يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية المتعلقة بآليات وحيوية نقل البروتين عبر أغشية البلاستيك الكلوري، وكذلك موقع البروتينات داخل البلاستيدات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية لاستهداف البروتين الثيلاكويد هو أنه يسمح للسيطرة الكاملة على بيئة الثيلاكويد أثناء النقل، بما في ذلك درجة الحرارة، ودرجة الحرارة، والظروف الأيونية، وتركيزات السلائف. تبدأ من خلال نقع ما يقرب من 55 غراما من البازلاء في 400 ملليلتر من الماء المقطر لمدة ثلاث ساعات.
زرع البازلاء المنقوعة في صينية بلاستيكية في التربة ، مغطاة بطبقة رقيقة من الفرميكوليت ، وتنمو لمدة تسعة إلى 15 يومًا كما هو موضح في بروتوكول النص. في يوم عزل البلاستبلاست، إعداد تدرج كثافة مستمرة عن طريق الطرد المركزي خليط من 15 ملليلتر من بيركول و 15 ملليلتر من 2xGB العازلة في 15 ملليلتر بولي كربونات أنابيب أجهزة الطرد المركزي عالية السرعة في 30، 900 غم في دوار زاوية ثابتة لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية مع الفرامل قبالة. ثم حصاد ما يقرب من 25 غراما من تسعة إلى 15 يوم براعم البازلاء القديمة.
إضافتها إلى 95 ملليلتر من المخزن المؤقت البارد 1xGB في خلاط مبرد، مع شفرات شحذ. وتجانس. تصفية هذا الخليط من خلال ما لا يقل عن طبقتين من القماش الجبن، وضعت في قمع على الكلاك المبردة.
الطرد المركزي الترشيح باستخدام 15 ملليلتر البولي الطرد المركزي أنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 3، 000 gs لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية. تجاهل supernatant واستخدام فرشاة الطلاء لإعادة بلطف بيليه في ملليلتر واحد من 1xGB. بعد أن استخدام ماصة وضعية زجاجية لطبقة بعناية تعليق الشاشة على رأس التدرج Percoll.
الطرد المركزي في الدوار دلو يتأرجح في 8، 000 gs لمدة 10 دقائق في أربع درجات مئوية مع الفرامل قبالة. باستخدام ماصة الموقف مرة أخرى بعناية نقل الفرقة الخضراء السفلى التي تحتوي على chloroplasts سليمة في أنبوب جديد البولي 50 ملليلتر وإضافة 30 ملليلتر من العازلة 1xIB. الطرد المركزي الأنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 1، 800 غم لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من زان، resuspend بلطف بيليه في ملليلتر واحد من 1xIB مع فرشاة الطلاء. غسل في 30 ملليلتر من 1xIB والطرد المركزي مرة أخرى في ظل نفس الظروف. إعادة تعليق بيليه بعد الطرد المركزي النهائي في ملليلتر واحد من 1xIB.
لتحديد تركيز الكلورو فيريل، اخلط 10 ميكرولترات من رأب الكلور المُعاد إعاده بالكامل مع خمسة ملليلترات من الأسيتون بنسبة 80٪. قم بالتصفية من خلال ورقة فلتر سميكة 180 ميكرومتر بحجم 11 ميكرومتر ثم حدد تركيز الكلوروفير بواسطة مقياس الطيف. تخفيف خليط الكلوروبلاست إلى مليغرام واحد لكل ملليلتر باستخدام 1xIB الباردة.
لبدء عزل thylakoids عندما استخراج stromal ليست ضرورية، مثل cpTat النقل، والبلاستيدات الكلورية سليمة في 1.5 ملليلتر أنابيب في دوار دلو يتأرجح في 1، 000 غم في أربع درجات مئوية لمدة ست دقائق. بعد ذلك، والتخلص من افرط و resuspend بيليه في العازلة تحلل تحلل هابية الطنين لتحقيق واحد ملليغرام لكل ملليلتر مع ميكروبيبيت. احتضان على الجليد في الظلام مع خلط عرضية لمدة 10 دقائق.
