この方法は、葉膜を横切るタンパク質輸送のメカニズムとエネルギー、およびプラスティド内のタンパク質の位置に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。チラコイドタンパク質ターゲティングのこの技術の主な利点は、温度、pH、イオン条件、前駆体濃度を含む輸送中のチラコイドの環境を完全に制御できることです。約55グラムのエンドウ豆を400ミリリットルの蒸留水に3時間浸すことから始めます。
浸したエンドウ豆を土壌中のプラスチックトレイにまき、薄い層の朱色で覆われ、テキストプロトコルに記載されているように9〜15日間成長します。葉芽体分離の日には、15ミリリットルのポリカーボネート高速遠心管に15ミリリットルのパーコールと15ミリリットルの2xGBバッファーの混合物を遠心分離して連続的な密度勾配を調製し、ブレーキをオフにして摂氏4度で30分間固定角度ローターで900 gs。その後、約25グラムの9〜15日齢のエンドウ豆の芽を収穫します。
冷やしたブレンダーで95ミリリットルの冷たい1xGBバッファーに、シャープブレードを加えます。そして均質化する。この混合物を少なくとも2層のチーズクロスでろ過し、冷やしたビーカーの上に漏斗に入れます。
3,000 gsのスイングバケットローターに15ミリリットルのポリカーボネート遠心チューブを使用して濾液を摂氏4度で5分間遠心する。上清を捨て、ペイントブラシを使用してペレットを1ミリリットル(1xGB)にそっと再懸濁します。その後、ガラスポスチャピペットを使用して、Percoll勾配の上に画面サスペンションを慎重に重ねるようにします。
ブレーキをオフにして摂氏4度で10分間、8,000 gsのスイングバケットローターで遠心分離します。ポスチャピペットを使用して再び慎重に新しい50ミリリットルポリカーボネートチューブに無傷の葉緑のバンドを入れ、1xIBバッファーの30ミリリットルを追加します。1,800 gsのスイングバケットローターのチューブを摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を捨て、1xIBの1ミリリットルのペレットをペイントブラシで静かに再懸濁します。同じ条件下で再び1xIBと遠心分離機の30ミリリットルで洗浄します。最終遠心分離後にペレットを1ミリリットル1xIBで再懸濁する。
クロロフィル濃度を決定するには、完全に再懸濁した葉芽細胞の10マイクロリットルを80%アセトンの5ミリリットルと混合する。180マイクロメートルの厚さのフィルターペーパーを通して11マイクロメートルの細孔サイズをフィルターし、分光光度計によってクロロフィル濃度を決定する。冷たい1xIBを使用して、1ミリリットル当たり1ミリグラムに葉ロプラスト混合物を希釈します。
cpTat輸送などの間質抽出物が必要ない場合にチラコイドの単離を開始するには、1.5ミリリットルチューブの内の遠心分離の無傷葉芽を1,000 gsで摂氏4度で6分間回転させる。その後、上清を捨て、低張性リシスバッファー内のペレットを再懸濁して、マイクロピペットで1ミリリットル当たり1ミリグラムを達成する。暗闇の中で氷の上でインキュベートし、時折10分間混合します。
チロコイドを回復するために、3、200 gsのスイングバケットローターで8分間摂氏4度で遠心分離機。シロコイドを2回洗浄し、ペレットを1~2ミリリットルのリシスバッファーで再懸濁し、同じ条件で遠心分離します。最終遠心分離後、ペレットを1ミリリットルの1ミリリットルの1xIBバッファーで再懸濁し、先に実証したように分光光度計を用いて分離チロコイドにおけるクロロフィル濃度を決定する。
CPSec1およびCPSRPエリクエータートのような間質抽出回復を必要とする経路については、1,000 gsのスイングバケットローターおよび遠心分離機で6分間摂氏4度で分離された葉芽の600マイクロリットル。葉芽細胞のリシスについては、600マイクロリットルの低張性ライシスバッファーでペレットを懸濁します。時折混合して暗闇の中で氷の上で10分間インキュベートします。
その後、3、200 gsで4°Cで8分間スイングバケットローターでチューブを遠心分離します。ストロマを保存するには、新しいマイクロ遠心分離管に黄色の上清にライトグリーンを転送し、2倍の粗い間質バッファーの等しい量を追加します。チロコイドを洗うには、3,200 gsで摂氏4度で8分間、2巻のリシスバッファーと遠心分離機を加えます。
1xIBでペレットを再懸濁して1ミリリットル当たり1ミリグラムのクロロフィル濃度を達成し、後で輸送アッセイで使用するために氷の上に置きます。42,000 gsの固定角度ローターで希釈した粗質を摂氏4度で30分間遠心して、粗野なストロマから残留膜を取り除きます。その後、各チューブから取られたボリュームに注意しながら、小さな黄色の緑色のペレットを乱さないように各チューブからボリュームの95%を収集します。
