لوحة مرة أخرى وpirate DPBS المستخدمة. إضافة أربعة ملليلترات من المرحلة 1B المتوسطة، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية، إلى كل بئر.
قم بنقل اللوحة بعناية إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون والغلاف الجوي المرطب إلى الثقافة لمدة 48 ساعة. بعد ذلك، يهز بلطف لوحة ويتبخر المتوسطة المستخدمة. إضافة ملليلترين من DPBS إلى كل بئر.
كرر هذا الطموح وإضافة DPBS مرة إضافية واحدة. يهز بلطف لوحة وpirate DPBS المستخدمة. إضافة أربعة ملليلترات من المرحلة 1B المتوسطة، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية، إلى كل بئر.
قم بنقل الطبق بعناية إلى حاضنة، عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والغلاف الجوي المرطب إلى الثقافة لمدة 24 ساعة. أولا، يهز بلطف لوحة ويتبخر المتوسطة المستخدمة. إضافة ملليلترين من DPBS إلى كل بئر من لوحة ستة جيدا.
ثم، يهز بلطف لوحة ويكبر DPBS المستخدمة. إضافة أربعة ملليلتر من المرحلة الثانية المتوسطة، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية، إلى كل بئر. نقل لوحة بعناية إلى حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والغلاف الجوي المرطب إلى الثقافة لمدة أربعة أيام.
يهز بلطف لوحة ويتبخر المتوسطة المستخدمة. إضافة ملليلترين من DPBS إلى كل بئر. كرر هذه العملية من التعرق وإضافة DPPS مرة أخرى.
بعد ذلك، يهز بلطف لوحة ويتبخر DPBS المستخدمة. إضافة أربعة ملليلتر من المرحلة الثالثة المتوسطة، قبل warmed إلى 37 درجة مئوية، إلى كل بئر. نقل لوحة بعناية إلى حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والغلاف الجوي المرطب إلى الثقافة لمدة ثلاثة أيام.
في هذه الدراسة، يتم تكثيف نشر hIPSEs وتشكيل أحادية متجانسة مناسبة للتمايز. يتم فصل hIPSEs غير المتمايزة وإعادة الرسغ كخلايا مفردة في كثافات خلايا منخفضة. في غضون ساعة واحدة ، يتم إرفاق الخلايا باللوحة وتبدأ في إظهار النتوء.
في اليوم الأول ، تنتشر الخلايا وتتوزع بشكل جيد لتغطية 80 إلى 90 ٪ من مساحة السطح. في اليومين الثالث و الرابع، تشكل الخلايا ورقة أحادية الطبقات متجانسة يمكن وصفها بأنها مظهر حصى. عند هذه النقطة، توقف معظم الخلايا عن التعبير عن SOX2، وهي علامة للخلايا غير المتمايزة، وبدلاً من ذلك تعبر عن علامة إنددم نهائية، SOX17، في أكثر من 90٪ معظم الخلايا الإيجابية SOX17 تعبر عن FOXA2.
ثم تبدأ الخلايا للتعبير عن علامات غوبتوب البدائية، HNF1-بيتا وHNF4-alpha، وفي نهاية المطاف التعبير عن علامة سلف البنكرياس الخلفية، PDX1، في أكثر من 90٪ وDPX1 إيجابية التعريفي الخلية هو استنساخها في خط HIPSE آخر، 1231A3، وخط HESE، خيس-3. نتائج QRTPCR التعبير MRNA من علامات المرحلة تتفق مع المثبطة للمناعة والتعبير MRNA PDX1 واضح في المرحلة الثالثة ويزيد بشكل كبير بعد ذلك. منذ خلايا ESIPS غير متمايزة تزرع كمستعمرات، تكون الخلايا الفردية محلياً في حالة مختلفة.
يوفر هذا البروتوكول طريقة لتحفيز الخلايا بالتساوي للتمايز المنتخب.