لاستعادة ثيلوفويد، جهاز طرد مركزي في دوار دلو يتأرجح في 3، 200 غرام في أربع درجات مئوية لمدة ثماني دقائق. غسل thylokoids مرتين عن طريق resuspending بيليه مع ملليلتر واحد إلى اثنين من العازلة تحلل ثم الطرد المركزي في ظل نفس الظروف. بعد الطرد المركزي النهائي، resuspend بيليه، في ملليلتر واحد من العازلة 1xIB وتحديد تركيز الكلوروفير في thylokoids معزولة باستخدام مقياس الطيفي كما ثبت سابقا.
للمسارات التي تتطلب استخراج السترومال الانتعاش مثل CPSec1 وCPSRP eliquate 600 microliters من الكلوروبلاست المعزولة في الدوار دلو يتأرجح والطرد المركزي في 1، 000 غم لمدة ست دقائق في أربع درجات مئوية. بالنسبة للتحلل من البلاستيك، نعلق بيليه مع 600 ميكرولترات من عازلة التحلل الهابوينك. احتضان على الجليد في الظلام لمدة 10 دقائق مع خلط عرضية.
ثم الطرد المركزي الأنابيب في الدوار دلو يتأرجح في 3، 200 غم لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية. لحفظ ستروما، نقل الأخضر الفاتح إلى صفراء فائقة إلى أنبوب جديد جهاز طرد مركزي صغير وإضافة حجم مساو من 2x الخام السترومال العازلة. لغسل ثيلوفويدات، إضافة مجلدين من العازلة التحلل والطرد المركزي في 3، 200 gs لمدة ثماني دقائق في أربع درجات مئوية.
Resuspend بيليه في 1xIB لتحقيق تركيز الكلورو واحد ملليغرام لكل ملليلتر وتوضع جانبا على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق في المقايسات النقل. إزالة الأغشية المتبقية من ستروما الخام عن طريق الطرد المركزي stroma الخام المخفف في دوار زاوية ثابتة في 42، 000 gs لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. ثم جمع 95٪ من حجم من كل أنبوب مع التأكد من عدم إزعاج بيليه الأخضر الأصفر صغيرة، مع الإشارة إلى حجم مأخوذة من كل أنبوب.
لإعداد استخراج السترومال المركزة، تجمع اكثف التي تم جمعها. ثم استخدام أربعة ملليلتر 30 كيلودالتون الجزيئية الوزن قطع التركيز التركيز على استخراج خمس أضعاف. لمقايسة cpTat نقل في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد مزيج thylokoids المعزولة إلى تركيز الكلورو النهائي من 0.33 ملليغرام لكل ملليلتر، خمسة ملليمولار ATP أعدت في 1xIB، وثمانية DTT millimolar أعدت في 1xIB.
لبدء النقل، أدخل البروتين تحتية إلى مزيج النقل. إجراء رد الفعل عن طريق إلقاء الضوء على التعليق مع 80 إلى 100 ميكروينشتاين في الثانية الواحدة من الإشعاع النشط الضوئي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوقف رد فعل النقل، تمييع تعليق ثمانية أضعاف مع الجليد البارد 1xIB.
جهاز طرد مركزي في 3،200 gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لاستعادة thylokoids. بعد التخلص من المابير، resuspend بيليه في 120 ميكرولترات من الجليد البارد 1xIB. لمقايسة مسارات CPSec1 أو PSRP مزيج ما يلي في أنبوب 1.5 ملليلتر على الجليد.
Thylakoids إلى تركيز الكلوروفير النهائي من 0.33 ملليغرام لكل ملليلتر، 0.83 ملليغرام لكل ملليلتر كلوروفير مكافئات من مستخلص السترومال، وخمسة المليمولار ATP أعدت في 1xIB. جلب رد فعل يصل إلى حجم المطلوب مع الجليد البارد 1xIB واحتضان على الجليد لمدة 10 دقائق. لبدء النقل إدخال 10٪ حجم من قبل حجم البروتين الركيزة لهذا المزيج النقل.