濃縮された間質抽出物を調製するために、集めた上清をプールする。その後、4ミリリットル30キロリットルの分子量カットオフ濃縮器を使用して、抽出物を5倍に濃縮する。氷上の1.5ミリリットルチューブ内のcpTat輸送をアッセイするために、分離されたチロコイドを1ミリリットル当たり0.33ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度に混合し、1xIBで調製した5ミリモルATP、および1xIBで調製した8ミリモルDTTを混合する。
輸送を開始するために、輸送ミックスに基質タンパク質を導入する。1平方メートル当たり80~100マイクロインスタインを光合成活性放射線で10分間室温で10分間照射して、反応を行います。輸送反応を停止するには、懸濁液を氷冷1xIBで8倍に希釈する。
3,200 gsの遠心分離機をマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間、チロコイドを回収する。上清を捨て、120マイクロリットルの氷冷1xIBでペレットを再懸濁する。CPSec1またはPSRP経路をアッセイするには、氷上の1.5ミリリットルチューブに以下を混合します。
チラコイドは、1ミリリットル当たり0.33ミリグラムの最終的なクロロフィル濃度、1ミリリットルクロロフィル相当の1ミリグラムの間質抽出物、および1xIBで調製された5ミリモルATPに対する。氷冷1xIBで目的の体積まで反応を持ち込み、氷の上で10分間インキュベートします。輸送を開始するために、この輸送ミックスに基質タンパク質の体積によって10%体積を導入する。
1平方メートルあたり80~100マイクロアインシュタインで光合成活性放射を室温で10分間照射します。反応を止めるには、懸濁液を氷冷1xIBで8倍に希釈する。マイクロ遠心分離機で3,200gsの遠心分離機を摂氏4度で5分間。
上清を捨て、120マイクロリットルの氷冷1xIBでペレットを再懸濁する。輸送されていない残留基質を除去するために、1ミリリットルのサーモリシン当たり2ミリグラム6マイクロリットル、1xIBに10ミリモルの塩化カルシウムを加えて外部タンパク質を消化する。このプロテアーゼ反応を氷上で40分間インキュベートします。
1xIBで25ミリモルEDTAで容量を倍増させることでプロテアーゼをクエンチする。3,200 gsの遠心分離機をマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間、チロコイドを回収する。上清を除去した後、回収したチロコイドを1xIBで5ミリモルEDTAの120マイクロリットルで回収し、新しい1.5ミリリットルチューブに移す。
3,200 gsで再びマイクロ遠心分離機で摂氏4度で5分間遠心分離した後、上清を捨て、ペレットを適切な量のレムリサンプルバッファーに再懸濁させ、10ミリモルEDTAを補う。熱湯浴にサンプルを10分間入れます。SDS ページでサンプルの分析に進みます。
cpTat経路を介したiOE17タンパク質の輸送は、導入された基質と成熟した処理された形態との間に2〜3キロダルトンのサイズシフトをもたらした。これは、cpTat輸送の成功を示すn末端シグナルペプチドの切断によるものである。サーモリシン処理は、正常に輸送され、したがってプロテウス耐性成熟バンドのみを残します。
CPSec1経路を介したOE33前駆体の輸送は、成熟した基質におけるサイズシフト、および輸送された基質のプロテウス保護をもたらした。cpSRP経路を介してチロコイド膜にLHCP前駆体を挿入し、サーリシン消化を通じて評価し、1.5〜2キロダルトンのサイズシフトにつながった。これは、膜が完全なタンパク質分解から成熟したLHCP分解産物の未切断を保護するので、膜挿入に成功したことを示した。
このビデオを見た後、エネルギー依存性cpTat、cpSec 1およびcpSRP経路を介してチロコイドとアッセイトランポーティを分離する方法をよく理解する必要があります。この技術を習得したら、3~4時間で適切に実行できます。このビデオでは説明されていませんが、光合成活性葉皮とチラシを分離して作業する際には、一般的にラボのオーバーヘッドライトを消しておいてください。
この手順を試みている間、孤立した葉蓋とチラコイドを摂氏4度に保つことが重要です。最初は葉葉芽細胞をやさしく再中断してください。最初の中心のステップの後にプロコール勾配を乱さないようにします。
さらに、パーセント入力サンプルは、輸送反応と並行して調製し、基質輸送を推定するために同じゲル上で実行することができる。放射性基質を扱うには、良心的な取り扱いと適切なPPEが必要であることを忘れないでください。開発後、この技術は、タンパク質ターゲティングの分野の研究者が、チラシ骨膜を横切るタンパク質輸送を支配するエネルギッシュ、キネティクス、ユニークなメカニズムを探求する道を開きました。
