عزز هذا البروتوكول الأمثل توليد سلائف خلايا بيتا البنكرياسية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، والتي يمكن استخدامها للعلاج الخلوي لمرض السكري والتحقيق في الآليات الجزيئية التي تؤكد التكوين الحيوي لمرض السكري. هذه تقنية مجدية لأنها تستخدم في ثقافات أحادية الطبقة 2D. إنه سهل التطبيق ، ومتسق عبر خطوط الخلايا الجذعية متعددة التحكم والخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من المريض.
يمكن أن تنضج سلائف خلايا بيتا هذه عند زرعها في مريض السكري إلى خلايا بيتا التي تفرز الأنسولين ، ويمكن أن تعكس ارتفاع السكر في الدم. لذلك ، يمكن استخدام النسب المئوية المتزايدة لأسلاف البنكرياس التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكولنا للعلاج الخلوي لمرض السكري. يمكن استخدام هذا البروتوكول المعزز لدراسة تطور البنكرياس البشري المبكر لدى الأفراد الأصحاء وكذلك في مرضى السكري ، وهو أمر صعب بسبب نقص عينات الأنسجة.
عندما تصل الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات أو مستعمرات hPSC إلى 70 إلى 80٪ ، اغسلها مرتين باستخدام PBS الدافئ داخل غطاء زراعة الأنسجة. ثم قم بشفط المخزن المؤقت باستخدام شفاط فراغ محمول. بعد ذلك ، أضف وسيط تمايز المرحلة الأولى الذي يحتوي على CHIR-99021 إلى المستعمرات ، واحتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، استبدل الوسائط المستهلكة بوسيط تمايز المرحلة الأولى بدون CHIR-99021. بعد استنشاق الوسط المستهلك وغسل خلايا الأديم الباطن النهائية مرتين باستخدام PBS الدافئ ، قم بتدوير اللوحة لإزالة أي حطام خلوي. ثم قم بإصلاح الخلايا بإضافة 4٪ بارافورمالدهيد ، وضع اللوحة على شاكر ثنائي الأبعاد.
بعد التثبيت ، اغسل الخلايا بمحلول ملحي مخزن TRIS يحتوي على 0.5٪ توين ، وضع الطبق على شاكر. ثم قم باختراق الخلايا الثابتة عن طريق إضافة كمية سخية من PBS تحتوي على 0.5٪ Triton X-100 ووضع اللوحة مرة أخرى على شاكر. بعد ذلك ، أضف المخزن المؤقت للحجب الطازج إلى الخلايا المخترقة ، واحتضان اللوحة لمدة ساعة واحدة على شاكر.
ثم أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة إلى الخلايا المسدودة ، وضع اللوحة على شاكر عند أربع درجات مئوية مع اهتزاز لطيف. في اليوم التالي بعد استنشاق محلول الأجسام المضادة الأساسي ، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق لكل منها على شاكر. بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الثانوية.
قم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم للحماية من الضوء ، وضع اللوحة على الخلاط في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. ثم استنشاق محلول الأجسام المضادة الثانوي ، وغسل الآبار الملطخة باستخدام TBST على شاكر لمدة 10 دقائق ، مع إبقاء اللوحة مغطاة بورق. بعد ذلك ، لتلطيخ النوى ، أضف محلول Hoechst إلى الآبار وضع اللوحة على شاكر.
بعد دقيقتين إلى ثلاث دقائق ، استنشق محلول Hoechst وشطف الآبار مرتين باستخدام PBS. أخيرا ، أضف PBS إلى الخلايا الملطخة ، وقم بتصويرها باستخدام مجهر مضان مقلوب في الظلام. في اليوم الأول من المرحلة الثانية ، قم بفصل الخلايا الداخلية المشتقة من hPSC عن طريق غسلها أولا باستخدام PBS الدافئ ، ثم إضافة ملليلتر واحد من محلول الإنزيم الدافئ لكل بئر من لوحة ستة آبار.
ضع الطبق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث إلى خمس دقائق أو حتى تبدأ الخلايا في الانفصال عن بعضها البعض. افصل الصفائح المنفصلة أو أحادية الطبقة من الخلايا في الآبار ، واجمع الخلايا المنفصلة معا في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 ملليلتر باستخدام وسائط نصف المرحلة القاعدية. ثم قم بتدوير الخلايا لأسفل ، وتجاهل المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات باستخدام ملليلتر واحد من PBS المعقمة.