تضيء مع 80 إلى 100 ميكروينشتاينس في المتر المربع في الثانية من الإشعاع النشط الضوئي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لوقف رد الفعل، وتمييع تعليق ثمانية أضعاف مع الجليد البارد 1xIB. جهاز طرد مركزي في 3، 200gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية.
بعد التخلص من المابير، resuspend بيليه في 120 ميكرولترات من الجليد البارد 1xIB. لإزالة الركيزة المتبقية التي لم يتم نقلها، هضم البروتين الخارجي بإضافة ستة ميكرولترات من اثنين ملليغرام لكل ملليلتر ثيرملليسين و 10 ملليمولار كلوريد الكالسيوم في 1xIB. احتضان رد فعل البروتياز هذا على الجليد لمدة 40 دقيقة.
إخماد البروتياز من خلال مضاعفة حجم مع 25 ملليمولار EDTA في 1xIB. جهاز طرد مركزي في 3،200 gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية لاستعادة thylokoids. بعد إزالة supernatant، تعافى ريسوسيبوسيد thylokoids في 120 ميكرولترات من خمسة EDTA الوليمولار في 1xIB، ونقلها إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر.
بعد الطرد المركزي مرة أخرى في 3، 200 gs في جهاز طرد مركزي صغير لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية، والتخلص من افرط وإعادة تعليق بيليه في حجم مناسب من عازلة عينة laemmli، تستكمل مع 10 ملليمولار EDTA. ضع العينات في حمام مائي مغلي لمدة 10 دقائق. تابع لتحليل العينات حسب صفحة SDS.
نقل iOE17 البروتين من خلال المسار cpTat أدى إلى تحول حجم من اثنين إلى ثلاثة كيلودالتون بين الركيزة المقدمة والشكل ناضجة معالجتها. ويرجع ذلك إلى انشقاق الببتيد إشارة المحطة n تشير إلى نقل cpTat ناجحة. العلاج thermolysin يترك فقط نقل بنجاح وبالتالي proteus مقاومة الفرقة ناضجة.
وأدى نقل السلائف OE33 عبر مسار CPSec1 إلى تحول في الحجم في الركيزة الناضجة، وحماية البروتيوس للركيزة المنقولة. أدى إدخال سلائف LHCP في الغشاء الثيريلوكيد عبر مسار cpSRP ، الذي تم تقييمه من خلال هضم الثيرموسين إلى تحول في الحجم من 1.5 إلى كيلودالتونين. وأشار هذا الإدراج الغشاء الناجح, كما يحمي الغشاء غير نظيفة من ناضجة LHCP المنتج من تحلل proteolysis كاملة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل thylokoids ومقايسة المرونة من خلال cpTat الطاقة تعتمد ، cpSec 1 ومسارات cpSRP. مرة واحدة يتقن هذه التقنية يمكن القيام به في ثلاث إلى أربع ساعات عندما يؤديها بشكل صحيح. على الرغم من أن لا يتضح في هذا الفيديو ونحن عموما إبقاء الأضواء العلوية قبالة في المختبر عند عزل والعمل مع البلاستيك الضوئي النشطة والثيلاكويدات.
أثناء محاولة هذا الإجراء من المهم الحفاظ على الكلوروبلاست المعزولة والثيلاكويدات عند أربع درجات مئوية. تذكر أن تُعيد عملية البلاستيدات بالكلورات برفق في البداية. تجنب إزعاج تدرج Procoll بعد الخطوة الأولى من التفكير.
بالإضافة إلى ذلك، يمكن إعداد عينة الإدخال في النسبة المئوية بالتوازي مع تفاعلات النقل وتشغيلها على نفس الجل لتقدير النقل الركيزة. لا تنسوا أن العمل مع الركائز المشعة يتطلب التعامل مع الضمير والمعدات الشخصية المناسبة. بعد تطورها ، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال استهداف البروتين لاستكشاف حيوية ، والحركيات والآليات الفريدة التي تحكم نقل البروتين عبر الأغشية الثايلاكويد.
