يسبب التطويل الخاطئ للرودودبسين انحطاط الشبكية التدريجي الذي يسمى التهاب الشبكية الصباغي. في حين أن طريقة التصوير التقليدية لديها قدرة محدودة على قياس نقل الرودوبسين ، فإن هذا الفحص القائم على الصور المطور حديثًا يسمح بالفحص عالي الإنتاجية ، مما يزيل الإيجابيات الكاذبة. هذه التقنية تسمح لتقييم سريع للدوائية المخدرات.
في عين إنقاذ للطي من rhodopsin المسببة للأمراض ، وبالتالي تسريع إمكانية علاج مرض لا يمكن علاجه بهدوء والعمى ، التهاب الأذن الصباغي. توطين الخلوية من البروتين غشاء مهم جدا لوظيفته. ويمكن تعديل هذه الطريقة بسهولة وتطبيقها لتحديد كمية نقل أي بروتين غشاء آخر من الفائدة.
تأكد من إعداد خريطة لوحة وإضافة بلطف وpirate السائل من كل بئر من لوحة، للحفاظ على عدد الخلايا والحالة المناعية الظروف متسقة بين الخلايا. وهذا سوف تسفر عن عامل Z عالية، ونتائج موثوق بها. للبدء، بذور 5000 الخلايا في بئر في أسود مسورة، أسفل واضحة، بولي lysine تعامل 384-جيدا لوحة.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية مع خمسة في المئة ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات لخلايا نعلق على الجزء السفلي من لوحة. بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 10 ميكروليترز لكل بئر من حلول العمل 5X ، وفقًا لخريطة لوحة محددة مسبقًا مثل تلك الموضحة هنا. الآن، إضافة 10 ميكرولترات لكل بئر من 2٪ DMSO إلى العمودين 22 و 24.
أيضا، إضافة 10 ميكرولترات لكل بئر من 25 ميكرومولار 9-cis-شبكية العين إلى العمود 23 في غرفة مظلمة تحت الضوء الأحمر خافت. عند الانتهاء من تحميل جميع مركبات الاختبار المختلفة، قم بتغطية اللوحة بورق الألومنيوم، واحتضانها عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. أخرج اللوح 384-جيدا في غرفة مظلمة مع ضوء أحمر خافت.
هنا، باستخدام 8 قنوات- التعرق، متصلة بزجاجة جمع فراغ، لpirate لطيف المتوسطة من آبار لوحة. بعد ذلك ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 20 ميكرولترات لكل بئر من 4٪ Paraformaldehyde الطازجة إلى لوحة 384-well بأكملها ، وإصلاح الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد التثبيت، ضع اللوحة في الضوء العادي.
هناك، استخدام 8-قناة- التعرق، لpirpirate Paraformaldehyde في كل بئر، واستخدام ماصة متعددة القنوات لإضافة 50 ميكرولترات لكل بئر من برنامج تلفزيوني. التعرق واستبدال برنامج تلفزيوني لما مجموعه ثلاث دورات الغسيل. ثم، إضافة 20 ميكرولترات لكل بئر من مصل الماعز 5٪ إلى كل بئر، واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد الحضانة، الطامح الآبار، وإضافة 15 ميكرولترات من 20 ميكروغرام لكل ملليلتر B630 المضادة للرودpsين، في مصل الماعز 1٪ إلى الآبار في الصفوف A إلى O.Next، إضافة 15 ميكرولترات لكل بئر من مصل الماعز 1٪ إلى الصف P لمجموعة التحكم في الأجسام المضادة الثانوية فقط. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة، أو في أربع درجات مئوية خلال الليل. ثم، تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم لتجنب photobleaching من الفلوروفوريس.