بعد عد الخلايا باستخدام عداد آلي ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى ، وتجاهل المادة الطافية. ثم أعد تعليق الحبيبات في الحجم المناسب من وسط التمايز في المرحلة الثانية الذي يحتوي على مثبط الصخور. قم بطلاء الخلايا المعاد تعليقها على لوحة واحدة إلى 50 صفيحة مغلفة بمصفوفة الغشاء واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد 24 ساعة ، استبدل الوسائط بوسط تمايز المرحلة الثانية بدون مثبط الصخور. في نهاية المرحلة الرابعة، افصل الخلايا كما هو موضح سابقا، واجمعها في أنبوب حجمه 15 ملليلتر. ثم قم بتدوير الخلايا ، وتجاهل المادة الطافية ، وغسل الخلايا باستخدام PBS ، وفصلها إلى خلايا مفردة.
بعد عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي ، قم بتدوير الخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من PBS المبرد. بعد ذلك ، أضف ملليلتر من الإيثانول المبرد بنسبة 80٪ مع ضبط الأنبوب على دوامة منخفضة إلى متوسطة السرعة. أغلق الغطاء بإحكام ، وضع الأنبوب مائلا قليلا على الخلاط عند أربع درجات مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بتدوير الخلايا وغسل الحبيبات باستخدام PBS لفصل أي كتل من الخلايا الثابتة. ثم قم بسد الخلايا الثابتة لمدة ساعة واحدة على الأقل في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر. بعد ذلك ، لتلطيخ علامات السلف البنكرياس ، قم بتوزيع 200،000 خلية لكل حالة بما في ذلك عناصر التحكم المناسبة في النمط المتماثل ، وضوابط الأجسام المضادة غير الملوثة ، والثانوية في لوحة سفلية 96 بئر V.
ثم قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة ، واقلب اللوحة بحركة سريعة للتخلص من المادة الطافية دون فقد الكريات. بعد ذلك ، احتضان الخلايا في الأجسام المضادة الأولية لمدة ساعتين على الأقل في درجة حرارة الغرفة على شاكر مع اهتزاز لطيف. ثم اغسل الخلايا الملطخة ثلاث مرات باستخدام TBST عن طريق سحب الأنابيب لأعلى ولأسفل في الآبار.
قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى ، وتخلص من المادة الطافية ، وأضف أجساما مضادة ثانوية إلى الخلايا. بعد حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، اغسل الخلايا الملطخة مرتين باستخدام TBST. ثم قم بتدوير اللوحة ، وجمع الخلايا الملطخة في 100 ميكرولتر من PBS في أنابيب فاكس محمية من الضوء ، وقم بتشغيل العينات على جهاز قياس التدفق الخلوي.
بالمقارنة مع الطريقة غير المحسنة ، عزز البروتوكول المحسن كفاءة تمايز السلف البنكرياسي من خلال تنظيم التعبير المشترك PDX 1 و NKX 6.1. على وجه الخصوص ، أدى تفكك خلايا الأديم الباطن وإعادة طلائها على مصفوفة غشاء جديدة ، إلى جانب مدة أطول من المرحلة الثالثة ، إلى تعزيز تعبير NKX 6.1 في أسلاف البنكرياس المشتقة من hPSC مقارنة بالبروتوكول غير المنفصل. كما زادت أسلاف البنكرياس التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول الأمثل من أعداد الخلايا الإيجابية SOX9 مقارنة بالطريقة غير المنفصلة.
علاوة على ذلك ، ولدت الطريقة المثلى أيضا نسبة أعلى من الخلايا الإيجابية التكاثرية NKX 6.1 التي شاركت في التعبير عن علامة الانتشار Ki67. من أجل تعزيز الكفاءة ، من الأهمية بمكان فصل الأديم الباطن المشتق من HbA1 ثم تمديد مدة المرحلة الثالثة من العلاج بإشارات الأميلويد FGF وتثبيط القنفذ. وقد سهل الجيل القابل للتطوير من أسلاف البنكرياس باستخدام هذا البروتوكول المعزز الدراسات حول تحسين كفاءة ونضج خلايا بيتا البنكرياسية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات وسمح بنمذجة أنواع مختلفة من مرض السكري.