بعد ذلك ، اغسل اللوحة ثلاث مرات مع 50 ميكرولترات لكل بئر من PBS. بعد الغسيل الأخير ، يُفطن برنامج تلفزيوني ، وأضيف 15 ميكرولتر لكل بئر من خمسة ميكروجرام لكل ملليلتر من الأجسام المضادة IgG المضادة للماعز Cy3-مترافق. تغطية لوحة مع رقائق الألومنيوم، واحتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد الحضانة، اغسل الطبق ثلاث مرات. ثم، إضافة 50 ميكرولتررس في بئر من برنامج تلفزيوني، تحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من وصمة عار Hoechst في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وأخيرا، ختم لوحة البئر مع فيلم شفاف، وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، وتخزينها في أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
إزالة احباط ووضع لوحة عينة في صورة عالية المحتوى، مع A1 وضع في الزاوية اليسرى العليا من لوحة. بعد ذلك، افتح برنامج الحصول على الصور لإعداد المعلمات للحصول على الصور. افتح إطار إعداد اللوحة وإنشاء إعداد جديد أو قم بتحميل ملف إعداد موجود.
حدد الهدف 20X وإعداد البيكسل binning كاثنين، وبالتالي فإن حجم بكسل معايرة هو 0.80 في 0.80 ميكرون. ثم، تعيين خطوط المسح الضوئي كـ 2000، وحجم الصورة 1000 في 1000 بكسل لكل موقع. بعد ذلك، حدد نوع اللوحة ليتم تصويرها.
استخدم المعلومات التي توفرها الشركة المصنعة لملء أبعاد اللوحة. الآن، حدد الآبار التي سيتم تصويرها مع أربعة مواقع ليتم تصويرها في البئر. تجنب الجانب من البئر، والتي لمست من قبل نصائح الطموح.
للتصوير، حدد أشعة الليزر الإثارة ك 405 و 488 و 461 نانومتر. ثم حدد مرشحات الانبعاثات للقنوات DAPI و FITC و تكساس ريد. تحسين قوة الليزر والمكاسب من كل قناة، لضمان، وآبار التحكم الإيجابية ليست مشبعة.
حدد جيدا إلى التركيز بشكل جيد للتركيز التلقائي. ثم حدد البئر الأولي الذي سيتم الحصول عليه، ثم قم بتعيين التركيز التلقائي للموقع لكافة المواقع. أيضاً، حدد أربعة متوسطات لكل خط لكل قناة، وقم بتحسين قيمة إزاحة Z لكل قناة.
التحقق من صحة، أن كل شيء تم إعداده بشكل صحيح، من خلال اختبار أول اثنين إلى ثلاثة آبار في زوايا اللوحة، للتأكد من الصور هي على التركيز على جميع الآبار اختبارها. بعد ذلك ، تحقق ، أن الصور من جميع المواقع في كل بئر لديها خلايا مع أكثر من 40 ٪ التقاء. وأخيرا، تحقق، أن كثافة الفلوريسين في جميع القنوات كلها حوالي نصف المشبعة في 100٪ السيطرة الآبار.
ثم، حفظ طريقة الحصول على الصورة، وتشغيل لوحة بأكملها. شاهد المصوّر حتى ينتهي من التقاط الصور من العمود الأول من اللوحة للتحقق من جودة الصورة قبل مغادرة المصور. عند الانتهاء، قم بإزالة اللوحة وتخزينها عند أربع درجات مئوية للاستخدام في المستقبل.
سحب بيانات الصورة، وذلك باستخدام برنامج تحليل الصور عالية المحتوى. حدد أحد آبار التحكم بنسبة 100٪ في العمود 23 لإعداد المعلمات. أولاً، حدد الخلية الطول الموجي المتعددة كطريقة التحليل، وابدأ في تكوين الإعدادات الإضافية.
تعريف النوى باستخدام الصور من قناة DAPI. معاينة، للتأكد من الأشكال النوى المحددة في اختيار جيد يناسب بشكل جيد مع الصور النووية. بعد ذلك، حدد شكل الخلية في قناة FITC، حيث يتم تصوير Rhodopsin Venus.
لتحقيق ذلك ، قم بإعداد أقطار الحد الأدنى والحد الأقصى لكل خلية ، والحد الأدنى من كثافة الفلوروس فوق الخلفية ، وكذلك الحد الأدنى من المساحة لكل خلية. الآن، تحديد مناطق بقعة سطح الخلية rhodopsin في قناة تكساس الأحمر، من خلال إعداد أقطار الحد الأدنى والحد الأقصى من شكل الخلية، وكثافة الفلوريوم صغيرة فوق الخلفية، فضلا عن الحد الأدنى من مساحة كل خلية ملطخة. اختبار الخوارزمية الحالية في خمسة آبار لتحديد ما إذا كانت الإعدادات هي الأمثل.
ثم احفظ الإعدادات وقم بإغلاق إطار التكوين. تشغيل جميع الآبار مع طريقة تحليل محسنة. عند الانتهاء، قم بتصدير رقم الكائن كرقم الخلية السليم.
تصدير متوسط كثافة قناة FITC كما كثافة الزهرة رودpsين، وتصدير متوسط كثافة القناة الحمراء تكساس كما شده رودpsسين على سطح الخلية. استخدم برنامج جدول البيانات لإنشاء خريطة حرارية بلونين لكل معلمة. ترتيب اسم خطوط الخلية على المحور س، والمركبات على المحور ص.
هنا، صورنا من P23H rhodopsin فينوس علاج خلايا U2OS، معربا عن الفلورانس فينوس باللون الأخضر، وسطح الخلية مناعية تلطيخ باللون الأحمر. أما الخلايا التي عولجت مع DMSO أو خمسة ميكرومولار 9-cis-retinal. يُظهر مقايسة نقل الرودودبسين، التي تقارن كمية الرودودبسين في الخلية بأكملها في ظل ظروف مختلفة، انتعاشًا كبيرًا في خط الخلية المتحولة P23H، عند معالجتها بـ 9-cis-retinal.
بالإضافة إلى ذلك ، فإن شدة الرودوبيسين على سطح الخلية ، ونسبة وصمة رودوبسين على سطح الخلية إلى شدة الزهرة الرودوبين في الخلية بأكملها ، ليست أقل بكثير بالنسبة لـ P23H المتحول ، مقارنة بالنمط البري rhodopsin المعالج بـ DMSO. خريطة الحرارة هي وسيلة فعالة لمقارنة متوسط كمية rhodopsin والتعريب لكل خلية عبر المسوخ متعددة. هنا ، يتم سرد عناصر تحكم النمط البري وستة طفرات رودوبسين أفقيًا ، ويتم مقارنة آثار العلاجات المركبة عموديًا.
في الاتفاق مع الدراسات السابقة، وكثافة الرودوبين على سطح الخلية ونسبة وصمة رودوبسين على سطح الخلية إلى شدة الزهرة رودوبسين هي أقل بالنسبة للطفرات الستة مقارنة مع النمط البري تعامل مع DMSO. وزادت المركبات واحد واثنين وستة وتسعة بشكل كبير نسبة وصمة رودوبسين على سطح الخلية إلى كثافة الزهرة الرودوبين في T4R، P23H، D190N، وP267L طفرات rhodopsin، مما يشير إلى أن هذه المركبات إنقاذ نقل هذه المسوخ rhodopsin إلى غشاء البلازما. ضع في اعتبارك أن الخلايا يجب أن تكون بين 50 و 70٪ من الالتقاء قبل التثبيت ، لأن هذا أمر بالغ الأهمية لتحليل الصور.
أيضا، أظهرنا صورا لآبار عبر اللوحة بأكملها. تأكد من أن الصور في التركيز ، وأن الفلوريسنس ، التي لا تخرج ، لديها كل قيمة العتبة لأي قناة. ما يصل إلى تحديد المركبات، التي إنقاذ نقل rhodopsin misfolded، يمكننا التحقق من صحة هذه العملية، ثم تمرير فعالية هذه المركبات في الجسم الحي، وذلك باستخدام نموذج الماوس التعبير عن متحولة رودوpsين P23H.
هذه الطريقة تسمح لنا لتحديد كمية البروتين الغشاء، وتوطينه. ولذلك، بل هو أداة عظيمة لخطأ الجزئي بدأت على البروتين غشاء في مساعدة حفظ وتدهور. وفيما يتعلق بالمكافات شبه العسكرية، كما هو الحال في هذه التجربة، فإن له إجراءات تنطوي على معالجة هذا الكاشف.
سيتم ذلك تحت غطاء محرك السيارة. وينبغي التخلص من النفايات بما فيها هذا الكاشف كما ينبغي التخلص منها كمادة كيميائية خطرة.
